檢測(cè)腫瘤乏氧的化合物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于熒光探針領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及以1，8-萘酰亞胺偶氮苯為母體 用于腫瘤乏氧檢測(cè)的熒光探針及其制備和檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 熒光分子成像是光學(xué)成像中最具有發(fā)展前景、研究最熱、最主要的一個(gè)方向之一。 它主要是利用熒光分子探針對(duì)活體內(nèi)靶細(xì)胞或靶標(biāo)分子進(jìn)行特異性標(biāo)記，在外界光源的激 發(fā)下被標(biāo)記的靶標(biāo)部位發(fā)出熒光信號(hào)，通過系列圖像后處理技術(shù)，將活體組織在分子和細(xì) 胞水平上的生物學(xué)過程動(dòng)態(tài)、實(shí)時(shí)示蹤。而將分子之間的相互作用通過熒光信號(hào)傳導(dǎo)出來 的分子(包括小分子、聚合物和納米顆粒）被稱為熒光分子探針或熒光分子傳感器。作為一 種靈敏度高、選擇性好、檢測(cè)方便、檢出限低的微量分析技術(shù)，近幾十年來，熒光分子探針技 術(shù)得以迅速發(fā)展，并廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。
[0003] 乏氧是所有實(shí)體瘤的內(nèi)在特征，絕大多數(shù)的實(shí)體瘤氧分壓低于其他正常組織。當(dāng) 腫瘤較小時(shí)，乏氧現(xiàn)象不是很明顯，但是當(dāng)腫瘤細(xì)胞不斷擴(kuò)散時(shí)，乏氧和局部缺血就成為導(dǎo) 致一些重大疾病的重要因素。乏氧癌細(xì)胞具有侵犯性和轉(zhuǎn)移性，預(yù)測(cè)起來較為困難，并且對(duì) 傳統(tǒng)的放療、化療和傳統(tǒng)的免疫療法都有抵制性，因此普及對(duì)乏氧腫瘤的理解及研究合理 實(shí)用的檢測(cè)方法變得尤為重要。同時(shí)對(duì)乏氧的檢測(cè)為疾病的早期診斷(特別是實(shí)體腫瘤)提 供了條件。已報(bào)道的乏氧探針可以大致分為兩類：一是針對(duì)乏氧特殊化學(xué)環(huán)境的，如較低的 PH值、較低的氧分壓和較強(qiáng)的還原性
[0004] (Bioconjugate Chem. , 2012, 23:324-329;Bioorg. Med. Chem.，2008, 16:3255-3260 );二是通過檢測(cè)乏氧條件下過表達(dá)的酶來間接檢測(cè)細(xì) 胞乏氧，如硝基還原酶和碳酐酶等（〇1^311；[01^1^618,2011，13:928-931;016111. Commun.，2011，47:8301-8303)。這些熒光探針都可以一定程度的區(qū)分乏氧細(xì)胞和正常細(xì) 胞，但同時(shí)存在乏氧/有氧熒光變化倍數(shù)不大、探針合成較復(fù)雜等問題。2010年，Nagano 等人報(bào)道了一種新型的乏氧探針（J. Am. Chem. Soc. ,2010, 132(45) :15846-15848),他們將 Cy5. 5與BHQ3通過Linker連接在一起，在乏氧條件下，BHQ3的偶氮鍵被還原斷裂，使淬滅 基結(jié)構(gòu)破壞，熒光釋放出來。
[0005] 在本發(fā)明中，我們基于偶氮鍵在乏氧條件下可以被還原機(jī)理，設(shè)計(jì)合成了一系列 以萘酰亞胺偶氮苯為母體的熒光探針，之后又以該熒光探針作為淬滅基通過FRET作用淬 滅其他熒光團(tuán)。該方法合成簡便，可以實(shí)現(xiàn)熒光〇ff-〇n檢測(cè)，對(duì)腫瘤乏氧有較好的檢測(cè)效 果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于合成一系列新型的乏氧探針，可以通過熒光變化實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤乏 氧的檢測(cè)，其設(shè)計(jì)理念如圖1所示。
[0007] 本發(fā)明中探針的母體結(jié)構(gòu)為1，8-萘酰亞胺，4位通過共價(jià)鍵與偶氮苯或其衍生物 相連。反應(yīng)機(jī)理為偶氮鍵在乏氧條件下被還原成氨基，熒光釋放出來。
[0008] 本發(fā)明中的探針可以包含一種熒光團(tuán)，也可以包含雙熒光團(tuán)，通過FRET (fluorescenceresonanceenergytransfer,突光共振能量轉(zhuǎn)移）作用實(shí)現(xiàn)突光的增強(qiáng)。
[0009] 本發(fā)明中的熒光探針結(jié)構(gòu)如下式I所示：
[0010]
[0011] 式中，
[0012] R1 選自-NR3R4;
[0013] R3 選自 _ (CH2)mR6 或-(CH2)nR5 ;
[0014]R4 選自-(CH2)mR6 ;
[0015] R5 和R6 各自獨(dú)立選自-CH3、-OH、-Br、-Cl、-CECH、-N3 ;
[0016] R2 選自-(CH2)pCH3、- (CH2)PCH2-、- (CH2O)qCH3、- (CH2O)qCH2-、- (CH2O)rH、- (CH2O) r-、-CH2 (CH2OCH2)sCH20H、-CH2 (CH2OCH2)sCH2〇-、-CH2 (CH2OCH2)tCH3 和-CH2 (CH2OCH2)tCH2-;
[0017] 其中n、m、p、q、r、s、t=0_18 的整數(shù)；
[0018] A不存在，或?yàn)楸江h(huán)；
[0019]B不存在，或?yàn)闊晒鈭F(tuán)。
[0020] 在一【具體實(shí)施方式】中，B為選自羅丹明B或氟硼吡咯的熒光團(tuán)。
[0021] 在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，B選自：
[0022]
[0023] 在一【具體實(shí)施方式】中，B不存在。
[0024] 在一【具體實(shí)施方式】中，所述R3或R4各自為C1-C4烷基。
[0025] 在一【具體實(shí)施方式】中，所述R3和R4各自為甲基或乙基。
[0026] 在一【具體實(shí)施方式】中，所述R5和R6各自為-CH3。
[0027] 在一【具體實(shí)施方式】中，所述R2 選自 _(CH2)pCH 3、_(CH20)占、或-CH2 (CH20CH2)sCH 20H。
[0028] 在一【具體實(shí)施方式】中，所述11、111、口、9、1'、8、七各自為0、1、2、3、4或5。
[0029] 在一【具體實(shí)施方式】中，所述A不存在。
[0030] 在一【具體實(shí)施方式】中，所述A為苯環(huán)。
[0031] 在一具體實(shí)施例中，所述化合物選自：
[0032]
[0033] 本發(fā)明提供本發(fā)明熒光探針的制備方法，包括：
[0034] ( 1)在溶劑和催化劑的存在下，由4-硝基萘酐制備4-氨基萘酐；
[0035] (2)在溶劑的存在下，由4-氨基萘酐及R2-NH2制備得到下式II的化合物：
[0036]
[0037] (3)使式II化合物在鹽酸和亞硝酸鈉的存在下在冰浴中反應(yīng)；
[0038] (4)在步驟（3)的反應(yīng)溶液中加入下式III的化合物在冰浴中進(jìn)行反應(yīng)：
[0039]
[0040] (5)撤去步驟（4)的冰浴，以將pH調(diào)節(jié)至6左右，繼續(xù)反應(yīng)，從而制備得到本發(fā)明 式I的不含有B的化合物。
[0041] 在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述方法還包括：
[0042] (6)在二氯甲烷、三乙胺和HBTU (苯并三氮唑_N，N，N'，N'_四甲基脲六氟磷酸鹽） 的存在下，使步驟（5)所得產(chǎn)物先在冰浴中、然后在室溫下與B反應(yīng)，從而制備得到含B的 式I化合物。
[0043] 在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，步驟（1)在無水乙醇、氯化亞錫和濃鹽酸的存在下進(jìn)行。
[0044] 在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，步驟（2)所用的溶劑為二甲基甲酰胺（DMF)和正丁胺。
[0045] 在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，步驟（3)中，先將式II化合物加到去離子水和濃鹽酸中， 冰浴下攪拌大約30分鐘；然后將溶于去離子水的亞硝酸鈉加入上述溶液中，冰浴下繼續(xù)反 應(yīng)約30分鐘。
[0046] 在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，步驟（4)中，加入式III化合物反應(yīng)大約30分鐘。
[0047] 在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，步驟（4)結(jié)束后撤去冰浴，然后將溶液pH調(diào)節(jié)到大約6， 繼續(xù)反應(yīng)大約60分鐘。
[0048] 在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，通過加入飽和乙酸鈉溶液而將pH調(diào)節(jié)到6左右。
[0049] 在一個(gè)【具體實(shí)施方式】，步驟（6)中，使步驟（5)所得產(chǎn)物先在冰浴中與B反應(yīng)大約 60分鐘，然后在室溫下與B反應(yīng)大約10小時(shí)。
[0050] 在一【具體實(shí)施方式】中，用于上述步驟的反應(yīng)溶劑選自冰醋酸，二甲基甲酰胺，二氯 甲烷，甲苯，乙醇，鹽酸，水或其混合溶液。
[0051] 本發(fā)明還包括本發(fā)明所述的探針分子在腫瘤乏氧檢測(cè)中的用途。
[0052] 本發(fā)明還包括本發(fā)明所述的探針分子在制備用于腫瘤乏氧檢測(cè)的試劑盒中的用 途。
[0053] 本發(fā)明還包括一種檢測(cè)試劑盒，所述檢測(cè)試劑盒含有權(quán)利要求1一5中任一項(xiàng)所 述的化合物，作為熒光探針分子，用于檢測(cè)腫瘤乏氧狀態(tài)。
[0054] 在一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒還含有使用說明書以及其它的適于檢 測(cè)腫瘤乏氧狀態(tài)所需的試劑。
[0055] 本發(fā)明還提供一種檢測(cè)腫瘤乏氧的方法，所述方法包括使本發(fā)明所述的探針分子 與細(xì)胞接觸以使所述探針分子透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，比較接觸前、后熒光的變化，其中， 熒光增強(qiáng)指示腫瘤乏氧。
【附圖說明】
[0056] 圖1顯示探針分子設(shè)計(jì)思想。
[0057] 圖2顯示探針分子Pl的吸收（)和發(fā)射光譜（一）（Ex:340nm)。
[0058] 圖3顯示探針分子Pl的熒光發(fā)射光譜（一）及使用鹽酸、氯化亞錫還原后的熒光 發(fā)射光譜（)(Ex:440nm)〇
[0059] 圖