一種鉑類抗腫瘤前體藥物，其納米水凝膠藥物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鉑類抗腫瘤前體藥物，其納米水凝膠藥物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]由于癌癥對(duì)人類生命健康的極大威脅，抗癌藥物的研究一直廣受關(guān)注。順鉑也稱順式二氯二氨合鈾(Ci splat in, Pt (NH3)2Cl2)，是一種非細(xì)胞周期特異性的抗癌藥物，具有細(xì)胞毒性，能與DNA雙螺旋上的鳥嘌呤的N7氮原子結(jié)合，形成穩(wěn)定的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，從而破壞DNA的復(fù)制功能，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。自從1967年人們發(fā)現(xiàn)順鉑的抗癌活性以來，鉑類金屬抗癌藥物的研究和應(yīng)用得到了極大的發(fā)展，除順鉑外，還有一系列具有類似結(jié)構(gòu)和功能的順鉑衍生物，如卡鉑、奧沙利鉑、賽特鉑、奧馬鉑、異丙鉑、樂鉑、庚鉑以及其他含有單個(gè)或多個(gè)鉑原子的的抗癌藥物。這種鉑類藥物具有抗癌譜廣，作用強(qiáng)且無交叉耐藥性，尤其對(duì)于睪丸癌、卵巢癌有很好的療效。然而，鉑類藥物存在毒副作用大，溶解性差，在人體內(nèi)易于和血漿蛋白結(jié)合，尤其容易受到含巰基蛋白質(zhì)(血清蛋白質(zhì)等)的攻擊，從而失去抗癌活性，所以臨床效果往往有限。近年來研究發(fā)現(xiàn)四價(jià)鉑配合物(Pt(IV))相對(duì)于常用的二價(jià)鉑配合物(Pt(II))而言，由于在垂直的軸向上增加了兩個(gè)配體，形成八面體結(jié)構(gòu)，因而具有較低的反應(yīng)活性和毒副作用。而在藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，由于細(xì)胞內(nèi)部的還原性環(huán)境，使得迅速轉(zhuǎn)化為具有細(xì)胞毒性的Pt(II)結(jié)構(gòu)，從而具有針對(duì)性的對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用。然而，四價(jià)鉑配合物(Pt(IV))作為小分子藥物，在人體內(nèi)同樣存在循環(huán)時(shí)間短，代謝速度快，靶向性差的特點(diǎn)，很難在腫瘤部位得到有效的富集，將其運(yùn)輸至腫瘤組織部位仍然是一個(gè)很大的挑戰(zhàn)。
[0003]本發(fā)明針對(duì)鉑類藥物的以上特點(diǎn)，對(duì)四價(jià)鉑配合物(Pt(IV))軸向上的羥基進(jìn)行了修飾，從而第一次得到帶有兩個(gè)雙鍵的新型結(jié)構(gòu)，該鉑類抗腫瘤前體藥物在有機(jī)溶劑中可以自身聚合，也可以與其他單體共聚，形成粒徑均一的納米粒子。通過利用生物相容性的穩(wěn)定劑對(duì)粒子表面進(jìn)行簡(jiǎn)單的修飾，使其能夠在生物體內(nèi)保持良好的穩(wěn)定性，增加長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)部還原性的條件下可使得微球降解，從而釋放出鉑類藥物。另一方面，穩(wěn)定劑的外部也可以修飾相應(yīng)的靶向分子(如葉酸、環(huán)RGD肽、轉(zhuǎn)鐵蛋白等)，從而使其在腫瘤部位得到有效的富集。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種鉑類抗腫瘤前體藥物，其納米水凝膠微球及其制備方法;同時(shí)，提供上述納米水凝膠在腫瘤治療中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明提供的鉑類抗腫瘤前體藥物的制備方法，具體步驟如下:將二價(jià)的鉑類藥物與雙氧水在避光條件下65-75°C (優(yōu)選70°C)反應(yīng)10-12h，得到軸向雙羥基配位的四價(jià)鉑配合物Pt(IV)-(OH)2,產(chǎn)物通過旋蒸除去部分溶劑，過濾后真空烘干，再與含有雙鍵的酸酐或羧酸在避光條件下55-65°C (優(yōu)選60°C)反應(yīng)12?24h，得到軸向具有兩個(gè)雙鍵的鉑(IV)類抗腫瘤前體藥物。
[0006]其中，所述二價(jià)的鉑類藥物可以是順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、賽特鉑、奧馬鉑、異丙鉑、樂鉑或庚鉑等。
[0007]其中，所述的酸酐可以為甲基丙烯酸酐、丙烯酸酐、馬來酸酐；其中羧酸可以為丙烯酸、甲基丙烯酸、馬來酸或富馬酸。
[0008]其中，所述鉑類藥物與雙氧水的重量比例為1:1?1:10 ,Pt(IV)-(OH)2與酸酐或羧酸的重量比例為1:1?1:5。
[0009]本發(fā)明提供的鉑類前體藥物的水凝膠微球的制備方法，具體步驟為:在有機(jī)溶劑中加入親水性單體，以上述鉑類抗腫瘤藥物前藥作為交聯(lián)劑，在引發(fā)劑的存在下，加熱進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)溫度為50?120°C;用蒸餾沉淀法除去一半溶劑，回流溶劑反應(yīng)時(shí)間為0.2?4h;再用離心法除去剩下溶劑和未反應(yīng)單體，用乙醇和去離子水反復(fù)洗滌3 — 5次;然后在真空烘箱內(nèi)30?55 °C干燥5?24h，即得到納米水凝膠粒子。
[0010]本發(fā)明中，所述有機(jī)溶劑為單一的乙腈、乙醇、水、四氫呋喃、甲基異丁基酮或甲苯等溶劑;或者為乙腈一乙醇、乙腈一四氫呋喃、乙腈一/K、乙腈一甲苯、乙醇一甲苯或甲基異丁基酮一乙腈等的混合溶劑。
[0011]本發(fā)明中，所述的親水性單體為甲基丙烯酸(MAA)、丙烯酸(AA)、甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)、丙烯酰胺(AM)、N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)或N-2-羥丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)等單體。
[0012]本發(fā)明中，所述引發(fā)劑為偶氮二異丁腈(AIBN)或過氧化二苯甲酰(BPO)等。
[0013]本發(fā)明中，所述單體在單一或混合溶劑中的濃度為0.5wt%?20.0wt%。
[0014]本發(fā)明中，所述單體與前體藥物的重量比例為10:1-0:1，優(yōu)選兩者比例為10:1?
0.5:1 ο
[0015]本發(fā)明所制備的上述納米水凝膠粒子的粒徑為50 — 950nm，多分散度為0.04 —
0.16ο
[0016]上述制備的納米水凝膠，可以進(jìn)一步與雙親性的穩(wěn)定劑相互組裝，從而提高其在生理環(huán)境中的穩(wěn)定性和體內(nèi)的長(zhǎng)循環(huán)過程。具體操作步驟如下:
將上述制得的納米水凝膠粒子分散在少量去離子水中，磁力攪拌下緩慢滴入溶解有穩(wěn)定劑的水溶液中，并超聲分散15-20min，這一過程中穩(wěn)定劑的疏水部分通過非共價(jià)疏水作用與納米粒子交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合，親水部分伸展在納米粒子外部，從而實(shí)現(xiàn)良好的穩(wěn)定作用。
[0017]所述穩(wěn)定劑可以是TPGS1000、F127、PVA、PLGA-PEG、DSPE-PEG 等。
[0018]本發(fā)明制得的上述納米水凝膠作為納米藥物，可對(duì)體內(nèi)的腫瘤組織進(jìn)行有效的殺傷。其特點(diǎn)在于，納米藥物在正常血液和組織循環(huán)中能夠保持藥物良好的藥物密封作用，從而使藥物不會(huì)釋放出來傷害正常的組織和細(xì)胞，通過高通透性和滯留效應(yīng)(EPR effect)富集在腫瘤組織后，納米粒子被腫瘤細(xì)胞吞噬，細(xì)胞內(nèi)的還原性環(huán)境使得順鉑藥物得以快速的釋放出來，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞有針對(duì)性的殺傷作用。
[0019]本發(fā)明中，降解的測(cè)試條件為:在25mL的單口燒瓶里加入5mg的納米水凝膠粒子，分別加入10 mL的三種緩沖溶液中(磷酸鹽緩沖溶液pH=7.4,6.0，醋酸鹽緩沖溶液pH=5.0，然后加入不同濃度的谷胱甘肽、半胱氨酸或抗壞血酸，放入恒溫?fù)u床(200rpm搖速，37.5°C)勻速振蕩。并在不同時(shí)間取點(diǎn)測(cè)試分散液的濁度變化。
[0020]釋藥的條件為:將10mg載藥納米水凝膠粒子分散在10 mL的兩種緩沖溶液中(磷酸鹽緩沖溶液，pH=7.4;醋酸鹽緩沖溶液，pH=5.0)，超聲分散均勻，然后分為5份，每份2 mL，將一份凝膠溶液移入透析袋中(透析分子量Mn=HOOO)，再放入80 mL的含不同濃度的谷胱甘肽的緩沖溶液中，即刻開始計(jì)時(shí)釋藥。在預(yù)訂時(shí)間，從瓶?jī)?nèi)取出3 mL釋藥的緩沖溶液進(jìn)行紫外測(cè)量，再補(bǔ)充3 mL純的緩沖溶液保持體積恒定。
[0021]所制備的納米水凝膠在還原劑降解后，分子量小于2000且分子量分布均勻(Mn=761，PD I〈 1.2 )，遠(yuǎn)小于代謝閾值(45 — 50 kDa )，可以很好的代謝排出體外。
[0022]本發(fā)明中，所述的水凝膠納米藥物，由鉑類抗腫瘤藥物交聯(lián)聚合形成，其載藥率可以方便地用前體藥物和共聚單體的不同比例聚合反應(yīng)加以控制。在上述方案的基礎(chǔ)上，所屬抗癌藥物順鉑的載藥率的重量百分比最高可達(dá)63.8 %。
[0023]順鉑的釋放過程可以通過調(diào)節(jié)環(huán)境的谷胱甘肽濃度和pH值加以控制，在高谷胱甘肽濃度和較低PH值條件下(模擬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境)展現(xiàn)出較快的釋放速度，而在低谷胱甘肽濃度和中性的pH值條件下(模擬細(xì)胞外環(huán)境)保持穩(wěn)定，釋放量小于5%。
[0024]本發(fā)明中，通過將上述納米藥物和人卵巢癌細(xì)胞SK0V-3—起培養(yǎng)進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，納米水凝膠藥物載體體現(xiàn)出了很好的釋藥行為。通過熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)5h后載藥納米水凝膠粒子已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞，24h后順鉑藥物對(duì)于細(xì)胞的殺傷作用已經(jīng)非常明顯，細(xì)胞存活率大幅降低，剩余的少量細(xì)胞也處于皺縮狀態(tài)，說明所制備的納米水凝膠是一種較好的藥物載體。
[0025]本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于制備工藝清晰簡(jiǎn)潔，得到的納米水凝膠藥物載體具有谷胱甘肽刺激響應(yīng)性，谷胱甘肽響應(yīng)性可以使得納米水凝膠在腫瘤細(xì)胞外低谷胱甘肽濃度的環(huán)境中保持穩(wěn)定，長(zhǎng)時(shí)間循環(huán)，很少泄露藥物，而在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高谷胱甘肽濃度的環(huán)境中快速降解，變?yōu)樾》肿恿康木€性鏈，從而快速釋放藥物，達(dá)到在目標(biāo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)控制釋放抗癌藥物的效