專利名稱：基于供體器官衍生的分析物測(cè)定或檢測(cè)在異體移植后供體器官損壞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測(cè)定或檢測(cè)在異體移植后生物學(xué)液體中存在的指示供體器官損壞的供體器官衍生的分析物的方法。
背景技術(shù)：
目前在世界范圍內(nèi)存在用于同種異體移植的供體器官(例如肝臟，腎臟和心臟)的短缺并且已經(jīng)有人建議和證明通過在常位的移植外科手術(shù)之前使用動(dòng)物器官能夠克服該問題，盡管是暫時(shí)的。Chari，R．S．，等人(“新英國(guó)醫(yī)學(xué)雜志”(1994)；第33卷，第4期，第234-237頁(yè))用體外豬肝臟灌注液，隨后用常位的肝臟移植治療肝臟的衰退。將一個(gè)病人穩(wěn)定10天，隨后成功地進(jìn)行了常位的肝臟移植。但是，以前的器官種間移植(異體移植)嘗試還沒有成功，因?yàn)樵谥踩胧荏w后幾個(gè)小時(shí)內(nèi)已知稱為超急性排斥的現(xiàn)象使剛移植的器官被宿主的免疫系統(tǒng)制服并且被排斥。最近在分子遺傳學(xué)領(lǐng)域內(nèi)取得的進(jìn)展已經(jīng)能夠研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(主要是豬)，其器官進(jìn)行了遺傳工程操作，當(dāng)轉(zhuǎn)移到不同的種(即人／非人靈長(zhǎng)類)時(shí)幾乎沒有免疫原性(“移植信息”(1995)；第5卷，第9期)。在該報(bào)告中，假定通過在轉(zhuǎn)基因器官中表達(dá)人“衰退加速因子”基因獲得了免疫忍受性，所述因子具有抑制宿主對(duì)補(bǔ)體成分(例如，Cb3復(fù)合物)的激活作用，并且因此使超急性排斥降低到最小。但是，正如種內(nèi)器官移植(同種異體移植)的情況，異種移植排斥仍然是爭(zhēng)論，移植醫(yī)師必需與這種爭(zhēng)論斗爭(zhēng)和進(jìn)一步被明顯的事實(shí)困擾來自于不同種類的組織存在于移植受體。
常規(guī)的肝功能測(cè)試不能區(qū)分供體和受體(例如豬和人)器官衍生的分析物。例如，血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)／天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的測(cè)定沒有辨認(rèn)出人和豬酶，由此提供的識(shí)別移植后酶的來源的嘗試是無效的。類似的情形存在于腎臟異體移植分析。事實(shí)上，目前沒有通常被接受的腎臟完整性的蛋白質(zhì)標(biāo)記。
谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)包括主要由α(αGST)，μ(μGST)，π(πGST)和θ-類(θGST)同種型(由等電點(diǎn)定義的)組成的蛋白質(zhì)的多個(gè)基因家族，并且主要借助于與谷胱甘肽的共軛，負(fù)責(zé)各種各樣的生物異源物質(zhì)的脫毒(Beckett，G．J．和Hayes，J．D．“臨床化學(xué)進(jìn)展”(1993)；第30期，281-380頁(yè))。在人中，αGST在肝臟的均一分布以及其相對(duì)高的肝臟水平和短的血漿半衰期(約1小時(shí))是指作為移植后肝臟情形和藥物誘導(dǎo)的肝臟損壞的指示劑該酶比氨基轉(zhuǎn)移酶更靈敏。
EP-A 0640145公開了幫助在肝臟移植受體中早期診斷排斥的方法，該方法包括在血漿或血清轉(zhuǎn)氨酶先前沒有或有變化的情況下，測(cè)定受體的血漿或血清αGST的增加。
π谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶定位于肝臟內(nèi)的膽管上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，并且被認(rèn)為僅以同種二聚體形式存在。這種異種的肝臟內(nèi)GST分布暗示不同的同工酶在不同的肝臟區(qū)域具有獨(dú)特的體內(nèi)功能，因此可以總結(jié)出血漿或膽的GST水平的測(cè)量有助于對(duì)于個(gè)體的肝臟情形的監(jiān)控。在腎臟組織中也存在類似的獨(dú)特分布，其中αGST定位于腎單位的近端的小管區(qū)域，πGST定位于遠(yuǎn)端小管區(qū)域(Campbell，J．A．H．等人，“癌癥”(Philadelphia)(1991)；第67期，1608-1613頁(yè))。在最近的報(bào)告中，有人建議，由于各自的組織損害的位點(diǎn)特異性特性，同時(shí)檢測(cè)人尿中α／πGST可用于分別區(qū)分環(huán)孢菌素A腎中毒性和移植排斥(Sundberg，A．G．M．等人，“腎單位”(1994)第67期，308-316頁(yè))。
因此，需要作為檢測(cè)移植器官損壞的手段的區(qū)別宿主和移植物衍生的分析物的方法，或的確用于區(qū)分宿主和／或移植器官損壞的方法。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了測(cè)定或檢測(cè)在異體移植后生物學(xué)液體中存在的指示供體器官損壞的供體器官衍生的分析物的方法，由此能夠識(shí)別所述受體中異種移植器官的損壞，所述方法包括由抗體捕獲所述分析物和直接或間接測(cè)定供體器官衍生的分析物，所述抗體是a)特異于供體器官衍生的分析物；或b)能夠與所述供體器官衍生的分析物發(fā)生交叉反應(yīng)。
因此，本發(fā)明的方法能夠區(qū)分宿主衍生的和供體衍生的分析物，從而能夠指示異種移植情形和可能的排斥，以致于盡可能快地可以進(jìn)行正確的治療，這樣受體的生物學(xué)液體中供體器官衍生的分析物被識(shí)別，如在下文中更詳細(xì)證明的情況。
本文中所述的生物學(xué)液體是指例如體液如膽汁，血漿，血清和尿以及組織支撐介質(zhì)和灌注液。本文中所述的生物學(xué)液體通常也涉及基質(zhì)。
本文中所述的供體器官衍生的是指器官本身和組織和細(xì)胞，所述組織和細(xì)胞是器官的組成部分和是由其衍生的。
同樣本文中所述的供體材料是指器官本身和組織和細(xì)胞，所述組織和細(xì)胞是器官的組成部分和是由其衍生的。
因此，作為具體的例子，供體材料可以是肝臟，肝臟的一部分例如肝葉或肝細(xì)胞。通常，對(duì)于肝細(xì)胞的情況，使用肝細(xì)胞藥筒。
通常，受體是人類或非人靈長(zhǎng)類。
因此，優(yōu)選的是供體材料是來自于非人靈長(zhǎng)類或動(dòng)物例如豬，所述動(dòng)物具有與人類相似的生理學(xué)和生物化學(xué)特性。
供體動(dòng)物可以是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
異體移植可以是體內(nèi)或體外。
被移植的器官合適的是心臟，腎臟或肝臟。
優(yōu)選的是，供體器官衍生的分析物是蛋白質(zhì)，更具體的是酶。
優(yōu)選的是，供體器官衍生的分析物將是供體特異性的。在存在相應(yīng)的受體分析物的情況下，優(yōu)選的是受體分析物與所述的供體器官衍生的分析物具有低度的同源性。但是，供體器官衍生的分析物可以與相應(yīng)的受體分析物具有高度的同源性(例如同源性大于80％)，并且根據(jù)下文描述的本發(fā)明，供體器官衍生的分析物也是可檢測(cè)的。
優(yōu)選的酶是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，更具體地說αGST。
再者，優(yōu)選的是，通過免疫測(cè)定方法對(duì)捕獲的供體器官衍生的分析物進(jìn)行測(cè)定。合適的免疫測(cè)定方法包括酶免疫測(cè)定。
因此，對(duì)于人生物學(xué)液體中的豬αGST，采用直接或間接結(jié)合到固相的IgG(抗-豬αGST)，或另一種可選的方法，采用顯示交叉反應(yīng)性的IgG(抗-人αGST)能夠捕獲豬αGST。
我們已經(jīng)制備了兔多克隆IgG(抗-豬αGST)，它具有與豬αGST高度特異性。對(duì)于例如在高濃度的人αGST存在下，該抗體也顯示與人αGST的小程度(約5-10％)的交叉反應(yīng)性的情況下，那么可以單獨(dú)地測(cè)定人αGST，并且按照下文描述，正確計(jì)算豬αGST的量。
我們已經(jīng)識(shí)別了與豬αGST具有幾乎100％交叉反應(yīng)性的單克隆抗-人αGST，如下文實(shí)施例3描述的。
酶免疫測(cè)定可以是一種夾層方法或半競(jìng)爭(zhēng)性酶免疫測(cè)定，如下文實(shí)施例1和2分別描述的。
在本發(fā)明的再一方面，在異體移植之前測(cè)試供體材料的存活力。
因此，本發(fā)明通過測(cè)定生物學(xué)液體中供體器官衍生的分析物也可以測(cè)試供體材料的存活力，通過應(yīng)用上文定義的方法，所述生物學(xué)液體灌注該供體材料。
在本發(fā)明所述方面，根據(jù)除本發(fā)明以外的已知的方法能夠檢測(cè)分析物。例如，如果器官衍生的分析物是酶，那么可以利用基于酶底物的應(yīng)用的酶測(cè)定檢測(cè)所述的器官衍生的分析物。
本發(fā)明也提供了含有一個(gè)或多個(gè)成分的測(cè)試試劑盒或試劑包，用于實(shí)施上文描述的本發(fā)明的方法。附圖簡(jiǎn)述在附圖中

圖1是實(shí)施例1的夾層酶免疫測(cè)定的示意圖；圖2是在450／630nm處的吸收值相對(duì)于在實(shí)施例1的豬αGST的夾層免疫測(cè)量的酶免疫測(cè)定中的αGST濃度(微克／升)的繪制圖；圖3是實(shí)施例2的半競(jìng)爭(zhēng)性酶免疫測(cè)定的示意圖；
圖4是在450／630nm處的吸收值相對(duì)于在實(shí)施例1的豬αGST的競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)量的酶免疫測(cè)定中的αGST濃度(微克／升)的繪制圖；圖5是人和豬αGST的SDS-PAGE分析圖；圖6是利用IgG(抗-人αGST)和山羊IgG(抗-兔αGST)-HRP共軛物進(jìn)行的人和豬αGST的免疫印跡分析圖；圖7是利用IgG(抗-豬αGST)和山羊IgG(抗-兔αGST)-HRP共軛物進(jìn)行的人和豬αGST的免疫印跡分析圖；和圖8是利用IgG(抗-人αGST)和山羊IgG(抗-鼠αGST)-HRP共軛物進(jìn)行的人和豬αGST的免疫印跡分析圖。
實(shí)施本發(fā)明的模式根據(jù)下面的實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。
預(yù)備實(shí)施例A豬αGST的純化通過親和層析和層析聚焦(pH9．5-6．0)從豬肝臟純化αGST。精確的詳細(xì)的純化方案如下a．利用Waring(Waring是商標(biāo)名)搗碎機(jī)，以一份肝臟3份緩沖液的比例，將30克的豬肝臟在勻漿緩沖液中勻漿2分鐘。勻漿緩沖液具有下面的組分10mM Tris-HCl250mM蔗糖5mM EDTA pH 7．82微克／毫升亮抑蛋白酶肽2微克／毫升胃酶抑制劑b．以10000g將肝臟勻漿液離心60分鐘。
c．然后將上清液載樣到先前于10mM Tris pH9．1中平衡的谷胱甘肽(GSH)-Sepharose親和柱上。重新應(yīng)用平衡緩沖液洗脫未結(jié)合的蛋白質(zhì)。最后利用含有5mM的GST的50mM Tris pH9．1從親和柱洗脫結(jié)合的GST。
d．然后將洗脫的物質(zhì)在25mM乙醇胺pH9．5中透析，并且應(yīng)用到層析聚焦柱(由Pharmacia供應(yīng)的PBE94)。洗脫緩沖液是根據(jù)制造商的說明制備的Polybuffer 96(Polybuffer 96是商標(biāo)名)。
預(yù)備實(shí)施例B抗體生產(chǎn)和純化按照下文給定的時(shí)間表將純化的豬αGST從皮下(s．c．)注射到新西蘭白兔，并且評(píng)估血清的抗αGST反應(yīng)性。一旦通過半定量點(diǎn)印跡分析測(cè)定IgG(抗-豬αGST)效價(jià)足夠高時(shí)，給該動(dòng)物放血，收集血清。通過蛋白質(zhì)A親和層析從兔血清純化總IgG，用于包被微滴板(半競(jìng)爭(zhēng)性EIA-實(shí)施例2)和生物素化(夾層EIA-實(shí)施例1)。從荷蘭Nijmegen的醫(yī)科大學(xué)獲得單克隆IgG(抗-人αGST)，如腹水液并且在使用之前不進(jìn)一步純化。免疫接種時(shí)間表(常規(guī))第1天從兔的耳朵放出5毫升的預(yù)血清的血樣，然后將0．5毫升的豬αGST抗原(100微克)與等體積的弗氏完全佐劑混合。將抗原和佐劑勻漿化以確保獲得良好的乳化液。然后將該混合液皮下注射到兔背的多個(gè)位點(diǎn)，所述兔子先前已經(jīng)剃掉了毛。
第28天從兔的耳朵放出5毫升血清的血樣，然后將0．5毫升的抗原(100微克)與等體積的弗氏完全佐劑混合。將抗原和佐劑勻漿化以確保獲得良好的乳化液。然后將該混合液皮下注射到兔背的多個(gè)位點(diǎn)。
第42天從兔子的耳朵獲取10毫升血液的測(cè)試血液。
第56天按照第28天時(shí)的描述，給兔子進(jìn)行第二次加強(qiáng)。
第70天從兔子的耳朵獲取10毫升血液的測(cè)試血樣。當(dāng)效價(jià)足夠高時(shí)，殺死兔子，收集盡可能多的血液。
預(yù)備實(shí)施例C免疫印跡法借助于下面的免疫印跡組合分別檢測(cè)用于下面實(shí)施例的所有多克隆和單克隆IgGs與人和豬αGST的反應(yīng)性和交叉反應(yīng)性(a)將兔子IgG(抗-人αGST)用于探測(cè)含有免疫固定化的人和豬αGST的硝酸纖維素膜。
(b)將兔子IgG(抗-豬αGST)用于探測(cè)含有免疫固定化的人和豬αGST的硝酸纖維素膜。
(c)將鼠IgG(抗-人αGST)用于探測(cè)含有免疫固定化的人和豬αGST的硝酸纖維素膜。
用于免疫印跡檢測(cè)的方法如下1．將人和豬αGST(0．5微克／泳道)在15％SDS-PAGE上電泳，并且包括分子量標(biāo)記物。
2．在電泳之后，切下聚丙烯酰胺凝膠，將一半凝膠進(jìn)行蛋白質(zhì)染色，而其余的用于電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜。
3．在電泳轉(zhuǎn)移之后，在含有0．05％(w／v)吐溫-20(PBST)封閉緩沖液的磷酸緩沖的鹽水中用5％(w／v)Marvel(Marvel是商標(biāo)名)封閉硝酸纖維素膜1小時(shí)。
4．然后制備下面的溶液(i)溶于PBST的1％(w／v)Marvel中的兔子IgG(抗-人αGST)。
(ii)溶于PBST的1％(w／v)Marvel中的兔子IgG(抗-豬αGST)。
(iii)溶于PBST的1％(w／v)Marvel中的鼠IgG(抗-人αGST)。并且一旦潷去封閉緩沖液，將該溶液加入到所述膜。
5．然后在PBST中清洗硝酸纖維素膜(2次，每次5分鐘)。
6．然后在溶于PBST的1％(w／v)Marvel中制備抗兔子IgG-HRP共軛物(1／1000)并且加入到上述4(i)和(ii)。還制備抗鼠IgG-HRP共軛物(1／1000)并且加入到上述4(iii)。從Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室有限公司獲得用于免疫檢測(cè)的抗-種類(兔子／鼠)共軛物。
7．在用抗-種類共軛物保溫1小時(shí)之后，潷去反應(yīng)劑并且如上述5所述清洗膜。
8．然后制備二氨基聯(lián)苯胺底物并且加入到所述膜。在硝酸纖維素膜上的棕色沉淀指示陽(yáng)性反應(yīng)。
預(yù)備實(shí)施例D豬αGST-辣根過氧化物酶(HRP)共軛物的合成利用硫醚共軛方法合成αGST-HRP共軛物。利用SMCC(琥珀酰亞胺4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸鹽)將反應(yīng)性馬來酰亞胺基團(tuán)導(dǎo)入到αGST分子并且將掩飾的巰基基團(tuán)連接到HRP(Duncan，R．J．S．，等人(1983)；“生物化學(xué)分析”132期，68-73頁(yè))。在脫掩飾步驟以產(chǎn)生反應(yīng)性巰基基團(tuán)之后，將馬來酰亞胺激活的αGST和HRP-SH-起混合并且允許反應(yīng)4．5小時(shí)。將由硫醚共價(jià)鍵形成的最后的αGST-HRP共軛物置于50％(v／v)甘油并且儲(chǔ)存于-20℃，以用于實(shí)施例2的半競(jìng)爭(zhēng)性EIA。
預(yù)備實(shí)施例EIgG(抗-豬αGST)的生物素化通過在堿性條件下，將純化的多克隆IgG(抗-豬αGST)偶合到N-羥基琥珀酰亞胺-生物素(NHS-生物素)制備生物素化的IgG(抗-豬αGST)，其中多克隆IgG(抗-豬αGST)是先前通過用純化的αGST免疫接種兔子產(chǎn)生的(如在預(yù)備實(shí)施例B中描述的)。然后通過廣泛的透析去除未反應(yīng)的NHS-生物素并且將生物素化的IgG等份并且冷凍儲(chǔ)存于-20℃，直到需要使用時(shí)。
實(shí)施例1夾層酶免疫測(cè)定所使用的程序圖解描述于附圖1。
a．用鼠單克隆IgG(抗-人αGST)(參照預(yù)備實(shí)施例B)包被NuncMaxisorp(Nunc Maxisorp是商品名稱)微滴板，所述單克隆抗體借助于山羊F(ab)2片段(抗-鼠IgG)固定。所述抗體包被方法具有確定Mab結(jié)合位點(diǎn)的位置的作用并且也通過將吸附降低到最小-誘導(dǎo)捕獲抗體的變性而改善了測(cè)定的靈敏性。用蛋白質(zhì)／蔗糖溶液封閉微滴板。
b．從如預(yù)備實(shí)施例A中描述的，在死亡后立即獲得的并且儲(chǔ)存于2-8℃或-20℃的肝臟純化的豬αGST用作為測(cè)定試驗(yàn)的校正器。
c．將生物素化的IgG(抗-豬αGST)共軛物用于輔助捕獲的／固定化的αGST的檢測(cè)。
d．然后結(jié)合使用四甲基聯(lián)苯胺底物(TMB)，將抗生蛋白鏈菌素-辣根過氧化物酶(HRP)共軛物用于檢測(cè)完整的抗原夾層復(fù)合物。
e．通過加入1N硫酸終止酶反應(yīng)，利用630nn作為參照波長(zhǎng)在450nm處測(cè)定吸收值。顏色強(qiáng)度與αGST濃度成正比例，在繪制A450／630nm相對(duì)于濃度(微克／升)圖之后，測(cè)定未知樣品的濃度(參見附圖2)?？倻y(cè)試時(shí)間低于3．5小時(shí)。
實(shí)施例2半競(jìng)爭(zhēng)性酶免疫測(cè)定所使用的程序圖解描述于附圖3。
a．在本例子中，用借助于蛋白質(zhì)A固定的多克隆IgG(抗-豬αGST)包被Nunc Maxisorp微滴板，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)多克隆IgG的直接包被不能促進(jìn)αGST的捕獲，可能是由于結(jié)合到微滴板上的IgG的變性。
b．將用HRP標(biāo)記的αGST用作為本例子的共軛物，并且隨后加入到微孔中的未標(biāo)記的校正器／樣品。以這種方式，在HRP-標(biāo)記的和未標(biāo)記的αGST之間設(shè)置競(jìng)爭(zhēng)型反應(yīng)。
c．在合適的保溫期間通常60分鐘之后，清洗微滴板并且加入TMB底物。
d．通過加入1N硫酸終止酶反應(yīng)，利用630nm作為參照波長(zhǎng)在450nm處測(cè)定吸收值。顏色強(qiáng)度與豬αGST濃度成反比，在繪制A450／630nm相對(duì)于濃度(微克／升)圖之后，獲得了對(duì)未知樣品的定量測(cè)定(參見附圖4)。
實(shí)施例3免疫測(cè)定反應(yīng)劑的純度的評(píng)估根據(jù)在預(yù)備實(shí)施例C中描述的程序進(jìn)行免疫印跡法。結(jié)果描述于附圖5-8。
附圖5-8泳道的要點(diǎn)泳道1分子量標(biāo)記物。
泳道2人αGST(0．5微克)泳道3豬αGST(0．5微克)附圖5描述了在免疫接種兔子之前的人和豬αGST的純度(由各種情況下的單個(gè)譜帶指示的)并且證實(shí)了沒有任何其它的人或豬衍生的蛋白質(zhì)存在，所述蛋白質(zhì)可能引起降低的測(cè)定特異性?？贵w反應(yīng)性的免疫印跡分析顯示IgG(抗-人αGST)與人αGST具有高度特異性，并且沒有顯示與豬αGST具有顯著的交叉反應(yīng)性(附圖6)，正如相對(duì)于豬αGST的弱信號(hào)強(qiáng)度，人αGST具有強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度指示的。根據(jù)豬αGST(αGST)p在人αGST(αGST)h-特異性酶免疫測(cè)定中沒有顯示反應(yīng)性支持了該結(jié)論，所述人αGST(αGST)h-特異性酶免疫測(cè)定是由Biotrin InternationalLimited-Mount Merrion，County Dublin，Ireland出售的名稱為HEPKIT。結(jié)果顯示于表1，它代表了在Biotrin HEPKIT中αGSTp的反應(yīng)性的評(píng)估。顯然當(dāng)在HEPKIT中分析αGSTp時(shí)沒有出現(xiàn)交叉反應(yīng)性。
表1(αGST)h(微克／升)A450／630nm0．00 0．0691．25 0．1562．50 0．3325．00 0．62710．0 1．08820．0 1．49540．0 1．762PC 0．839(6．9微克／升)(αGST)p(微克／升) A450／630nm8 0．012400．010200 0．0121000 0．014PC=陽(yáng)性對(duì)照。
該事實(shí)的意義是極重要的，因?yàn)橐馕吨甩罣ST定量的酶免疫測(cè)定與人αGST檢測(cè)具有特異性。因此，可以特異性地檢測(cè)存在于樣品中的任何人αGST，沒有來自豬抗原的交叉污染，所述樣品中的豬αGST也可以被測(cè)定。在人αGST酶免疫測(cè)定中沒有交叉反應(yīng)性以及在IgG(抗-豬αGST)和人αGST之間顯示有約5-10％的交叉反應(yīng)性(附圖7)的結(jié)果，如由相對(duì)于豬αGST的強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度，人αGST具有弱信號(hào)強(qiáng)度指示的，意味著可以使用在HEPKIT酶免疫測(cè)定中人αGST和在豬(αGST酶免疫測(cè)定中豬αGST的同時(shí)定量測(cè)定以校正豬αGST免疫測(cè)定中人αGST的分配。
例如，如果樣品給出下列讀數(shù)測(cè)定αGST(微克／升)豬EIA(豬αGST)10000Hepkit EIA(人αGST)1000那么在豬EIA中確保人αGST的約7％的交叉反應(yīng)性意味著人αGST給豬αGST的讀數(shù)提供了10010×7=70]]>微克／升。
因此，存在10000-70=9930微克／升的豬αGST。
此外，如上文提到的，在附圖8中明顯地顯示鼠IgG(抗-人αGST)和豬αGST之間的廣泛的交叉反應(yīng)性，如由相應(yīng)的譜帶／信號(hào)的相當(dāng)?shù)膹?qiáng)度指示的。這種現(xiàn)象的優(yōu)點(diǎn)是將實(shí)施例1的用于豬αGST的夾層免疫測(cè)定的該抗體用作為“捕獲”或包被平板的抗體。
實(shí)施例4測(cè)定特異性由于實(shí)施例1和2的測(cè)定的主要用于檢測(cè)非豬生物學(xué)液體中豬αGST，因此利用存在于下列基質(zhì)中的豬αGST評(píng)估測(cè)定的靈敏性和特異性是必要的-人尿-人血清-人血漿-人膽汁-組織支撐介質(zhì)為了完成所述分析，將豬αGST固定到所有上述基質(zhì)并且隨后在實(shí)施例1和2的免疫測(cè)定中進(jìn)行測(cè)試。除了定量的αGST檢測(cè)，還評(píng)估測(cè)試的線性度(平行論)作為測(cè)試靈敏度。再者，測(cè)試特異性有助于僅檢測(cè)豬αGST和任何人αGST在免疫測(cè)定中不引起顯著的干擾也是必要的。為了到達(dá)該目的，通過用不同量的人αGST摻入含有豬αGST的樣品以評(píng)估潛在的交叉反應(yīng)性，調(diào)查人αGST的檢測(cè)反應(yīng)性。假定兩個(gè)同工酶之間存在這樣的顯著的序列同源性(這不是一個(gè)經(jīng)常出現(xiàn)的問題)，僅可以通過廣泛地分析與人αGST具有潛在的交叉反應(yīng)性的抗血清(抗-豬αGST)來克服。
正如通過夾層和半競(jìng)爭(zhēng)性酶免疫測(cè)定確定的，在各種樣品的基質(zhì)中豬αGST定量測(cè)定的結(jié)果顯示于表2。
表2在夾層和半競(jìng)爭(zhēng)性豬αGST測(cè)定中固定的樣品的回收

要點(diǎn)1．Sand夾層酶免疫測(cè)定。
2．Comp半競(jìng)爭(zhēng)性酶免疫測(cè)定。
3．用于競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定的稀釋1／5的樣品范圍(0-1000微克／升)，然后進(jìn)一步稀釋到1／100，用于夾層測(cè)試(范圍0-40微克／升)。
4．MEM和TC-100組織支撐介質(zhì)。
從表2可以清楚地看到，在所有測(cè)試的基質(zhì)中可以定量回收豬αGST。顯然，分別在人血漿和尿中可檢測(cè)到αGST是必要的，以便有助于異種移植的肝臟和腎臟的情形，的確就是這種情況。但是，可以注意到血漿基質(zhì)似乎與半競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定方式不相容，可能是由于IgG與固定化的蛋白質(zhì)A相互作用，導(dǎo)致異常的讀數(shù)。除此以外，所有的其它液體顯示與兩種測(cè)定方式具有相容性。特別有趣的是能夠在組織支撐介質(zhì)中檢測(cè)到豬αGST，這應(yīng)該有助于對(duì)移植前異種移植進(jìn)行評(píng)估或分離的豬肝細(xì)胞的存活力的分析(存在于藥筒)，因?yàn)檫@些系統(tǒng)通常保持于常規(guī)的支撐介質(zhì)中。另外，所述基質(zhì)／樣品的相容性應(yīng)該大大地有助于檢測(cè)在用于維持體外供體器官的培養(yǎng)基中的αGST，從而將供體器官(例如肝臟)在肉體外保持與培養(yǎng)基接觸。
實(shí)施例5在豬αGST夾層酶免疫測(cè)定中人αGST干擾的評(píng)估對(duì)實(shí)施例1的豬αGST夾層酶免疫測(cè)定中人αGST的干擾進(jìn)行評(píng)估。如由增加的吸收值測(cè)定的，在微滴板孔的濃度低于25微克／升時(shí)沒有證明干擾(以1／5稀釋的樣品稀釋液中相等于125微克／升的樣品濃度)。結(jié)果顯示于表3。表3

要點(diǎn)αGSTp -豬αGSTαGSTh -人αGST顯示于表3的結(jié)果證明用于檢測(cè)豬αGST的免疫測(cè)定的特異性。從這些數(shù)據(jù)可以證明，甚至在樣品濃度高達(dá)125微克／升(25微克／升×5)時(shí)人αGST沒有干擾所述的酶免疫測(cè)定，這分別代表15和6倍的人血清和尿的αGST的正常的上限值。在人αGST的更高水平時(shí)(＞250微克／升；50微克／升×5)，顯然出現(xiàn)了某些干擾，已經(jīng)計(jì)算出在人αGST和IgG(抗-豬αGST)之間約5-10％的交叉反應(yīng)性。但是，在定量免疫測(cè)定中共測(cè)定人和豬αGST的水平時(shí)應(yīng)該計(jì)算出所存在的人αGST的精確的量，因此在對(duì)人生物學(xué)液體中定量測(cè)定豬αGST期間應(yīng)該考慮。
進(jìn)一步應(yīng)該注意到，本發(fā)明的免疫測(cè)定也可用于檢測(cè)豬衍生的生物學(xué)液體中豬αGST，如涉及豬或豬器官的體外或體內(nèi)毒理研究的情況。該結(jié)果是有重要意義的，因?yàn)橐阎i和人生理學(xué)／生物化學(xué)是非常類似的，因此豬經(jīng)常用作為預(yù)測(cè)對(duì)人的藥物毒性的動(dòng)物模型。
權(quán)利要求
1．測(cè)定或檢測(cè)在異體移植后生物學(xué)液體中存在的指示供體器官損壞的供體器官衍生的分析物的方法，由此能夠識(shí)別受體中異種移植器官的損壞，所述方法包括由抗體捕獲所述分析物和直接或間接測(cè)定供體器官衍生的分析物，所述抗體是a)特異于供體器官衍生的分析物；或b)能夠與所述供體器官衍生的分析物發(fā)生交叉反應(yīng)。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中受體是人。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中受體是非人靈長(zhǎng)類。
4．根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其中供體器官來源于豬。
5．根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其中供體器官是腎臟。
6．根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其中供體器官是肝臟。
7．根據(jù)前面任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中供體器官衍生的分析物是蛋白質(zhì)。
8．根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中供體器官衍生的分析物是酶。
9．根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中酶是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)。
10．根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中酶是αGST。
11．根據(jù)前面任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，當(dāng)從屬于權(quán)利要求4時(shí)，其中抗體是抗-豬αGST。
12．根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)所述的方法，當(dāng)從屬于權(quán)利要求2時(shí)，其中抗體是抗-人αGST，它基本上顯示與豬αGST具有100％的交叉反應(yīng)性。
13．根據(jù)前面任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中在異體移植之前測(cè)試供體材料的存活力。
14．含有一個(gè)或多個(gè)成份的測(cè)試試劑盒或試劑包，用于實(shí)施權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)所述的方法。
全文摘要
本發(fā)明提供了測(cè)定或檢測(cè)在異體移植后生物學(xué)液體中存在的指示供體器官損壞的供體器官衍生的分析物的方法,由此能夠識(shí)別所述受體中異種移植器官的損壞,所述方法包括由抗體捕獲所述分析物和直接或間接測(cè)定供體器官衍生的分析物,所述抗體是:a)特異于供體器官衍生的分析物;或b)能夠與所述供體器官衍生的分析物發(fā)生交叉反應(yīng)。因此,本發(fā)明的方法能夠區(qū)分宿主衍生的和供體衍生的分析物,從而能夠指示異種移植情形和可能的排斥,以致于當(dāng)供體器官衍生的分析物被識(shí)別時(shí)便盡可能快地進(jìn)行正確的治療,該方法適用于體內(nèi)和體外異體移植。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1205081SQ95197996
公開日1999年1月13日 申請(qǐng)日期1995年12月8日 優(yōu)先權(quán)日1995年12月8日
發(fā)明者約翰·馬丁·多伊爾, 科馬克·杰勒德·基爾蒂 申請(qǐng)人:拜奧特恩知識(shí)產(chǎn)權(quán)有限公司