本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于唾液富酪蛋白的仿生防齲功能多肽、多肽衍生物或其鹽及其在制藥中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

齲病是一種感染性疾病，也是人類最常見的口腔疾病，發(fā)病率高，流行區(qū)廣，嚴(yán)重影響口腔及全身健康，世界衛(wèi)生組織已將其列為人類重點(diǎn)防治的三大非傳染性疾病之一。齲病的發(fā)病機(jī)制是在口腔致齲菌產(chǎn)酸作用下，牙齒硬組織發(fā)生持續(xù)性脫礦，因此，促進(jìn)脫礦牙體硬組織再礦化是齲病防治的重要方面。

作為經(jīng)典的防齲制劑，氟化物能不同程度地降低人群中的患齲率，被公認(rèn)為目前世界上最有效的防齲制劑。然而隨著多種氟化物制劑使用的推廣，耐氟菌株、氟斑牙、氟骨癥的出現(xiàn)使氟化物防齲局限性日益突顯。洗必泰、四環(huán)素、中藥等利用抑制致齲菌防齲的制劑亦各自表現(xiàn)出不足。不定形磷酸鈣、糖醇、中藥五倍子及隔消山、納米羥磷灰石以及樹脂等的再礦化作用被先后報(bào)道，但由于效果不明顯或?qū)嶒?yàn)結(jié)果不一，目前結(jié)論尚未統(tǒng)一。

針對(duì)上述問題，本領(lǐng)域積極探尋其他的防齲藥物和方法。

借助仿生思想，對(duì)天然牙發(fā)育過程中的調(diào)控因子進(jìn)行仿生，設(shè)計(jì)促礦化功能多肽，或?qū)μ烊环例x成分進(jìn)行仿生，已成為齲病防治的一種新的理想途徑。發(fā)明人在專利cn201310354537.3和cn201310355804.9中基于釉原蛋白的氨基酸序列特征，設(shè)計(jì)并開發(fā)了一系列的小分子防齲多肽，這為發(fā)明人從天然仿生防齲因子角度出發(fā)，進(jìn)一步進(jìn)行仿生防齲研究提供可能、奠定基礎(chǔ)。然而，目前的牙源性仿生防齲功能多肽的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這些多肽的體內(nèi)防齲效果欠佳，提示復(fù)雜的口腔環(huán)境和唾液中的相關(guān)成分可能影響了這些功能多肽的結(jié)構(gòu)和功能。因此，構(gòu)建在口腔內(nèi)兼具防齲功能穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的功能多肽，是目前仿生功能多肽防齲臨床應(yīng)用必需解決的問題。

在齲病的病因?qū)W研究中，除了牙齒本身作為宿主的易感因素外，唾液在齲病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，被認(rèn)為是齲病病因中參與調(diào)控齲病進(jìn)展最重要的宿主因素之一。1912年head首次提出了唾液可使軟化牙釉質(zhì)再次恢復(fù)硬度的假說，隨后pigman等人開始關(guān)注唾液對(duì)牙釉質(zhì)的再礦化功能方面的研究。作為唾液中最有意義的成分，唾液蛋白參與釉質(zhì)表面獲得性膜的形成，對(duì)維持牙面完整性、促進(jìn)已脫礦牙齒再礦化和調(diào)節(jié)口腔菌群具有重要影響。唾液是口腔內(nèi)牙體硬組織緊密接觸的微環(huán)境，唾液中的有機(jī)成分－唾液蛋白的防齲作用被陸續(xù)證實(shí)。其中，唾液富酪蛋白是一種酸性磷酸化蛋白，研究發(fā)現(xiàn)該蛋白可以選擇性吸附到羥基磷灰石表面，吸附鈣磷，并維持鈣磷離子的過飽和狀態(tài)。但是天然唾液蛋白存在著提取困難、價(jià)格昂貴、容易變性等方面的不足，因此，為實(shí)現(xiàn)預(yù)防或阻斷齲病的目的，以唾液蛋白作為天然模板，研發(fā)合成在口腔中穩(wěn)定、具有促礦化功能的仿生防齲功能多肽，具有重要的研究意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的發(fā)明目的在于：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，總結(jié)現(xiàn)有研究成果，創(chuàng)新性的提供一種唾液富酪蛋白仿生防齲功能多肽，該多肽具有分子量小，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，毒副作用小，促進(jìn)早期齲損再礦化效果確切的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種基于唾液富酪蛋白的仿生防齲功能多肽、多肽衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽，所述多肽含有如seqidno.1所示的氨基酸序列：dsseekeeeee。

上述基于唾液富酪蛋白的仿生防齲功能多肽、多肽衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽，所述多肽衍生物為多肽的酰胺化物、磷酸化物或酯化物。

根據(jù)本發(fā)明的一些具體實(shí)施例，上述基于唾液富酪蛋白的仿生防齲功能多肽、多肽衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽，所述多肽衍生物為絲氨酸磷酸化物。

根據(jù)本發(fā)明的一些具體實(shí)施例，上述基于唾液富酪蛋白的仿生防齲功能多肽、多肽衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽，所述多肽衍生物為dpspseekeeeee。

上述基于唾液富酪蛋白的仿生防齲功能多肽、多肽衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽，所述藥學(xué)上可接受的鹽包括但不限于多肽的鹽酸鹽、硫酸鹽、乙酸鹽、甲磺酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、檸檬酸鹽、蘋果酸鹽、有機(jī)胺鹽等。

本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，所述組合物含有上述基于唾液富酪蛋白的仿生防齲功能多肽、多肽衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽，以及合適的藥學(xué)上可接受的載體和/或輔料。

所述藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于無菌液體，如水、或者動(dòng)物、植物或人工合成的油或其混合物，藥用輔料包括但不限于淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽糖、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇、濕潤劑、乳化劑或ph緩沖劑、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。

本發(fā)明上述的藥物組合物可以在現(xiàn)有制劑工藝條件下制備成適宜臨床應(yīng)用的制劑，所述制劑包括液體制劑、固體制劑和半固體制劑，所述液體制劑包括但不限于溶液劑、注射劑，所述固體制劑包括但不限于片劑、膠囊劑，所述半固體制劑包括但不限于軟膏劑、凝膠劑。

最后，本發(fā)明還提供了上述基于唾液富酪蛋白的仿生防齲功能多肽、多肽衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備用于防齲的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的基于唾液富酪蛋白的仿生防齲功能多肽、多肽衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽，所述多肽的制備方法包括以下步驟：按照氨基酸序列，將第一個(gè)氨基酰胺化，用fmoc保護(hù)其氨基，然后連接到固相載體wang樹脂上，然后脫掉氨基保護(hù)基；然后將氨基被fmoc保護(hù)的第二個(gè)氨基酸在縮合劑的活化作用下與已連接在固相載體的第一個(gè)氨基酸的氨基反應(yīng)形成肽鍵；重復(fù)上述肽鍵形成反應(yīng)，使肽鏈從c端向n端生長，直至最后一個(gè)氨基酸接入，切割后得到目標(biāo)多肽。這種合成方法簡(jiǎn)單易行，生產(chǎn)成本低。

本發(fā)明的發(fā)明人通過分析總結(jié)發(fā)現(xiàn)唾液富酪蛋白可通過競(jìng)爭(zhēng)抑制唾液高分子糖蛋白對(duì)羥基磷灰石的吸附作用，進(jìn)而減少了變異鏈球菌對(duì)牙面的粘附，富酪蛋白n端前6位氨基酸序列dpspseek在其對(duì)羥基磷灰石的結(jié)合中發(fā)揮關(guān)鍵作用。作為富酪蛋白的主要結(jié)構(gòu)功能域，dpspseek的功能主要與其帶負(fù)電荷的氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)和α螺旋結(jié)構(gòu)有關(guān)。進(jìn)一步，發(fā)明人通過總結(jié)發(fā)現(xiàn)氨基酸中的基團(tuán)-cooh、-conh2、-oh、-nh2能夠吸附鈣磷離子，進(jìn)而促進(jìn)牙體硬組織礦化，且-cooh基團(tuán)的吸附能力最強(qiáng)，而含有-cooh基團(tuán)的谷氨酸較其他氨基酸有更強(qiáng)的鈣磷吸附能力，且側(cè)鏈基團(tuán)小，因此，本發(fā)明選取富酪蛋白中的dpspseek序列作為羥基磷灰石吸附片段，在此基礎(chǔ)上c端增加富含谷氨酸的親水片段“eeeee”，該親水端可以與鈣磷離子作用并引發(fā)羥基磷灰石成核，發(fā)揮其促礦化功能，從而產(chǎn)生更好的防齲效果。本發(fā)明的多肽與現(xiàn)有技術(shù)的釉原蛋白仿生多肽相比，在口腔中具有更好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和功能穩(wěn)定性，與富酪蛋白相比，分子量小，容易提純，成本低，不易變性。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明的多肽主要包含有唾液富酪蛋白中“dpspseek”的吸附羥基磷灰石功能片段，又包含可以與鈣磷離子作用并誘導(dǎo)羥基磷灰石成核的親水氨基酸序列“eeeee”，經(jīng)過合成，該多肽分子量小，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且簡(jiǎn)單，可提高在牙釉質(zhì)表面的吸附，進(jìn)而發(fā)揮其原位修復(fù)的作用，促進(jìn)脫礦釉質(zhì)的再礦化，且對(duì)體外人口腔角質(zhì)細(xì)胞無毒性，結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定。本發(fā)明合成方便，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，效果較好且安全可靠。

附圖說明

圖1為實(shí)施例3基于唾液富酪蛋白的仿生防齲功能多肽對(duì)羥基磷灰石成核能力的透射電鏡和選區(qū)電子衍射檢測(cè)結(jié)果；

圖2為實(shí)施例4基于唾液富酪蛋白的仿生防齲功能多肽對(duì)脫礦牙釉質(zhì)齲的再礦化作用的的部分結(jié)果，即表面顯微硬度的恢復(fù)情況；

圖3為實(shí)施例4基于唾液富酪蛋白的仿生防齲功能多肽對(duì)脫礦牙釉質(zhì)齲的再礦化作用的的部分結(jié)果，即偏光顯微鏡的檢測(cè)結(jié)果；

圖4為實(shí)施例4基于唾液富酪蛋白的仿生防齲功能多肽對(duì)脫礦牙釉質(zhì)齲的再礦化作用的部分結(jié)果，a：齲損處理前后各組礦物丟失量比較，b：再礦化處理前后各組齲損深度比較；

圖5為實(shí)施例4基于唾液富酪蛋白的仿生防齲功能多肽對(duì)脫礦牙釉質(zhì)齲的再礦化作用的的部分結(jié)果，即再礦化處理前后不同齲損深度礦物質(zhì)含量比較；

圖6為實(shí)施例5基于唾液富酪蛋白的仿生防齲功能多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)檢測(cè)和穩(wěn)定性檢測(cè)的部分結(jié)果；

圖7為實(shí)施例6基于唾液富酪蛋白的仿生防齲功能多肽體外細(xì)胞毒性研究的部分結(jié)果。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的發(fā)明內(nèi)容做進(jìn)一步的闡釋，但不應(yīng)理解為本發(fā)明的范圍僅限于以下的實(shí)例，根據(jù)本發(fā)明的發(fā)明思路和全文內(nèi)容，可以將以下實(shí)例中的各個(gè)技術(shù)特征做適當(dāng)?shù)慕M合/替換/調(diào)整/修改等，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，仍屬于本發(fā)明保護(hù)的范疇。

實(shí)施例1

一種促礦化防齲功能多肽，氨基酸序列如seqidno.1所示；

seqidno.1的絲氨酸磷酸化修飾物為：dpspseekeeeee。

實(shí)施例2seqidno.1的絲氨酸磷酸化修飾物(以下簡(jiǎn)稱de11)的制備

1、選用fmoc-his(trt)-wangresin作為樹脂(載體)；

2、用dcm將樹脂充分溶脹；

3、用適當(dāng)濃度的dblk(六氫吡啶+dmf)，將fmoc-保護(hù)基團(tuán)脫出；

4、用dmf清洗數(shù)遍，洗去dblk；

5、稱取適合的縮合劑和活化劑(hbtu，nmm)以及c端第二個(gè)fmoc-保護(hù)氨基酸(fomc-leu-oh)進(jìn)行偶聯(lián)；

6、茚三酮檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)確保連接比較完全；

7、用dmf清洗幾遍，洗去殘留的各種殘基和活化劑縮合劑；

8、依seqidno.1氨基酸序列進(jìn)行偶聯(lián)，方法參照步驟3-7；

9、將所有的氨基酸連接結(jié)束后采用步驟3，4方法脫去最后的fmoc-保護(hù)基團(tuán)；

10、用tfa切割液裂解，去除樹脂和氨基酸保護(hù)基團(tuán)，得到粗品；

11、送質(zhì)譜確認(rèn)產(chǎn)品正確(分子量1499.18符合理論值)；

12、粗品送純化分離，提高純度。

實(shí)施例3多肽對(duì)羥基磷灰石成核能力的檢測(cè)

1、制備50μm多肽de11溶液，分別加入終濃度為1.6mmna2hpo4和3.3mmcacl2溶液，ph調(diào)為7.4，37℃搖床孵育24h(100轉(zhuǎn)/分)。

2、分別取10μl反應(yīng)后溶液滴加于銅網(wǎng)上，陰性對(duì)照為不加多肽的na2hpo4和cacl2溶液。透射電鏡下觀察銅網(wǎng)上的沉淀物形態(tài)。圖1顯示多肽de11組形成的晶體較陰性對(duì)照組更加致密，呈束狀或柱狀形態(tài)，提示de11具有良好的促進(jìn)羥基磷灰石成核生長的能力。

3、選取電子衍射顯示多肽de11組形成的晶體沉淀物具有羥基磷灰石特征衍射環(huán)004、002和211，且004和002環(huán)的衍射增強(qiáng)，提示在多肽de11的引導(dǎo)下，納米晶體沿c軸生長，見圖1。

實(shí)施例4多肽對(duì)脫礦牙釉質(zhì)再礦化作用的研究

本實(shí)施例通過靜態(tài)再礦化實(shí)驗(yàn)觀察多肽de11對(duì)早期人工釉質(zhì)齲的再礦化作用。

實(shí)驗(yàn)步驟如下：

1、釉質(zhì)樣本的制備：選擇新鮮拔除的牛切牙，制備牛牙釉質(zhì)樣本。流動(dòng)水下，使用三氧化二鋁糊劑去除釉質(zhì)表層染色、牙石以及不規(guī)則形態(tài)表面，去離子水超聲蕩洗20分鐘后貯存于含有0.05％麝香草酚的pbs中，置于4℃冰箱中備用。分離冠根，將冠部牙體組織超聲清洗20分鐘，自然干燥，選取表面平整光滑、無氟斑、無色素、無裂痕的牙冠組織進(jìn)行下一步操作。使用硬組織高速切割機(jī)將牙冠部分切成規(guī)格近約5×5×2mm大小的釉質(zhì)塊，使用拋光機(jī)并依次使用800#-1200#-2400#碳化硅水磨砂紙?jiān)诹魉聦?duì)唇面釉質(zhì)進(jìn)行磨平、拋光，去除約100μm表層釉質(zhì)，以消除表面有機(jī)污染物以及不規(guī)則釉質(zhì)型態(tài)。超聲蕩洗20分鐘后自然干燥，使用環(huán)氧樹脂將牙齒包埋，在釉質(zhì)塊唇面中央通過使用封口膜保留4mm×4mm的開窗區(qū)，開窗區(qū)之外的部位使用抗酸指甲油遮蓋，抗酸指甲油分兩次均勻涂布。通過表面顯微硬度基線篩選出90個(gè)硬度值范圍為340--380khn的釉質(zhì)塊進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)。

2、人工早期釉質(zhì)齲的制備：將牛牙釉質(zhì)樣本按釉質(zhì)開窗區(qū)表面面積與溶液比率為2mm²/1ml在特定體積的脫礦液中脫礦(脫礦液：2.2mmca(no3)2、2.2mmkh2po4、50mmaceticacid、5.0mmnan3、0.5ppmnaf，ph4.5)。磁力攪拌儀攪拌(100轉(zhuǎn)/分)，37℃下脫礦72小時(shí)，在牛牙釉質(zhì)樣本開窗區(qū)形成脫礦早期釉質(zhì)齲。

3、早期釉質(zhì)齲顯微硬度測(cè)定：對(duì)形成早期齲的釉質(zhì)樣本再次進(jìn)行表面顯微硬度值測(cè)定，記作smh1，篩選出30個(gè)表面顯微硬度值范圍為140-220khn的釉質(zhì)塊進(jìn)入下一步的再礦化循環(huán)實(shí)驗(yàn)。將每個(gè)樣本開窗區(qū)的一側(cè)用4×2mm封口膜覆蓋，并涂布抗酸指甲油封閉，以此作為再礦化循環(huán)前的早期釉質(zhì)齲形態(tài)學(xué)對(duì)照。

4、靜態(tài)再礦化實(shí)驗(yàn)：將篩選出的30個(gè)形成了早期齲的釉質(zhì)樣本隨機(jī)分為3組，每組10個(gè)標(biāo)本，按處理不同分為：實(shí)驗(yàn)組：多肽de11組；陰性對(duì)照組：hepes組；陽性對(duì)照組：1000ppmnaf組。37℃條件下，實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本浸泡在50um多肽溶液處理1小時(shí)，陰性對(duì)照組標(biāo)本浸泡在hepes溶液處理1小時(shí)，陽性對(duì)照組標(biāo)本浸泡在naf溶液處理1小時(shí)，各組標(biāo)本經(jīng)雙蒸水沖洗3次后，浸泡在人工唾液中(1.5mmcacl2、0.9mmkh2po4、130mmkcl、1.0mmnan3、20mmhepes，ph7.0)，人工唾液每天更換一次，在37℃密閉恒溫箱內(nèi)，使用磁力攪拌儀攪拌，100轉(zhuǎn)/分。再礦化處理3天后和7天后，所有標(biāo)本室溫下干燥后進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。

5、結(jié)果檢測(cè)指標(biāo)

5.1表面顯微硬度

表面顯微硬度儀各參數(shù)設(shè)置同前，再次測(cè)定再礦化處理后的釉質(zhì)樣本開窗區(qū)表面顯微硬度，每個(gè)釉質(zhì)樣本測(cè)定五個(gè)點(diǎn)，其平均值即該樣本經(jīng)再礦化處理后的表面顯微硬度值，記作smh2。對(duì)三次不同階段即分別為：正常牛牙釉質(zhì)、經(jīng)脫礦形成早期釉質(zhì)齲、體外再礦化處理后的釉質(zhì)樣本進(jìn)行比較，可計(jì)算得出每個(gè)樣本最終的表面顯微硬度恢復(fù)的百分比(smhr％)：smhr％＝(smh2-smh1)/(smh1-smh0)x100％。

5.2偏光顯微鏡及橫斷顯微放射照相

樣本經(jīng)再礦化處理后取出，去離子水沖洗，超聲震蕩20分鐘，自然干燥，使用硬組織切割機(jī)垂直于開窗區(qū)對(duì)釉質(zhì)樣本進(jìn)行表面切片處理，每個(gè)切片包含再礦化處理前后即早期人工齲部分和再礦化循環(huán)處理后兩部分，切片約厚250μm，進(jìn)而使用進(jìn)口打磨砂紙?jiān)趻伖鈾C(jī)流水下將切片打磨成約100μm厚的薄片，最后將使用去離子水清洗后的磨片在經(jīng)水浸漬后用偏光顯微鏡觀察，數(shù)碼圖像由系統(tǒng)專用軟件獲取(nikonact-1forl-1，nikon，日本)。將切片固定于橫斷顯微放射照相的特制載體上，經(jīng)cukx-ray，20kv，20ma的條件下曝光25s，呈像后采用transversalmicroradiographysoftware2006(inspektorresearchsystemsbv,荷蘭)對(duì)圖像進(jìn)行分析，得到樣本齲深，礦物含量的變化。

結(jié)果：再礦化后表面顯微硬度檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，標(biāo)本分別經(jīng)再礦化處理3天和7天后，naf組和多肽組表面顯微硬度值恢復(fù)百分比均顯著高于陰性對(duì)照(p<0.05)。偏光顯微鏡顯示：各組再礦化前制備的人工齲均表現(xiàn)為典型的表層下脫礦，具有負(fù)性雙折射的完整表層和位于表層下呈陽性雙折射的病損體部。再礦化后，naf組及多肽組標(biāo)本齲損表層明顯增厚，且齲損深度變淺，見圖3。橫斷顯微放射照相分析結(jié)果如圖4所示，①體外靜態(tài)再礦化處理前后，hepes組釉質(zhì)樣本的礦物丟失量無明顯變化，而naf組和多肽de11組釉質(zhì)標(biāo)本的礦物丟失量明顯減少，且較體外再礦化處理前有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)，見圖4a；②體外再礦化處理前后，hepes組釉質(zhì)樣本的齲損深度無明顯變化，而naf組和多肽組釉質(zhì)標(biāo)本的齲損深度明顯變淺，且較體外再礦化處理前有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)，見圖4b；③對(duì)經(jīng)體外再礦化處理后各組釉質(zhì)樣本的不同齲損深度的礦物含量分析表明，在齲損表層20μm處naf組和多肽組與hepes組釉質(zhì)樣本礦物含量無明顯差異，在齲損20-150μm處，naf組和多肽組釉質(zhì)樣本的礦物質(zhì)含量明顯高于hepes組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，見圖5。綜上，再礦化實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，該防齲功能多肽具有促進(jìn)脫礦牙釉質(zhì)再礦化的功能。

實(shí)施例5多肽的圓二色光譜分析

目前針對(duì)研究蛋白多肽類藥物的眾多研究表明，蛋白多肽類藥物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性對(duì)其功能發(fā)揮以及遠(yuǎn)期的臨床研究應(yīng)用具有重要意義，且由于本發(fā)明所設(shè)計(jì)合成的功能多肽針對(duì)的是口腔齲病研究領(lǐng)域，因此對(duì)前述設(shè)計(jì)合成的唾液蛋白仿生防齲功能多肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性檢測(cè)尤為必要。圓二色譜檢測(cè)技術(shù)(circulardichroism簡(jiǎn)稱cd)是研究稀溶液中蛋白質(zhì)構(gòu)象的一種快速、簡(jiǎn)單、較準(zhǔn)確的方法。本實(shí)驗(yàn)用于測(cè)量多肽的結(jié)構(gòu)，以驗(yàn)證其設(shè)計(jì)原理的有效性。

實(shí)驗(yàn)儀器

jascoj-1500cdspectrometer(日本)

實(shí)驗(yàn)步驟

25℃條件下，測(cè)量容器透光長度1mm,紫外光波長范圍190nm至240nm。每個(gè)樣品掃描10次取平均值。樣品多肽濃度0.2mg/ml，溶于20mmhepes溶液，分別測(cè)定2h和24h多肽的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。所得數(shù)據(jù)通過公式計(jì)算出摩爾橢圓率繪制圖表如下(圖6)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：圓二色譜結(jié)構(gòu)檢測(cè)結(jié)果表明該多肽具有典型的β折疊/轉(zhuǎn)角的二級(jí)結(jié)構(gòu)，多肽在hepes溶液中2小時(shí)和24小時(shí)檢測(cè)結(jié)果表明隨著多肽在溶液中時(shí)間的延長，其二級(jí)結(jié)構(gòu)無明顯改變，因此，該多肽在24小時(shí)內(nèi)具有較為穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，為其遠(yuǎn)期的臨床應(yīng)用提供了有力保障。

實(shí)施例6多肽的生物安全性檢測(cè)

通過觀察多肽對(duì)人口腔上皮細(xì)胞(humanoralkeratinocytes，hok)活力的影響，檢測(cè)多肽是否具有細(xì)胞毒性。hok的活力通過cellcountingkit-8(cck-8)進(jìn)行測(cè)定。.

具體步驟如下：

1、hoks接種96孔板中，每孔2×10³個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)覆蓋面積大約為50％。使用20％胎牛血清(fbs)dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2、將含有終濃度為50-500μm多肽的培養(yǎng)液加入細(xì)胞中，將多肽處理過的和未處理(陰性對(duì)照)的細(xì)胞在co2培養(yǎng)箱中(5％co2，37℃恒溫)培養(yǎng)24h。未加多肽的細(xì)胞培養(yǎng)基為陰性對(duì)照。

3、按照am-blue試劑盒指導(dǎo)手冊(cè)對(duì)于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞進(jìn)行操作。

4、使用酶標(biāo)儀在450nm處讀取數(shù)值。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，體式顯微鏡下觀察多肽de11組(圖7b)的細(xì)胞形態(tài)和陰性對(duì)照組(圖7a)無明顯差別，圖7c中所得數(shù)據(jù)為每孔內(nèi)液體吸光度，吸光度越高，說明細(xì)胞活性越好，在處理時(shí)間24h后，多肽處理對(duì)細(xì)胞增殖幾乎沒有影響。使用方差分析檢驗(yàn)計(jì)算后，p值均大于0.05，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明多肽處理后對(duì)細(xì)胞活力幾乎無影響。

以上試驗(yàn)例說明本發(fā)明的仿生防齲功能多肽具有良好的促進(jìn)羥基磷灰石成核的能力，并能夠促進(jìn)脫礦牙釉質(zhì)再礦化，降低脫礦牙釉質(zhì)的齲深及礦物丟失；同時(shí)，該多肽具有良好的結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定性，且無明顯細(xì)胞毒性。綜上，該多肽在齲病防治領(lǐng)域具有重要的研究價(jià)值。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明而言僅是說明性的，而非限制性的；本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，在本發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對(duì)其進(jìn)行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。

sequencelisting

<110>四川大學(xué)

<120>基于唾液富酪蛋白的仿生防齲多肽、其衍生物和鹽及應(yīng)用

<130>2017830

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<221>peptide

<222>(1)..(11)

<400>1

aspsersergluglulysglugluglugluglu

1510