專利名稱:一種制備二肽和胺的加成化合物的方法
已知蛋白酶不但可催化肽鍵的水解裂解，而且還可催化氨基酸衍生物肽鍵的結(jié)合而形成二肽。德國公開專利2，801，238(美國專利4，165，311、4，256，836和4，436，925號)描述了加成物的制備方法，該化合物一方面是由-N保護(hù)的單氨羧酸酯而另一方面說是由二肽組成，亦即由該單氨羧酸酯及單氨雙羧酸在一酶促酯化反應(yīng)中制備。加成化合物不溶于反應(yīng)介質(zhì)并被提出。但該反應(yīng)的實(shí)際目的不是合成加成化合物而是未保護(hù)的二肽本身。幾種文獻(xiàn)中所描繪的方法，其中包括上述德國公開專利，涉及到分解加成化合物而得到二肽。
出人意外的是，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了在反應(yīng)介質(zhì)中存在胺的情況下，酶促N保護(hù)天冬氨酸與苯丙氨酸甲酯的反應(yīng)中產(chǎn)生的二肽形成了少量可溶性鹽。這個反應(yīng)的產(chǎn)生比按上述德國公開專利所描述的具有L-、D-或D，L-苯丙氨酸甲酯的加成產(chǎn)物的形成還快。
因此，本發(fā)明涉及1.一種新型的具有通式Ⅰ胺的二肽加成化合物，
其中R是氨基保護(hù)基，Y是沒有α羧基或其衍生物的胺。
2.一種制備上述通式Ⅰ化合物的方法，其中R是氨基保護(hù)基，Y是氨基化合物，通過通式Ⅱ化合物
與L-苯丙氨酸甲酯在水介質(zhì)中，以存在蛋白酶及適宜酶活的PH范圍為條件的反應(yīng)，它含有被用作Y的沒有α羧基及其衍生物的胺。
本發(fā)明在下文中將進(jìn)行更詳盡的描述并于權(quán)利要求
書中加以限定。
化學(xué)反應(yīng)由下式表示
很明顯，在這個反應(yīng)中，應(yīng)用一氨基保護(hù)基團(tuán)保護(hù)天冬氨酸的氨基。最好是氨基甲酸乙酯類的基團(tuán)，特別是芐酯基或叔丁氧羰基。
天冬氨酸衍生物能夠作為有機(jī)堿使用，在其存在的情況下，與L-、D-和(或)D，L-苯丙氨酸甲酯，通式為H3-nNR′n的胺類酶促下反應(yīng)，H3-nNR′n中的a)n是1、2或3以及b)R′為相同的或不同的烷、環(huán)烷、芳烷或芳香基團(tuán)，最好具有至多18個碳原子，它們中的至少一個具有至少6個碳原子，它可能表現(xiàn)為2或3個R′基形成一個環(huán)，并在適宜的地方包含氮原子，以及c)它的可溶于水的羧酸或無機(jī)酸鹽。
最適用的化合物是那些R′為相同的或不同的具有6～8個碳原子的烷、環(huán)烷或芳烷基的化合物，或者那些2～3個R′基與氮原子一起形成一個具有多至10個碳原子的飽和或不飽和的環(huán)狀化合物。例如將在下文中提到的苯甲胺、二苯甲胺、雙(氨甲基)苯類，象3-氨基甲芐胺、對氨基苯-2′-乙胺、喹啉和二環(huán)化己胺。此外，也可用通式為NR′4X的季氨鹽代替胺，其中X是酸根。
反應(yīng)也可在緩沖或不緩沖的水性介質(zhì)中進(jìn)行。緩沖液的PH范圍對應(yīng)于酶的活性范圍。0.05～1mol濃度的緩沖液最好，尤其是0.1～0.5mol。天冬氨酸衍生物和苯丙氨酸甲酯相對于反應(yīng)介質(zhì)的重量濃度為1～25%。組分的摩爾比在20∶1～1∶50之間，但最好是5∶1～1∶5之間。過量的苯丙氨酸酯，例如當(dāng)使用外消旋起始物時(shí)用D-酯類，令人驚奇地并沒有干擾，因?yàn)檎缫呀?jīng)發(fā)現(xiàn)了的那樣，與胺的加成反應(yīng)比和過量的苯丙氨酸酯的反應(yīng)快得多。
本發(fā)明中所用的胺能夠以與二肽等摩爾量加入。一般說來，較好的結(jié)果取決于過量的程度，特別是1～50倍，最好是2～5倍摩爾過量。胺可以游離化合物或鹽，尤其是鹽酸鹽或硫酸氫鹽的形式應(yīng)用。
催化該反應(yīng)的酶是蛋白酶或含金屬蛋白酶，例如α-胰凝乳蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、胃蛋白酶或胰蛋白酶，它們可單獨(dú)或混合使用。該反應(yīng)所用酶量在每毫摩爾起始化合物5U-30，000U范圍內(nèi)，最好是50U～10000U。反應(yīng)溫度為4～50℃，最好是35～40℃，并取所用酶的最適PH，一般為PH5～7。保溫時(shí)間2～80小時(shí)，最好是20～30小時(shí)。
本發(fā)明的加成化合物隨后用已知方法降解，從而獲得游離二肽。據(jù)此便可極便利地得到L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯。
本發(fā)明方法使得加成化合物的形成比在前述德國公開專利中所描述的過程產(chǎn)生得更快。而且，將用過的胺作為加成化合物裂解中的無機(jī)酸鹽提出，并與強(qiáng)堿一起從此溶液中游離出來，即可容易地回收加成化合物?？墒牵阎姆椒ㄓ腥毕?，游離苯丙氨酸酯在操作過程中將被水解。
下述實(shí)例將本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)敘述。百分比為重量百分比。
實(shí)例11.79g(8.31mmol)苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽與2.22克(8.31mmol)L-N-芐氧羰基-天冬氨酸加入0.5ml7%氨水溶解于20ml重蒸水及4mlPH6的1mol磷酸鈉緩沖液。隨后，17ml14，7%的二苯胺硫酸氫酯水溶液加于混合液中，用7%氨水調(diào)PH為6。加入1325μ的嗜熱菌蛋白酶后在40℃下保溫24小時(shí)，然后提取出加成化合物沉淀。1μ的嗜熱菌蛋白酶在40℃PH7.5下每分鐘水解1mmolZ-甘氨酰苯丙酰胺。加成產(chǎn)物在從乙酸乙酯，甲醇，己烷的8∶1∶1(V∶V∶V)混合液中重結(jié)晶后的產(chǎn)率為62.5%。
下列分析結(jié)果為進(jìn)一步特征熔點(diǎn)135～137℃元素分析C36H39N3O7(625.72)，C69.3，H6.1，N6.8;
1H-NMR(CDCl3，100MHz)δ＝7.59-7.11(數(shù)個重疊m，24H);
5.03(S，2H，C6H5-CH2-O-CO-NH-);
4.60-4.30(兩個重疊m，2H，-CH2-CH＝)，3.75(S，4H，C6H5-CH2-NH)，3.61(S，3H，-CO2-CH3)，3.49-3.31(兩個重疊m，4H，-CH2-CH＝)ppm旋光度〔α〕25D°＝4.91°(C＝1，甲醇)實(shí)例2按實(shí)例1的方法進(jìn)行，但PH為7。加成物產(chǎn)率為71%。
實(shí)施3
按實(shí)例1的方法進(jìn)行，PH5，加酶后40℃下保溫70小時(shí)。產(chǎn)率為57%。
實(shí)例4按實(shí)例1的方法進(jìn)行，但加入70%17.8ml二苯胺硫酸氫酯(42.25mmol)，4℃保溫70小時(shí)，產(chǎn)率59%。
實(shí)例5按實(shí)例1的方法進(jìn)行，氨基酸衍生物懸浮于16ml重蒸水和8ml 1mol磷酸緩沖液中，加入胺和酶后混合物于50℃下保溫9小時(shí)。產(chǎn)率81%。
實(shí)例6按1法進(jìn)行，但不同的是用等量重蒸水替換所述緩沖液并加入265μ嗜熱菌蛋白酶。產(chǎn)率為58%。
實(shí)例7按1法進(jìn)行，加入5300μ嗜熱菌蛋白酶，反應(yīng)混合液40℃下保溫4小時(shí)。產(chǎn)率為83%。
實(shí)例8開始按1法進(jìn)行，但加入17ml11.5%3-氨基-甲芐胺硫酸單氫酯(0.083mmol)的水溶液取代二苯胺硫酸氫酯。隨后按實(shí)例7法進(jìn)行。從乙酸乙酯、甲醇和戊烷8∶4∶2(V∶V∶V)混合物中重結(jié)晶后加成物產(chǎn)率為21.7%。
下列分析結(jié)果為進(jìn)一步特征熔點(diǎn)116～119℃元素分析C30H36N4O7(564.639)C63.8，H6.4，N9.9.
1H-NMR(d6-DMSO)δ＝7.60-7.09(數(shù)個m，21H，-CO2H，2NH，2NH2)5.00(S，2H，CH2-OCO-NH-);
4.5-4.23(2m，2H，-CH2-CH＝)，
4.00(S，4H，H2N-CH2-C6H5)3.61(S，3H，-CO2CH3)3.45-3.17(二重疊m，4H，-CH2-CH＝)ppm旋光度〔α〕25D°＝5.82°(C＝1，甲醇).
實(shí)例9按1法進(jìn)行，但加入17ml8.6%2-(4-氨基苯)乙胺鹽酸鹽(8.3mmol)水溶液取代二苯胺硫酸氫酯。從乙酸乙酯中重結(jié)晶出來后產(chǎn)率為84%，熔點(diǎn)為122～125℃。
實(shí)例10按1法進(jìn)行，0.179g D、L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽(0.83mmol)取代1.79g L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽，并以二苯胺硫酸氫酯29.4%水溶液的形式加入雙倍量的胺(16.9mmol)。產(chǎn)率為69%。
實(shí)例11.
按1法進(jìn)行，用11.2%喹啉硫酸氫酯水溶液(8.42mmol)取代二苯胺硫酸氫酯。重結(jié)晶后產(chǎn)率67%，熔點(diǎn)127～134℃。
實(shí)例12在實(shí)例1的基礎(chǔ)上進(jìn)行。1.63g(8.35mmol)N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸和1.80g(8.35mmol)L-苯丙氨酸甲酯溶解，加入17ml17.6%二苯胺硫酸氫酯(10.1mmol)水溶液。反應(yīng)混合物在PH7，35℃下保溫40小時(shí)。從乙酸乙酯，甲醇和己烷10∶2∶5(V∶V∶V)混合液中重結(jié)晶后產(chǎn)率為56%，熔點(diǎn)107～112℃。
權(quán)利要求
1.一種用于制備Ⅰ式化合物的方法
其中R是氨基保護(hù)基團(tuán)，Y是胺類，通過R是氨基保護(hù)基團(tuán)的Ⅱ式化合物
與L-苯丙氨酸甲酯在蛋白酶存在的水介質(zhì)中并以蛋白酶活性的PH下反應(yīng)形成，它包含有用作Y的胺，Y不含有α羥基或其衍生物。
2.按權(quán)項(xiàng)1所述方法，其中R為氨基甲酸酯類的保護(hù)基。
3.按權(quán)項(xiàng)1或2所述方法，其中R為芐氧羰基或叔丁氧羰基。
4.按權(quán)項(xiàng)1～3的一個或一個以上所述方法，其中用作Y的胺具有通式H3-nNR′n結(jié)構(gòu)，其中a)n是1、2或3，且b)R′為相同或不同的烷、環(huán)烷、芳烷或芳香基，其中至少一個具有至少6個碳原子，可能2～3個R′基形成環(huán)狀，在適宜時(shí)含有氮原子，以及c)它的可溶于水的無機(jī)酸鹽或羧酸鹽。
5.按權(quán)項(xiàng)1～4的任意一個所述的方法，其中R′為相同的或不同的烷、環(huán)烷或芳烷基團(tuán)，它們有6～8個碳原子，或2～3個R′基與氮原子一起形成一最多具有10個碳原子的飽和環(huán)。
6.按權(quán)項(xiàng)1～5中任意一個所述的方法，其中加入過量的胺。
專利摘要
由N保護(hù)L-天冬氨酸與L-苯丙氨酸甲酯合成的二肽與胺類形成微溶性加成化合物，該化合物可易于從反應(yīng)介質(zhì)中提出。
文檔編號C07K5/00GK86103254SQ86103254
公開日1986年11月26日 申請日期1986年5月13日
發(fā)明者馬丁·普拉坦, 雷霍德·凱勒, 默坦·施林曼 申請人:赫徹斯特股份公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan