專利名稱:自備2-芳基丙酸的方法
本發(fā)明是關(guān)于下述化合物的制法具有藥物活性的一種化合物-這種化合物具有式(Ⅰ)的立體結(jié)構(gòu)-或其可作藥用的鹽或酯(例如，
堿金屬或堿土金屬鹽或三甲基乙酰酯)。式(Ⅰ)中R1代表一種可任意取代的芳基(如苯基或萘基)，它可以存在一個(gè)可任意取代的雜環(huán)體系中;或者代表一個(gè)除碳原子外，還含有一個(gè)或多個(gè)氮原子、硫原子或氧原子的芳雜環(huán)體系，該體系可被任意取代。
眾所周知，許多生物活性化合物都以一種立體異構(gòu)體的混合物形成存在。直到現(xiàn)在，這些混合物常常用于農(nóng)業(yè)和藥物領(lǐng)域。這類混合物中常常只有一種立體異構(gòu)體具有人們所希望的生物活性，所以含有兩種或多種立體異構(gòu)體的混合物的有效性(比單一異構(gòu)體)至少要低一半，而人們?nèi)匀皇褂酶髁Ⅲw異構(gòu)體的混合物，其主要原因是，用于分離的花費(fèi)太高，超過(guò)了分離后可能增加活性而帶來(lái)的潛在利益。然而，很明顯，現(xiàn)代藥物學(xué)家愈來(lái)愈多地注意到服用下述立體異構(gòu)體混合物產(chǎn)生的其它后果其中一種或多種立體異構(gòu)體必須看成雜質(zhì)，因?yàn)樗?們)可能沒有所需要的治療作用，甚至?xí)a(chǎn)生所不希望的生理效應(yīng)，其中包括毒性。
特別是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，有體外抗作炎作用活性的甲氧萘丙酸和異丁苯丙酸都是其S-對(duì)映體(旋光性立體異構(gòu)體)，它的活性可達(dá)其對(duì)映體的150倍，見S.Adams等人，在“J.Pharm.Pharmac.，28(1976)256”和A.j.Hutt和J.Caldwell在“Clinical Pharmacokinetics 9(1984)371”中所述。
由J.Sugai和K.Mori的文章可知(見Agric.Biol.Chem.48(1984)2501)可以用1-異丁基-4-(1′-甲基辛基)苯-它是有一條適宜的非功能性脂肪鏈的芳烴-通過(guò)微生物氧化來(lái)選擇性地制備異丁苯丙酸的非活性R-對(duì)映異構(gòu)體。因此，仍然非常需要有一種能得到經(jīng)濟(jì)上有吸引力的產(chǎn)量的工業(yè)制備這些S-對(duì)映異構(gòu)體的方法。本發(fā)明的目的就是提供這樣一種方法。
經(jīng)過(guò)廣泛的研究和實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)在已經(jīng)出乎意料地找到了一種專門制備S-對(duì)映體化合物(Ⅰ)的改進(jìn)合成方法，該方法包括使化合物(Ⅱ)與微生物作用，此微生物能使化合物(Ⅱ)立體選擇地被氧化成化合物(Ⅰ)，
其中按重量計(jì)至少有70%為S-構(gòu)型，如果需要，再進(jìn)一步把化合物(Ⅰ)轉(zhuǎn)化成其可作藥用的鹽或酯。式Ⅱ中R1的定義同上所述。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明是關(guān)于生產(chǎn)具有藥物活性、S-立體構(gòu)型占優(yōu)勢(shì)的式(Ⅰ)化合物或其可作藥用的鹽或酯的方法。優(yōu)先選擇的是堿金屬鹽或堿土金屬鹽。式(Ⅰ)中R1是可任意取代的芳基(例如，苯基或萘基)，它可以存在于一個(gè)可任意取代的雜環(huán)體系中;或者代表一個(gè)除碳原子外，還含有一個(gè)或多個(gè)氮原子、硫原子或氧原子的雜環(huán)體系，此雜環(huán)體系可被任意取代，該方法包括，使化合物(Ⅱ)與能把化合物(Ⅱ)立體有擇地氧化成化合物(Ⅰ)的微生物作用。化合物(Ⅰ)中較好的有甲氧萘丙酸、異丁苯丙酸、α-甲基-4-(2-噻吩羰基)苯乙酸、苯氧苯丙酸、酮丙酸、2-(4-氯苯基)-α-甲基-5-苯并噁唑乙酸、6-氯-α-甲基-9H-咔唑-2-乙酸、芴丙酸(cicloprofen)、吡丙芬(pirprofen)、2-(對(duì)異丁苯基)丙酸1-細(xì)胞溶素鹽、氟聯(lián)苯丙酸、2-(3′-氟基-4-聯(lián)苯基)丙酸、6-氯-5-環(huán)己基-2，3-二氫-1H-茚-1-羧酸、叔基丙酸(tertiprofen)、2-(4-環(huán)己苯基)丙酸、4-(1，3-二氫-1-氧代-2H-異氮茚-2-基)-α-甲基苯乙酸、2-[4-(反-2-甲基環(huán)己基)苯基]丙酸、α-甲基-5H-[1]苯并吡喃并[2，3-b]吡啶-7-乙酸、α-甲基-3-苯基-7-苯并呋喃乙酸(R803)、吩噻嗪丙酸、5-苯甲?；?α-甲基-2-噻吩乙酸或2-[4-(對(duì)溴苯基)-2-噻唑基]丙酸。
按照本發(fā)明方法來(lái)制備S-構(gòu)型占優(yōu)勢(shì)的甲氧萘丙酸和異丁苯丙酸更好。
根據(jù)較好的作法，上述方法是通過(guò)選擇一種適宜的微生物來(lái)實(shí)施的，選擇標(biāo)準(zhǔn)是能形成S-構(gòu)型按重量計(jì)至少占90%的化合物(Ⅰ)。
適宜的微生物的例子有各種霉菌、酵母類霉菌和酵母。特別是能把化合物(Ⅰ)氧化成甲氧萘丙酸或異丁苯丙酸的微生物，包括屬于蟲草屬霉菌的培養(yǎng)物，尤其是胃蟲草屬[例如，屬于此種屬的一個(gè)菌株儲(chǔ)存在“霉菌培養(yǎng)物中心”(荷蘭)(即CBS)儲(chǔ)存號(hào)為267.85，儲(chǔ)存日期為1985年6月7日]或其變種或突變體的培養(yǎng)物。
根據(jù)本發(fā)明的一種作法，能立體有擇地把化合物(Ⅱ)氧化成化合物(Ⅰ)的微生物，是采用一種2-(R1)烷烴(R1的定義同前所述)作為碳源，在一種適宜的培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇的。對(duì)于能產(chǎn)生甲氧萘丙酸的微生物的選擇來(lái)講，宜采用2-(6-甲氧基-2-萘基)烷烴，其中該烷烴為戊烷、庚烷、壬烷時(shí)是有利的。適宜培養(yǎng)基的例子有加有維生素溶液和(或)酵母浸取物的PS-Ⅲ鹽培養(yǎng)基。
有若干種從自然來(lái)源，尤其是從土壤樣品中分離出來(lái)的微生物是根據(jù)上述的篩選方法選出的。像下文所描述的那樣，對(duì)這些微生物做進(jìn)一步試驗(yàn)時(shí)，它們表現(xiàn)出把化合物(Ⅱ)立體有擇地氧化為化合物(Ⅰ)的能力。
在加有維生素溶液和(或)0.01%酵母浸取物的PS-Ⅲ鹽培養(yǎng)基中，采用2.5克/升的2-(6-甲氧基-2-萘基)庚烷作為碳源，可從土壤樣品中分離得到新發(fā)現(xiàn)的本發(fā)明微生物。
PS-Ⅲ鹽培養(yǎng)基中含有磷酸二氫鉀(2.1克/升)、磷酸氫二銨(1.0克/升)、硫酸銨(0.9克/升)、氯化鉀(0.2克/升)、二水硫酸鈣(0.005克/升)、七水硫酸鎂(0.2克/升)、六水硫酸亞鐵·硫酸銨(2.5毫克/升)、七水硫酸鋅(0.5毫克/升)、四水二氯化錳(0.3毫克/升)、五水硫酸銅(0.15毫克/升)、六水二氯化鈷(0.15毫克/升)、硼酸(0.05毫克/升)、二水鉬酸鈉(0.055毫克/升)、碘化鉀(0.1毫克/升)。
pH調(diào)到6.8，培養(yǎng)基在120℃滅菌20分鐘。
維生素溶液中含有維生素H(0.002毫克/升)、泛酸鈣(0.4毫克/升)、肌醇(2.0毫克/升)、煙酸(0.4毫克/升)、鹽酸維生素B(0.4毫克/升)、鹽酸維生素B(0.4毫克/升)、對(duì)氨基苯甲酸(0.2毫克/升)、維生素B(0.2毫克/升)、葉酸(0.01毫克/升)。
pH調(diào)到7.0，培養(yǎng)基用一個(gè)薄膜過(guò)濾器滅菌。
這些新發(fā)現(xiàn)的微生物是用凝固瓊脂培養(yǎng)基純化。
這些培養(yǎng)物的樣品儲(chǔ)存在CBS。用于氧化2-(6-甲氧基-2-萘基)丙烷成甲氧萘丙酸的微生物(用上述分離和選擇方法得到的)，包括下列霉菌的培養(yǎng)物霉菌27-2，1-2x(這種霉菌的一個(gè)菌株儲(chǔ)存在CBS，儲(chǔ)存號(hào)是256.86，儲(chǔ)存日期是1986年5月15日)、酵母類27-1，Ⅰ2(這種菌屬的一個(gè)菌株儲(chǔ)存在CBS，儲(chǔ)存號(hào)257.86，儲(chǔ)存日期1986年5月15日)、酵母類27-2，Ⅱ7(這種菌屬的一個(gè)菌株儲(chǔ)存在CBS中，儲(chǔ)存號(hào)259.86，儲(chǔ)存日期1986年5月15日)、酵母類22-2，Ⅰ5(這種菌屬的一個(gè)菌株儲(chǔ)存在CBS，儲(chǔ)存號(hào)258.86，儲(chǔ)存日期1986年5月15日)以及它們的變種或突變體。
為達(dá)到本發(fā)明目的，使用以聚合物凝膠固定的上述微生物是有利的。
根據(jù)實(shí)施本發(fā)明方法的一個(gè)較好作法，能夠把化合物(Ⅱ)轉(zhuǎn)變?yōu)镾-構(gòu)型按重量計(jì)至少為70%的化合物Ⅰ的微生物必須培養(yǎng)約0.5至10天，然后把其細(xì)胞懸浮在液體營(yíng)養(yǎng)基中，最好是一種最小液體營(yíng)養(yǎng)基，然后使化合物(Ⅱ)受到這些細(xì)胞的作用。上述大約1至10天的培養(yǎng)過(guò)程結(jié)束后，在把這些細(xì)胞懸浮在最小液體營(yíng)養(yǎng)基中之前，可將其從培養(yǎng)基中分離出來(lái)。為了培養(yǎng)用于化合物(Ⅱ)的選擇性氧化的各種微生物，可采用普通的培養(yǎng)基，其中含有可吸收的碳源(例如，葡萄糖、乳酸鹽、蔗糖等)、可吸收的氮源(例如，硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等)，并且含有有機(jī)營(yíng)養(yǎng)源物質(zhì)(例如，酵母浸取物、麥芽汁胨、肉汁等)以及無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)源物質(zhì)(例如磷酸鹽、鎂、鉀、鋅、鐵以及其它微量金屬)。較好的培養(yǎng)基可采用Czapek-Dox培養(yǎng)基、BHI培養(yǎng)基或YEPD培養(yǎng)基，其中可隨意地添加一種或多種營(yíng)養(yǎng)素。
在微生物培養(yǎng)過(guò)程中，溫度要維持在0℃和45℃之間，pH要維持在3.5和8之間。最好在溫度在20和37℃之間、pH在4和7之間的條件下培養(yǎng)微生物。
可以根據(jù)任何成熟的方法提供微生物繁殖期間所需要的好氧條件，只要該方法能提供足以滿足微生物代謝所需要的氧即可。供氧以供給氧氣，特別是空氣形式的氧氣最方便。在化合物(Ⅱ)向化合物(Ⅰ)轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，使用上述普通培養(yǎng)基，微生物可以處于生長(zhǎng)階段。
在化合物(Ⅱ)向化合物(Ⅰ)的轉(zhuǎn)化過(guò)程中，最好是在一個(gè)最小培養(yǎng)基中把微生物基本上控制在非生長(zhǎng)狀態(tài)。最小培養(yǎng)基可采用普通培養(yǎng)基，其中需要時(shí)，可含有可吸收的碳源(例如，葡萄糖、乳酸鹽、蔗糖等)，需要時(shí)，可含有可吸收的氮源(例如硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等)，同時(shí)含有作為有機(jī)營(yíng)養(yǎng)源的物質(zhì)(例如酵母浸取物、鹽汁、胨、肉汁等)以及作為無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)源的物質(zhì)(例如磷酸鹽、鎂、鉀、鋅、鐵和其它微量金屬)。除去可吸收的碳源或氮源，可將微生物控制在非生長(zhǎng)狀態(tài)下。在此期間，溫度要維持在0℃和45℃之間，pH要維持在3.5和8之間。最好把微生物保持在溫度為20到37℃、pH為4到7的條件下，可根據(jù)上文所敘述的方法提供這一階段所需要的好氧條件，只要所提供的氧既能滿足微生物代謝的需要，又能使化合物(Ⅱ)轉(zhuǎn)化成化合物(Ⅰ)即可。通過(guò)上述微生物得到的化合物(Ⅰ)可按照用于這類產(chǎn)物的本身已知的方法回收和純化。
下述實(shí)施例可用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，但并不能限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例Ⅰ用胃蟲草(Cordyceps militaris)(CBS267.85)把2-(6-甲氧基-2-萘基)丙烷轉(zhuǎn)變?yōu)镾-2-(6-甲氧基-2-萘基)丙酸胃蟲草系存放在偏斜地置于試管中的凝固了的各Czapek-Dox瓊脂培養(yǎng)基上，從這些培養(yǎng)基中把胃蟲草接種到加有下列成分的Czapek-Dox培養(yǎng)基上硝酸鈉(3克/升)、磷酸氫二鉀(1克/升)、七水硫酸鎂(0.5克/升)、七水硫酸亞鐵(0.01克/升)、麥芽汁(1克/升)、酵母浸取物(1克/升)和蔗糖(20克/升)。pH調(diào)至6.5。
在裝有100毫升培養(yǎng)基的500毫升緩沖液燒瓶里培養(yǎng)霉菌6天。溫度保持在25℃，同時(shí)維持振蕩及好氧條件。
在培養(yǎng)了6天的培養(yǎng)基中，加入溶于十四烷(50毫克底物/毫升十四烷)中的20毫克2-(6-甲氧基-2-萘基)丙烷。
分析將培養(yǎng)物用85%磷酸酸化到pH2.0，加入少量的硫酸銨，然后用二氯甲烷提取混合物。
在薄層色譜板(Merck，預(yù)先用熒光顯示劑涂覆的硅膠60F-254薄層板)上對(duì)二氯甲烷提取液進(jìn)行分析。此薄板用體積比為1∶5的乙酸乙酯-己烷混合液作展開劑。將發(fā)現(xiàn)含有其比移值(Rf)和甲氧萘丙酸的相同的化合物的各提取液衍生化，形式萘甲酰胺類物質(zhì)，并用高效液相色譜進(jìn)行分離。
衍生化方法在N氣流中干燥2毫升二氯甲烷提取液。使干燥樣品在60℃與200微升苯+10微升亞硫酰氯反應(yīng)10分鐘。
在N氣流中干燥反應(yīng)混合物。
加入5%的溶于干燥二氯甲烷中的萘甲胺(200微升)。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行1小時(shí)。在N氣流中干燥反應(yīng)混合物，然后用體積比為2∶1的2毫升異辛烷/氯仿和2毫升1N鹽酸提取。
高效液相色譜分析結(jié)果表明，每份培養(yǎng)物中含有8.2毫克S-甲氧萘丙酸和0.09毫克R-甲氧萘丙酸。S-和R甲氧萘丙酸對(duì)映體的相應(yīng)分配百分比分別為98.9%和1.1%。
實(shí)施例Ⅱ在和例Ⅰ平行的實(shí)驗(yàn)中，把從6天培養(yǎng)的老培養(yǎng)物中獲得的菌絲體重新接種到50毫升ASM培養(yǎng)基中，同時(shí)保持振蕩和好氧條件。加入含有如下成分的銨鹽培養(yǎng)基(ASM)(加入前要進(jìn)行高壓滅菌)氯化銨(0.54克/升)、磷酸二氫鉀0.53克/升)、磷酸氫二鈉(0.87克/升)、硫酸鉀(0.17克/升)、七水硫酸鎂(0.07克/升)、二水氯化鈣(0.073克/升)、TK微量元素溶液11.0毫升)和七水硫酸亞鐵(0.019克/升)。pH調(diào)到7.0。把溶于十四烷中的20毫克2-(6-甲氧基-2-萘基)丙烷底物加到培養(yǎng)物中，在25℃繼續(xù)培養(yǎng)6天。以下步驟均與實(shí)施例Ⅰ中描述的相同提取、薄層色譜分析、衍生化和高效液相色譜分析。
測(cè)得每份培養(yǎng)物中含有總量為6.4毫克的S-甲氧萘丙酸和0.03毫克的R-甲氧萘丙酸，相應(yīng)的對(duì)映體分配情況為S-構(gòu)型占99.5%，R-構(gòu)型占0.5%。
實(shí)施例Ⅲ用胃蟲草(Cordyceps militaris)(CBS267.85)將2-(4-異丁基苯基)丙烷轉(zhuǎn)變成S-2-(4-異丁基苯基)丙酸把500毫升一份的若干份胃蟲草(Codyceps militaris)在加入的Czapex-Dox培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)在25℃和好氧條件下，在旋轉(zhuǎn)振蕩器上進(jìn)行5天時(shí)間。根據(jù)“Oxoid手冊(cè)”(“The Oxoid Manual”)調(diào)整后的Czapek-Dox培養(yǎng)基中含有如下成分硝酸鈉(2.0克/升)、氯化鉀(0.5克/升)、甘油磷酸鎂(0.5克/升)、硫酸亞鐵(0.01克/升)、硫酸鉀(0.35克/升)以及蔗糖(30克/升)。對(duì)1升培養(yǎng)物肉湯進(jìn)行過(guò)濾(Whafman No1)，把所得細(xì)菌重新懸浮于500毫升ASM培養(yǎng)基中，與0.34克(0.4毫升)2-(4-異丁基苯基)丙烷一起培養(yǎng)5天，培養(yǎng)在25℃及好氧條件下，在振蕩器上進(jìn)行。過(guò)濾培養(yǎng)混合物，濾液用1N鹽酸酸化到pH2.0，再用二氯甲烷提取。產(chǎn)物用氣液色譜鑒定，結(jié)果表明有所需要的酸產(chǎn)物存在。二氯甲烷提取液用碳酸氫鈉(溶液)提取，(提取液)用1N鹽酸酸化，(酸化液)再用二氯甲烷提取。蒸去溶劑，得到2-(4-異丁基苯基)丙酸的粗品。不能產(chǎn)品分成每30毫克1份，在己烷硅膠柱中以5%的乙醚/己烷作為洗脫劑進(jìn)行純化。得到S-2-(4-異丁基苯基)丙酸，對(duì)此化合物進(jìn)行氣液色譜和薄層色譜分析時(shí)，得到單一的組分。
總共得到43毫克做氣液色譜和薄層色譜分析時(shí)顯示為單一組分的S-2-(4-異丁基苯基)丙酸。它的質(zhì)子磁共振譜(PMR)和外消旋物的一致;PMR(CDCl3)δ0.9(d，6H，CH-(CH3)2);1.5(d，3H，CH-CH3);1.85(m，1H，CH-(CH3)2);2.45(d，2H，-CH2);3.7(q，1H，-CH-CH3);7.1-7.25(m，4H，芳烴的)。使用Spherisorb S 5NH柱(25厘米×4.9毫米內(nèi)徑)，用制備性高效液相色譜除去微量雜質(zhì)，用含20%異丙醇的己烷/二氯甲烷(60/40，體積比)溶液，以2毫升/分鐘的速率進(jìn)行洗脫。
重復(fù)注入洗脫劑，經(jīng)過(guò)3.2分鐘，洗脫得到4毫克S-2-(4-異丁基苯基)丙酸。
通過(guò)分析與S-(-)-α-甲基芐胺形成的非各種非對(duì)映異構(gòu)體酰胺的組成的方法來(lái)測(cè)定S-2-(4-異丁基苯基)丙酸的對(duì)映體純度。高效液相色譜的分析結(jié)果表明，有90%的非對(duì)映異構(gòu)體對(duì)應(yīng)于S-2-(4-異丁基苯基)丙酸，其保留時(shí)間為2.89分鐘。保留時(shí)間為2.48分鐘的10%的非對(duì)映異構(gòu)體對(duì)應(yīng)于R-2-(4-異丁基苯基)丙酸。
實(shí)施例Ⅳ使用胃蟲草(CBS267.85)的制備性轉(zhuǎn)化過(guò)程生產(chǎn)2-(6-甲氧基-2-萘基)丙酸的一般方法包括，培養(yǎng)若干批微生物，培養(yǎng)是在25℃，在添加有0.1%麥芽汁和0.1%酵母浸取物的Czapek-Dox培養(yǎng)基中進(jìn)行5天。過(guò)濾(Whatman no.1 paper)出2×500毫升培養(yǎng)物中的菌絲體，將其重新懸浮于500毫升銨鹽培養(yǎng)基中，再用2毫升二甲基甲酰胺中的200毫克2-(6-甲氧基-2-萘基)丙烷進(jìn)行處理。在某些情況下，是過(guò)濾出500毫升培養(yǎng)物中的菌絲體，將其重新懸浮在含有1毫升二甲基甲酰胺與100毫克2-(6-甲氧基-2-萘基)丙烷的500毫升的培養(yǎng)基中。在25℃，在旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)器中培養(yǎng)6天。
培養(yǎng)后過(guò)濾得到的濾液用2N鹽酸酸化到pH2.0，再用二氯甲烷提取。二氯甲烷提取液用1%的NaHCO3溶液提取除酸。碳酸氫鹽提取液用2N鹽酸酸化到pH2.0，過(guò)濾回收沉淀的酸。分批純化粗酸把大約30-50毫克的不純2-(6-甲氧基-2-萘基)丙酸在用己烷處理過(guò)的硅膠(60-120目)柱(1厘米×7厘米)上純化。用乙醚/己烷混合液洗脫出純的2-(6-甲氧基-2-萘基)丙酸，乙醚與己烷的體積比為3∶7。用上文所述的薄層色譜法檢查純度。純酸樣品用丙酮/己烷重結(jié)晶。
通過(guò)胃蟲草(CBS267.85)制備S-2-(6-甲氧基-2-萘基)丙酸800毫克2-(6-甲氧基-2-萘基)丙烷轉(zhuǎn)化后得到50毫克碳酸氫鹽提取物，該提取物經(jīng)色譜分離后，得到40毫克純S-2-(6-甲氧基-2-萘基)丙酸，它在GLC和TLC分析中顯示為單一組分，其[α]25D＝+58.1°，(C+1.24，CHCl3)。重結(jié)晶后得到熔點(diǎn)為152-153℃的物質(zhì)(文獻(xiàn)記載為152-154℃);[α]25D＝+62.2°(C＝1.08，CHCl3)，(文獻(xiàn)記載[α]25D＝+66°)，PMR(CHCl3)δ1.6(d，3H，CH-CH3)，3.92(s，3H，OCH3)，3.88(q，1H，CH)和7-8(m，6H，芳香烴的)，此與商品S-甲氧萘丙酸的一致。
快速原子碰撞質(zhì)譜在不同的m/z比值處產(chǎn)生信號(hào)231[M+H]+，185[M-HCO2H+H]+，323[M+6+H]+，115[G+Na]+及229[M-H]-，321[M+G-H]-(G＝丙三醇)。
用S-(-)-α-甲芐胺把R-和S-2-(6-甲氧基-2-萘基)丙酸轉(zhuǎn)變成非對(duì)映異構(gòu)體的酰胺并用HPLC法進(jìn)行分離來(lái)測(cè)定其光學(xué)純度按已描述的條件，把從胃蟲草中分離出的2-(6-甲氧基-2-萘基)丙酸用S-(-)-α-甲芐胺轉(zhuǎn)變成酰胺，按后文的說(shuō)明，用高效液相色譜法分析產(chǎn)物，得到以下結(jié)果形成的非對(duì)映異構(gòu)體的色譜組成是3.4%的R-2-(6-甲氧基-2-萘基)丙酰胺(5.73/分鐘)和96.6%的S-2-(6-甲氧基-2-萘基)丙酰胺(6.78分鐘);由商品甲氧萘丙酸得到的是5%的R-2-(6-甲氧基-2-萘基)丙酰胺(4.08分鐘)和95%的S-2-(6-甲氧基-2-萘基)丙酰胺(4.83分鐘)。
用HPLC系統(tǒng)分離由RS、R或S-2-(6-甲氧基-2-萘基)丙酸與R或S-α-甲芐胺作用而形成的非對(duì)映異構(gòu)體酰胺采用帶紫外(250毫微米)檢測(cè)器的Gilson Isocratic HPCL系統(tǒng)。在環(huán)境條件下，采用Spherisort S 5NH柱(25厘米×4.9毫米內(nèi)徑)。采用25%的己烷溶液(其中溶質(zhì)為二氯甲烷-丙醇，9∶1)作為流動(dòng)相，流速為2毫升/分鐘。特征保留時(shí)間是，對(duì)于S，R和R，S非對(duì)映異構(gòu)體，為4.0分鐘;對(duì)于S，S和R，R非對(duì)映異構(gòu)體，為4.8分鐘。
實(shí)施例Ⅴ對(duì)以下霉菌菌株試驗(yàn)其氧化2-(6-甲氧基-2-萘基)丙烷的能力∶霉菌27-2，1-2x(CBS256.86)、酵母27-1，Ⅰ2(CBS257.86)、酵母22-2，Ⅰ5(CBS258.86)和酵母27-2，Ⅱ7(CBS259.86)。在30℃，在100毫升的培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些菌株48小時(shí)。然后于培養(yǎng)物中加入溶于0.4毫升十四烷中的20毫克2-(6-甲氧基-2-萘基)丙烷，繼續(xù)培養(yǎng)3或4天。在各個(gè)時(shí)刻用二氯甲烷提取每一種微生物的200毫升培養(yǎng)物兩次。形成的甲氧萘丙酸被衍生化成萘甲酰胺，用高效液相色譜分析(參看實(shí)施例Ⅰ)。
表Ⅰ微生物 所用培養(yǎng)基 時(shí)刻 形成的甲氧 % S % R(天數(shù)) 萘丙酸＊＊毫克/升霉菌27-2，1-2x Czapek-Dox 3 3.7 98 2(CBS256.86) 4 7.8 95 5酵母浸取物27-1，Ⅰ2YEPD 3 4.2 81 19(CBS257.86) 4 6.9 84 16酵母22-2，Ⅰ5BHI 3 2.6 83 17(CBS258.86) 4 1.9 83 17酵母27-2，Ⅱ7YEPD 3 2.9 72 28(CBS259.86) 4 3.1 72 28＊Czapek-Dox培養(yǎng)基，和實(shí)施例Ⅰ中所用相同。
牛心浸出液(BHI)的組成37克/升(BHI)(Oxoid
)，pH調(diào)到7.0，培養(yǎng)基在120℃滅菌20分鐘。
YEPD培養(yǎng)基組成10克/升酵母浸取物、20克/升細(xì)菌胨、20克/升葡萄糖，PH調(diào)到7.0，培養(yǎng)基在110℃滅菌30分鐘。＊＊所標(biāo)出的數(shù)值是經(jīng)過(guò)衍生化后形成的甲氧萘丙酸的量，每一數(shù)據(jù)代表所得到的兩個(gè)數(shù)據(jù)的平均值。
權(quán)利要求
1.制備式(Ⅰ)的立體有擇形式的藥物活性化合物或其可作藥用的鹽或酯-例如，堿金屬鹽、堿土金屬鹽或三甲基乙酰酯-的方法，
式(Ⅰ)中R1代表可任意取代的芳基，例如苯基或萘基，它可以存在于一個(gè)雜環(huán)體系中，該體系可以被取代，或者R1代表一個(gè)芳雜環(huán)體系，該體系除含碳原子外，還可含有一個(gè)或幾個(gè)氮原子、硫原子或氧原子，此雜環(huán)體系可以被任意取代，該方法包括，使式(Ⅱ)的化合物與
能立體有擇性地把化合物(Ⅱ)氧化為化合物(Ⅰ)的一種微生物作用而生成化合物(Ⅰ)，化合物(Ⅰ)中按重量計(jì)至少有70%是S-構(gòu)型，如果需要，再把化合物(Ⅰ)轉(zhuǎn)變?yōu)槠淇勺魉幱玫柠}或酯。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中化合物(Ⅰ)是甲氧萘丙酸、異丁苯丙酸、α-甲基-4-(2-噻吩羰基)苯乙酸、苯氧苯丙酸、酮丙酸、2-(4-氯苯基)-α-甲基-5-苯并噁唑乙酸、6-氯-α-甲基-9H-咔唑-2-乙酸、芴丙酸(cicloprofen)、吡丙芬(pirprofen)、2-(對(duì)異丁苯基)丙酸1-細(xì)胞溶素鹽、氟聯(lián)苯丙酸、2(-3′-氟基-4-聯(lián)苯基)丙酸、6-氯-5-環(huán)己基-2，3-二氫-1H-茚-1-羧酸、叔基丙酸(tertiprofen)、2-(4-環(huán)己苯基)丙酸、4-(1，3-二氫-1-氧代-2H-異氮茚-2-基)-α-甲基苯乙酸、2-[4-(反-2-甲基環(huán)己基)苯基]丙酸、α-甲基-5H-[1]苯并吡喃并[2，3-b]吡啶-7-乙酸、α-甲基-3-苯基-7-苯并呋喃乙酸(R803)、吩噻嗪丙酸、5-苯甲?；?α-甲基-2-噻吩乙酸或2-[4-(對(duì)溴苯基)-2-噻唑基]丙酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2的方法，其中化合物(Ⅰ)是甲氧萘丙酸或異丁苯丙酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1-3的方法，其中該微生物能把化合物(Ⅱ)轉(zhuǎn)變成S-構(gòu)型按重量計(jì)至少占90%的化合物(Ⅰ)。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1-4的方法，其中該微生物是一種屬于蟲草屬的霉菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求
5的方法，其中該微生物是胃蟲草類，最好是胃蟲草(CBS267.85)或是其變種或突變體。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1-4的方法，其中該微生物是在一種適宜的培養(yǎng)基中，以2-(R1)烷烴作為碳源，從自然來(lái)源中分離和選擇出來(lái)的。
8.根據(jù)權(quán)利要求
7的方法，其中R1代表6-甲氧基-2-萘基，該烷烴最好是戊烷、庚烷或壬烷。
9.根據(jù)權(quán)利要求
1-4或8的方法，其中該微生物是霉菌，最好是27-2，1-2x(CBS256.86)或是其變種或突變體。
10.根據(jù)權(quán)利要求
1-4或8的方法，其中該微生物是一種酵母或是酵母類真菌。
11.根據(jù)權(quán)利要求
10的方法，其中該微生物是酵母27-1，Ⅰ2(CBS257.86)或其變種或突變體。
12.根據(jù)權(quán)利要求
10的方法，其中該微生物是酵母27-2，Ⅱ7(CBS259.86)或其變種或突變體。
13.根據(jù)權(quán)利要求
10的方法，其中該微生物是酵母22-2，Ⅰ5(CBS258.86)或是其變種或突變體。
14.根據(jù)前述任一權(quán)利要求
的方法，其中該微生物是固定在聚合物凝膠上。
15.根據(jù)前述任一權(quán)利要求
的方法制備的化合物(Ⅰ)或其可作藥用的鹽或酯，例如化合物(Ⅰ)的堿金屬鹽或堿土金屬鹽。
16.根據(jù)權(quán)利要求
15的化合物，其中按重量計(jì)至少有70%為S-構(gòu)型。
17.根據(jù)權(quán)利要求
15-16的化合物，其中按重量計(jì)至少有90%為S-構(gòu)型。
18.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，該方法實(shí)質(zhì)上與前文中參照各實(shí)施例所描述的一致。
19.從自然來(lái)源中分離和選擇下述微生物的方法這類微生物有立體選擇地把化合物(Ⅱ)氧化成化合物(Ⅰ)的能力，R1代表一種可任意
取代的芳基，如苯基或萘基，它可以存在于一個(gè)任意取代的雜環(huán)體系中，或代表一個(gè)除碳原子之外，還含有一個(gè)或多個(gè)氮原子、硫原子或氧原子的芳雜環(huán)體系，該體系可以被任意取代，
化合物(Ⅰ)中按重量計(jì)至少有70%為S-構(gòu)型，上述氧化過(guò)程是采用2-(R)烷烴作為碳源，在一種適宜的培養(yǎng)基中進(jìn)行的。
20.根據(jù)權(quán)利要求
19的方法，其中R1代表6-甲氧基-2-萘基，該烷烴最好是戊烷、庚烷或壬烷。
21.胃蟲草(CBS267.85)。
22.霉菌27-2，1-2x(CBS256.86)。
23.酵母27-1，Ⅰ2(CBS257.86)。
24.酵母27-2，Ⅱ7(CBS259.86)。
25.酵母22-2，Ⅰ5(CBS258.86)。
專利摘要
提供了式(I)的藥物活性化合物及其可藥用鹽或酯的制法。該化合物是立體有擇的。鹽或酯的例子有堿金屬鹽、堿土金屬鹽或三甲基乙酰酯。式(I)中R1代表一種可任意取代的芳基如苯基、萘基，它可以存在于一個(gè)可任意取代的雜環(huán)體系中，或代表一個(gè)芳雜環(huán)體系，其中除碳原子外還可含一或幾個(gè)氮、硫或氧原子，該體系可被任意取代，該法包括使式 (II)化合物與能立體有擇地氧化化合物(II)的微生物作用形成化合物(I)，化合物(I)中按重量計(jì)至少有70％為S構(gòu)型，如需要可把化合物(I)轉(zhuǎn)變?yōu)榭伤幱玫柠}或酯。
文檔編號(hào)A61K31/33GK86103879SQ86103879
公開日1987年4月8日 申請(qǐng)日期1986年6月7日
發(fā)明者菲利浦·加里思·索馬斯, 羅伯特森·布倫·威廉姆, 瓦茨·彼得·道格拉斯, 馬特查姆·喬治·威廉姆·約翰, 伯托拉·莫羅·阿蒂利奧, 馬爾克斯·阿瑟·弗里德里克, 科格·海茵·希蒙 申請(qǐng)人:吉斯特-布羅卡迪斯公司, 國(guó)際殼牌研究有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan