本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種重組桿狀病毒樣顆粒，具體來說是一種重組的h9n2亞型禽流感病毒樣顆粒及其制備方法和用途。

背景技術：

接種疫苗是預防禽流感發(fā)生與傳播最有效的手段之一，對提高我國的禽病防制水平，保障我國養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展有十分積極的意義。目前使用的h9n2亞型禽流感疫苗均為滅活疫苗，我國有多個廠家生產(chǎn)的10多株h9n2亞型禽流感系列滅活苗，使用的疫苗株皆為2001年前分離獲得的。近年來，我國h9n2亞型的禽流感病毒分離株的抗原性發(fā)生了很大變化，疫苗毒株升級迫在眉睫。研究發(fā)現(xiàn)，1998年-2006年間的毒株抗原性無變化，疫苗的保護率為100％。而對2009－2010年禽流感的流行病學研究中發(fā)現(xiàn)，h9抗體較高的免疫雞依然攜帶h9n2亞型aiv。表明現(xiàn)有的h9n2亞型aiv滅活疫苗免疫雞只后，盡管能使雞只產(chǎn)生較高的抗體，但已經(jīng)不能有效地保護其免受當前h9n2亞型aiv流行株的攻擊。因此，商品化h9n2亞型aiv滅活疫苗的制備毒株急需更新。

病毒樣顆粒(virus-likeparticle，vlp)疫苗以其安全性和抗病毒的有效性，成為近年研究的熱點。目前，已經(jīng)有乙型肝炎病毒和人類乳頭瘤病毒vlp疫苗上市，并獲得了巨大的經(jīng)濟收益。vlp沒有病毒核酸，不能自主復制，因而其非常安全。vlp在形態(tài)上與真正病毒粒子相同或相似，作為顆粒性抗原可激活樹突狀細胞等抗原提呈細胞，將其提呈給t，b淋巴細胞，從而有效地誘導機體產(chǎn)生有效的免疫保護反應，且具有廣泛的交叉免疫作用，而后者是應對當前流感病毒抗原變異快速的關鍵。呼吸道黏膜不僅是流感病毒的感染部位，也是宿主防御病毒感染的部位，因而黏膜免疫是流感病毒疫苗研究中急需解決的問題?，F(xiàn)有的傳統(tǒng)流感病毒滅活疫苗是無法激發(fā)黏膜免疫。而vlp流感疫苗可通過鼻內吸入，更容易引起黏膜免疫，因而更具廣闊的應用前景。目前，國外學者利用桿狀表達系統(tǒng)平臺，已經(jīng)成功制備了h1n1、h3n2、h5n1、h5n3、h7n1、h7n9、h9n2等vlps。此外，在影響流感vlp形成的關鍵病毒成分研究上，chen等和張樹梅等的結果皆表明，僅流感病毒的ha和na兩個蛋白，即可完成流感vlps的合成和出芽，進一步地奠定了流感病毒vlps疫苗研究的理論基礎。與傳統(tǒng)雞胚培養(yǎng)的方式相比，vlp疫苗還具有反應快速的卓越性。雞胚生產(chǎn)疫苗的技術，至少耗時6-7個月的時間，還常受到雞胚來源不足的制約，難以在短時間內生產(chǎn)足夠的疫苗以滿足潛在流行或大流行的防控需求；產(chǎn)生大量的廢物，這些廢物的處理不僅需要消耗大量的能源，而且也容易造成環(huán)境污染。vlps疫苗技術沒有上述的缺點，且不用分離病毒，只需知道病毒的序列，即可作出快速反應。比如，在h7n9禽流感疫情發(fā)生后一個月左右，美國medicago公司即宣布研發(fā)出h7n9禽流感vlps疫苗。這種在疫情面前高效的疫苗制備技術，對于可能產(chǎn)生巨大經(jīng)濟損失的家禽養(yǎng)殖業(yè)、對于可能失去了成員的家庭、對于人心忐忑的社會具有重要的意義。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術中的上述技術問題，本發(fā)明提供了一種重組的h9n2亞型禽流感病毒樣顆粒及其制備方法和用途，所述的這種重組的h9n2亞型禽流感病毒樣顆粒及其制備方法和用途要解決現(xiàn)有技術中的疫苗對于預防當前h9n2亞型aiv流行株的效果不佳的技術問題。

本發(fā)明提供了一種重組的h9n2亞型禽流感病毒樣顆粒，含有a/chicken/shanghai/06/2015(h9n2)的ha蛋白和na蛋白。

進一步的，所述的編碼ha蛋白的核苷酸序列如seqidno.1所示。

進一步的，所述的編碼na蛋白的核苷酸基因序列如seqidno.2所示。

本發(fā)明還提供了上述的一種重組的h9n2亞型禽流感病毒樣顆粒的制備方法，包括如下步驟：

1)一個設計引物的步驟，根據(jù)a/chicken/shanghai/06/2015(h9n2)的ha基因和na基因，設計引物，所述的ha基因的上游引物序列如seqidno.3所示，所述的ha基因的上游引物序列如seqidno.4所示；所述的na基因的上游引物序列如seqidno.5所示，所述的na基因的上游引物序列如seqidno.6所示；

2)一個將ha和na基因進行擴增的步驟，提取禽流感毒株a/chicken/shanghai/06/2015(h9n2)基因組rna，逆轉錄合成cdna，以其為模板，利用引物ha基因的上游和下游序列、na基因的上游和下游序列進行rt-pcr擴增；

3)將擴增后的ha基因酶切后連接于載體，轉化后，挑取白色菌落，提取質粒，獲得含有ha基因的重組質粒；將擴增后的na基因酶切后連接于含有ha基因的重組質粒，獲得含有ha基因和na基因重組質粒；

4)將含有ha基因和na基因重組質粒的dna在脂質體介導下轉染對數(shù)生長期的sf9細胞，培養(yǎng)后收集細胞上清，收獲同時含有ha蛋白和na蛋白的重組的h9n2亞型禽流感病毒樣顆粒。

進一步的，所述的載體為pfastbacdual，采用大腸桿菌dh5α進行轉化。

本發(fā)明還提供了上述的一種疫苗，含有權利要求1所述的重組的h9n2亞型禽流感病毒樣顆粒。

本發(fā)明利用rt-pcr法從禽流感a/chicken/shanghai/06/2015(h9n2)中擴增ha和na基因片段，并同時亞克隆至桿狀病毒穿梭質粒pfastbacdual中，構建了重組桿狀病毒穿梭質粒，轉染sf9昆蟲細胞，包裝重組桿狀病毒bacmid-ha-na。

通過westernblot法和血凝試驗檢測ha和na蛋白在sf9細胞中的表達；表達的重組蛋白經(jīng)透射電鏡觀察具有病毒樣顆粒(virus-likeparticles，vlps)的形態(tài)結構。結果已成功構建了重組桿狀病毒，該病毒可同時表達ha、na蛋白，2種蛋白可自行組裝成vlps，并分泌至細胞培養(yǎng)上清中，血凝效價可達1∶64。

本發(fā)明和已有技術相比，其技術進步是顯著的。由于目前流行的h9n2流感基因型和抗原性與現(xiàn)有的滅活疫苗存在差異，本發(fā)明構建同時含有禽流感a/chicken/shanghai/06/2015(h9n2)的血凝素(hemagglutinin，ha)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，na)2種基因的重組桿狀病毒，構建的重組桿狀病毒可表達vlps，為禽流感新型疫苗的研制奠定了基礎。

附圖說明

圖1顯示了重組質粒的酶切鑒定結果。

圖2顯示了重組桿粒rbacmid-ha-na的pcr鑒定結果。

圖3顯示了轉染后細胞病變的情況。

圖4顯示了p1、p2、p3代病毒的pcr鑒定結果。

圖5顯示了透射電鏡觀察病毒樣顆粒的形態(tài)。

圖6顯示了重組蛋白表達的鑒定結果，a為vlp和sf9細胞上清的sds-page和westernblot結果；b為vlp血凝試驗效價。

圖7顯示了神經(jīng)氨酸酶的試驗結果。

圖8顯示了在二免后一周用10⁶eid50a/chicken/shanghai/06/2015(h9n2)攻毒，第1、2、3、5天氣管排毒結果，vlp免疫組的排毒滴度均比商業(yè)疫苗(a/chicken/shanghai/f/1998)和pbs對照組低，但是僅在第二天和第三天差異顯著(p＜0.05)。

具體實施方式

實施例1

1.1質粒、菌株及細胞：桿狀病毒穿梭質粒pfast-bacdual、基因工程菌dh10bac[含有桿狀病毒質粒(bacmid)bmon14272、轉座輔助質粒(helperplasmid)pmon7214]均購自invitrogen公司；感受態(tài)大腸桿菌dh5α購自takara；雌性草地貪夜蛾蛹卵巢細胞sf9購自atcc，編號：crl-1711，貨號：4093648。

1.2毒株：禽流感a/chicken/shanghai/06/2015(h9n2)由本實驗室分離保存。(該毒株已在genebank上公開了序列，序列號為genbankku720440和ku720446)。

1.3主要試劑：magpureviralrnakitformagmaxexpress購自美吉公司；primescriptone-steprt-pcrkit，t4dna連接酶，dnamarker，xhoi，kpni，bamhi，ecori，質粒dna提取試劑盒，膠回收試劑盒均購自takara公司；ampicillin，kanamycin，gentamicin，tetracycline，iptg均購自上海生工；lb瓊脂和lb培養(yǎng)基購自oxfoid公司；s.o.c.medium，purelink^tmhipureplasmiddnaminiprepkit，轉染試劑盒cellfectionⅱreagent，sf-900^tmiiisfm，grace’sinsectcellculturemediumunsupplemented，grace’sinsectcellculturemedium(2x)，4％agar均購自invitrogen公司；雞抗a/chicken/shanghai/06/2015(h9n2)抗血清由本實驗室制備；bluo-gal，hrp標記的羊抗雞igy，neuraminidaseassaykit購自sigma公司。禽流感血凝素分型血清(h9)由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。

1.4實驗動物：spf雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司，21日齡spf白色萊航雞，購自中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所。

1.5引物設計及合成

根據(jù)genbank中登錄的a/chicken/shanghai/06/2015(h9n2)的ha基因(ku720440)(seqidno.1)和na基因(ku720446序列)(seqidno.2)，利用primer5.0引物分析軟件設計引物，

序列如下：

hap1(seqidno.3)：

hap2(seqidno.4)：擴增片段大小為1683bp；

nap1(seqidno.5)：

nap2(seqidno.6)：擴增片段大小為1401bp。

斜體帶橫線部分為酶切位點，引物由上海桑尼生物工程技術服務有限公司合成。

1.6ha和na基因的擴增及克隆

提取禽流感毒株a/chicken/shanghai/06/2015(h9n2)基因組rna，逆轉錄合成cdna，以其為模板，利用引物hap1、hap2，nap1、nap2進行rt-pcr擴增。

反應條件：50℃30min；95℃5min；95℃30s，52℃30s，72℃2min，共30個循環(huán)；72℃10min。pcr產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。膠回收目的片段ha和na，ha兩端的酶切位點為xhoi和kpni，na兩端的酶切位點為bamhi和ecori，先后克隆至桿狀病毒穿梭質粒pfast-bacdual中，轉化感受態(tài)大腸桿菌dh5α，挑取陽性克隆，經(jīng)pcr及酶切鑒定，鑒定正確的質粒命名為pfastbacdual-ha-na。

將ha基因(xhoi和kpni)酶切連接于pfastbacdual載體，轉化大腸桿菌dh5α，挑取白色菌落，提取質粒，鑒定(ha約1700bp，圖1)并測序驗證正確，獲得重組質粒pfastbacdual-ha；按照同樣的方法，將na基因(bamhi和ecori)連接于重組質粒pfastbacdual-ha，獲得重組質粒pfastbacdual-ha-na，鑒定(na約1400bp，圖1)并測序驗證正確。

1.7重組桿狀病毒穿梭質粒的構建

將質粒pfast-bacdual-ha-na轉化dh10bac感受態(tài)細胞，經(jīng)卡那霉素(50μg/ml)、四環(huán)素(10μg/ml)和慶大霉素(7μg/ml)篩選重組轉座子bacmid-ha-na，提取質粒，陽性桿粒用puc/m13上下游引物進行pcr擴增，按照說明書操作。

分別提取重組質粒轉化感受態(tài)e.colidh10bac：將重組質粒的濃度稀釋為0.2ng/ul，取5ul重組質粒緩慢加入到感受態(tài)e.colidh10bac中并混勻，冰浴30min后42℃熱激45s，然后將混合物迅速轉移至冰浴中2-3min，加入1mllb培養(yǎng)基，37℃搖床200rpm孵育4h，將擴大培養(yǎng)后的菌液做10^-1、10^-2、10^-3連續(xù)稀釋，從10^-2、10^-3稀釋液中各取200ul涂板，所用平板為含有x-gal、iptg的三抗(7ug/ml慶大霉素、50ug/ml卡那霉素、10ug/ml四環(huán)霉素)固體lb培養(yǎng)基上，37℃溫箱培養(yǎng)36-48h，直到有白斑出現(xiàn)，挑選白斑菌落，加入含三抗(7ug/ml慶大霉素、50ug/ml卡那霉素、10ug/ml四環(huán)霉素)的lb培養(yǎng)基中37℃搖床200rpm培養(yǎng)12h。通過藍白斑進行3輪篩，挑取白色菌落，提取質粒并鑒定(陽性桿粒用puc/m13上下游引物進行pcr擴增可見到5660bp大小的條帶，而陰性則擴增出300bp大小的條帶(見圖2)。重組桿狀病毒基因組dna的提取采用purelink^tmhipureplasmiddnamaxiprepkit，用于下一步轉染。

1.8重組桿狀病毒的包裝

按照昆蟲桿狀病毒bac-to-bac表達系統(tǒng)(invitrogen公司)說明書進行操作，將重組轉座子bacmid-ha-na的dna在脂質體介導下轉染對數(shù)生長期的sf9細胞，收獲同時含有ha和na基因的重組桿狀病毒。

用rbacmid-ha-na轉染sf9昆蟲細胞，在27℃培養(yǎng)，觀察細胞病變，當細胞病變明顯時(圖3)，收集細胞上清(即p1代病毒)，獲得重組桿狀病毒。

將p1代重組病毒接種sf9昆蟲細胞，待細胞病變明顯時，收集細胞上清(即p2代病毒)；依此法，繼續(xù)獲得p3代病毒并用pcr鑒定(圖4)，可以看到p1、p2、p3代細胞上清均能擴出5660bp的條帶，正常細胞上清對照則沒有條帶。

1.9ha和na蛋白在sf9細胞中表達的檢測

1.9.1westernblot

收集重組桿狀病毒感染細胞72h的上清，2000g，30minutes離心，經(jīng)12％sds-page分離，電轉移至硝酸纖維膜上，一抗為抗a/chicken/shanghai/06/2015(h9n2)的雞血清，二抗為hrp標記的羊抗雞igy(1∶1000稀釋)，以正常細胞上清作為陰性對照。

westernblot分析顯示，在相對分子質量約70000和46000處，可見明顯條帶，sf9細胞則無明顯條帶，見圖6a。

1.9.2血凝試驗

收集重組桿狀病毒感染細胞72h的上清，2000g，30minutes離心，操作按gb/t18936-2003進行，以未重組桿狀病毒的細胞上清作為陰性對照。

重組桿狀病毒表達的蛋白具有血凝活性，血凝效價可達1∶64，見圖6b。

1.9.3神經(jīng)氨酸酶試驗

離心后的上清使用neuraminidaseassaykit進行分析，分別以a/chicken/shanghai/06/2015(h9n2)和未重組桿狀病毒的細胞上清作為陽性對照和陰性對照。

vlp神經(jīng)氨酸酶試驗結果為1.9unit/l，a/chicken/shanghai/06/2015(h9n2)結果為2.0unit/l，sf9上清為0詳細結果見圖7?？芍琻a蛋白表達正確。

1.9.4重組蛋白的形態(tài)學觀察

離心后的上清，送華東師范大學進行電鏡檢測。

用透射電鏡觀察顆粒形態(tài)(圖5)，可以觀察到約80nm左右的圓形顆粒。

1.10免疫試驗設計

首先將15只21日齡的spf雞分成3個組，每組5只雞，第一組肌肉注射0.2ml(vlp和佐劑體積比為1:1)vlp疫苗，一免使用完全弗氏佐劑，二免使用不完全弗氏佐劑；第二組免疫商品化滅活疫苗(a/chicken/shanghai/f/1998)，按照說明書一免和二免均肌肉注射0.2ml；第三組為不免疫疫苗只用于攻毒；在免疫前，一免后一周和二免后一周均采血，檢測hi效價。二免后一周在每個免疫組中分別經(jīng)滴鼻點眼途徑，攻毒量10⁶eid50(毒株為a/chicken/shanghai/06/2015(h9n2))。攻毒后第1、2、3、5天采集所有試驗雞的泄殖腔及咽拭子進行eid50測定，數(shù)據(jù)以x±se表示，以spss軟件統(tǒng)計分析。

使用2種不同的毒株(a/chicken/shanghai/10/2001和a/chicken/shanghai/06/2015)作為hi試驗的抗原，發(fā)現(xiàn)免疫前三個免疫組hi效價均為0，vlp疫苗免疫組針對a/chicken/shanghai/06/2015的血凝抑制價在一免和二免后一周均達到1024；而對a/chicken/shanghai/10/2001的血凝抑制價在二免后一周平均值為142.4；商業(yè)疫苗免疫組針對a/chicken/shanghai/06/2015的血凝抑制價在二免后一周平均值為120；而對a/chicken/shanghai/10/2001的血凝抑制價在一免和二免后一周均達到1024；不免疫攻毒組在這2個時間點hi效價均為0，檢測結果詳見表1。攻毒后第1、2、3、5天采集肛喉拭子,檢測到只有喉拭子有排毒(meantiterslog10eid50/0.1ml±sd)，第1、2、3、5天喉拭子排毒結果表明：vlp免疫組的排毒滴度均比商業(yè)疫苗(a/chicken/shanghai/f/1998)和pbs對照組低，但是僅在第二天和第三天差異顯著(p＜0.05)，詳見圖8。

表1疫苗免疫后的抗體反應

由圖8可知，在二免后一周用10⁶eid50a/chicken/shanghai/06/2015(h9n2)攻毒，攻毒后第1、2、3、5天采集肛喉拭子,檢測到只有喉拭子有排毒(meantiterslog10eid50/0.1ml±sd)，第1、2、3、5天喉拭子排毒結果表明：vlp免疫組的排毒滴度均比商業(yè)疫苗(a/chicken/shanghai/f/1998)和pbs對照組低，但是僅在第二天和第三天差異顯著(p＜0.05)。

序列表

<110>上海市動物疫病預防控制中心

<120>一種重組的h9n2亞型禽流感病毒樣顆粒及其制備方法和用途

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1683

<212>dna

<213>ha基因(a/chicken/shanghai/06/2015)

<400>1

atggagacagtatcactaataactatactactagtagcaacagtgagcaatgcagataaa60

atctgcatcggctaccaatcaacaaactccacagaaactgtggacacactaacagaaaac120

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<210>2

<211>1401

<212>dna

<213>na基因(a/chicken/shanghai/06/2015)

<400>2

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tgtctcctcatgcaaattgccatcttaacaacgactatgacattacatttcgggcagaaa120

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tatataaatatggctgattatagcattgagtccagttatgtgtgctcaggacttgttggc960

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agaggggccccaggagtgaaagggtgggcttttgacgacgggaatgatgtttggatggga1080

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atcaacttcatgcctatataa1401

<210>3

<211>30

<212>dna

<213>hap1上游引物(人工序列)

<400>3

aatcctcgagatggagacagtatcactaat30

<210>4

<211>35

<212>dna

<213>hap2下游引物(人工序列)

<400>4

tgcaggtaccttatacacaaatgttgcatctgcaa35

<210>5

<211>30

<212>dna

<213>nap1上游引物(人工序列)

<400>5

agctggatccatgtctccaaatcagaagat30

<210>6

<211>35

<212>dna

<213>nap2下游引物(人工序列)

<400>6

cttagaattcttatataggcatgaagttgatattc35