技術領域：

本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種葉酸受體α特異性結合的短肽及其在腫瘤靶向中的應用。

背景技術：
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噬菌體展示技術是將外源多肽或蛋白與噬菌體的某種衣殼蛋白進行融合表達，使外源蛋白能展示在病毒顆粒表面，同時使編碼外源蛋白的dna位于該病毒粒子內。隨機十二肽噬菌體展示文庫是將隨機十二肽融合到m13噬菌體次要衣殼蛋白(piii)上，為一個組合文庫。所展示的十二肽表達在piii的n末端。這就在大量的隨機多肽與其dna編碼序列之間建立起了直接的橋梁，再用各種靶分子(抗體、酶、細胞表面受體等)來進行體外篩選獲得靶分子結合肽。體外選擇程序簡單來說就是噬菌體庫與固相靶分子共孵育，洗滌去除未結合噬菌體，然后洗脫得到能與靶分子特異性結合的噬菌體。被洗脫的噬菌體還需進行擴增，進行下一輪的結合/擴增循環(huán)，來富集特異性結合噬菌體。經(jīng)3～4輪“淘選”后，通過dna測序可以得到每個特異性結合的多肽序列。

葉酸受體(folatereceptor，fr)是結合并轉運葉酸及其衍生物進入細胞的重要轉運體，在體內主要以三種亞型存在：frα、β和γ。葉酸受體α(folatereceptorα，frα)是一種由糖基化磷脂酰肌醇(gpi)錨定于細胞膜表面的糖蛋白。已有文獻報道，卵巢癌、肺癌、肝癌、乳腺癌等組織中frα呈高表達，而在正常組織中限制性表達，因此被認為是極具潛力的卵巢癌標志物或腫瘤相關抗原(taa)；frα對卵巢癌具有的高度特異性，可作為治療相關腫瘤的靶點；部分研究也表明，frα對于卵巢癌的早期診斷具有重要價值?；诖?，若能得到與frα具有較高親和力的短肽序列，將為腫癌的靶向性治療和診斷提供新思路。

技術實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的

本發(fā)明的目的在于利用噬菌體展示技術獲得一種能與葉酸受體α特異性結合的多肽。該多肽可用于靶向葉酸受體α表達陽性的腫瘤細胞。

技術方案

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術方案如下：

1)噬菌體展示肽庫的親和篩選：以葉酸受體α重組蛋白為靶標，運用噬菌體展示十二肽庫進行四輪生物篩選。每輪篩選檢測回收率和多克隆elisa，以判斷篩選是否有效；通過單克隆elisa檢測各克隆與葉酸受體α重組蛋白的結合能力；

2)噬菌體陽性單克隆dna的制備及測序鑒定：根據(jù)上述elisa結果，選擇陽性值高的噬菌體單克隆，對其進行擴增后進行測序模塊的快速純化以產(chǎn)生足夠純的模板進行測序，選用-96giii測序引物送到公司進行測序，分析陽性噬菌體相應展示肽序列；

3)細胞elisa檢測噬菌體克隆與天然細胞表面葉酸受體α的結合：選取frα表達陽性細胞株skov3，并以frα表達陰性細胞株hepg2為對照，通過elisa檢測噬菌體克隆與細胞株的結合；

4)通過流式細胞術進一步確認噬菌體克隆與frα表達陽性細胞株skov3的結合；

5)運用體內歸巢實驗檢測噬菌體克隆在荷瘤裸鼠體內組織器官的分布情況；

6)合成fitc標記多肽，尾靜脈注射balb/c荷瘤裸鼠，運用成像技術檢測多肽在主要臟器內的分布。

有益效果

本發(fā)明提供的frα結合肽，可特異性結合frα重組蛋白，同時通過細胞elisa及流式細胞術實驗分析，發(fā)現(xiàn)篩選出的噬菌體展示短肽能與細胞表面天然frα特異性結合。通過體內歸巢實驗及動物成像分析，該多肽能有效富集于frα高表達的腫瘤部位，而在其他正常組織中分布較少，具有一定的靶向性。具有潛在的醫(yī)學和藥學價值，為腫瘤的靶向性治療和影像檢測提供一種新的方法。

附圖說明：

圖1.多克隆elisa；

圖2.陽性單克隆與葉酸受體α重組蛋白結合能力的研究。圖2a.單克隆噬菌體elisa篩選陽性克隆(圈出的克隆為葉酸受體α特異性結合肽1展示克隆)；圖2b.陽性單克隆與葉酸受體α重組蛋白結合的進一步驗證；

圖3.細胞elisa檢測篩選到的陽性單克隆與frα表達陽性細胞skov3的結合，以m13以及frα表達陰性細胞hepg2為對照；

圖4.流式細胞術實驗分析陽性單克隆與skov3的特異性結合情況，對照組如圖中虛線所示，僅加入抗m13抗體與fitc熒光抗體的skov3細胞；

圖5.體內歸巢實驗檢測陽性噬菌體在荷瘤裸鼠體內組織器官的分布情況；

圖6.成像技術分析fitc標記多肽在荷瘤裸鼠體內的分布情況。尾靜脈注射fitc多肽2小時后解剖，檢測各器官組織的熒光強度(mfi)。參數(shù)：激發(fā)光：470nm；發(fā)射光：535nm。

具體實施方式：

為了更清楚地闡述本發(fā)明，下述內容提供了較為具體的實施方案，本領域的技術人員應該理解，本發(fā)明并不僅僅限定于下述實施例。

實施例1噬菌體展示肽庫的親和篩選

隨機十二肽噬菌體展示文庫購自neb公司，100μl，滴度為1.5×10¹³pfu/ml。貯存于含50％甘油的tbs緩沖液(50mmtris-hcl，150mmnacl[ph7.5])中，庫容量2.7×10⁹個轉化子。escherichiacoiler2738是此肽庫的宿主菌。

(1)準備工作

將frα重組蛋白用包被緩沖液(碳酸鹽緩沖液[ph9.6])稀釋至終濃度50μg/ml，稀釋后的溶液以每孔100μl包被酶標板，并反復旋轉直至表面完全濕潤。在濕盒中4℃孵育過夜。

(2)親和篩選

第二天倒掉酶標板中的包被液，用tbst緩沖液(tbs+體積比0.1％[v/v]tween-20)洗板，傾去緩沖液，在干凈的吸水紙上拍甩以除去殘余的液體。之后在每孔中加入200μl封阻液(0.1mnahco3，5mg/mlbsa，0.02％nan3[ph8.6])，置濕盒中4℃孵育過夜或是37℃孵育至少1小時。棄去封阻液，每孔加滿tbst緩沖液，洗板6次，每次洗滌5分鐘，置于脫色搖床上進行。再傾去緩沖液，在干凈的吸水紙上拍甩以除去殘余的液體，執(zhí)行此實驗步驟時要快速以避免孔板干燥。用tbst緩沖液稀釋原始文庫，取稀釋后的文庫液100μl加入到預先包被frα重組蛋白的酶標板微孔內，加入噬菌體數(shù)量約為5×1012。在濕盒中4℃孵育過夜或37℃孵育2小時，棄去孔內液體，將酶標板倒置拍甩除去殘余溶液，并用tbst緩沖液洗板10次，操作同前(洗去未結合的噬菌體)。最后一遍洗滌后，將孔內液體拍甩干凈，向酶標板微孔中加入100μl非特異性緩沖液如0.2m甘氨酸-鹽酸glycine-hcl緩沖液[ph2.2]來洗脫已結合的噬菌體，于室溫條件下，脫色搖床上溫和搖動10分鐘以充分洗脫，再用15μl1mtris-hcl[ph9.1]中和上述洗脫液，轉移到一個干凈的ep管中。按常規(guī)m13方法取5μl洗脫液用來測定洗脫物的滴度，剩余洗脫液均加入到20ml處于對數(shù)前期的er2738菌種中進行第一輪噬菌體洗脫物的擴增，于37℃，220rpm搖床培養(yǎng)4.5小時，擴增產(chǎn)物轉移到干凈離心管中，經(jīng)4℃，10,000rpm離心10分鐘操作后，取約80％的噬菌體上清，轉移到另一干凈離心管中，加入1/6體積的peg/nacl(20％[w/v]peg-800，2.5mnacl)，4℃放置至少1小時或過夜處理，進行噬菌體沉淀。4℃，10,000rpm離心10分鐘，用微量移液器棄去殘余上清，可再進行短暫離心以徹底吸棄上清。沉淀物重懸于200μltbs緩沖液中，再次離心后取上清，轉移到干凈的離心管中，此即為擴增后的洗脫物。取5μl洗脫物進行噬菌體滴度的測定。其余部分用于第二輪親和篩選。重復以上步驟共進行四輪篩選。逐輪篩選增加洗滌步驟中tbst的洗滌次數(shù)。

(3)噬菌體滴度的測定

接種er2738菌種于10mllb培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)至對數(shù)中期(od600在0.5左右)。期間將上層瓊脂于微波爐中加熱溶解，分裝到5ml滅菌ep管中，每管3ml，管數(shù)根據(jù)噬菌體稀釋梯度而定，每個稀釋梯度一管即可。分裝的ep管置于45℃水浴鍋中備用；同時準備lb/iptg/xgal培養(yǎng)平板，置于37℃培養(yǎng)箱備用。對收集的噬菌體上清用lb培養(yǎng)基進行10倍梯度稀釋(一般擴增的噬菌體稀釋范圍：10⁸～10¹¹)。稀釋完成后將處于對數(shù)中期的er2738菌液分裝到若干個1.5ml滅菌ep管中，每管200μl。將稀釋好的各個梯度的稀釋物取10μl立即加到含菌液的ep管中，振蕩混勻后于37℃孵育5分鐘。隨后將45℃放置的上層瓊脂取出，管中內容物立即全部轉移到上層瓊脂中，快速顛倒混勻后傾倒在已預溫過的lb/iptg/xgal培養(yǎng)平板上，輕輕晃動平板使上層瓊脂均勻分布。待冷卻凝固一段時間后，37℃倒置培養(yǎng)過夜。選取噬菌斑總數(shù)在100個左右的平板，計數(shù)平板上長出來的噬菌斑數(shù)目并計算出噬菌體效價(pfu)。根據(jù)每輪投入篩選的噬菌體量(輸入滴度input)與洗脫得到的噬菌體量(輸出滴度output)，可計算每輪的產(chǎn)出/投入比，反映特異性噬菌體的富集程度(回收率recovery)。經(jīng)過四輪篩選發(fā)現(xiàn)，與frα重組蛋白特異性結合的高親和力的噬菌體得到了有效富集(見表1)。

表1每輪輸入滴度、輸出滴度與回收率的情況

實施例2噬菌體多克隆elisa鑒定

將frα重組蛋白用碳酸鹽緩沖液[ph9.6]稀釋至終濃度10μg/ml，每孔包被100μl，4℃包被過夜。隔天棄去靶分子溶液，并在干凈的吸水紙上拍甩去除殘余液體，扣干，用tbs緩沖液洗滌一次后，每孔加入200μl封阻液，37℃放置1～2小時。甩出封阻液，tbs緩沖液洗滌3次，每次5分鐘，在干凈的吸水紙上用力拍打，甩凈洗滌液。洗滌完在每孔中加入100μl稀釋的每一輪篩選擴增后的洗脫液(即噬菌體上清)，37℃孵育2小時后棄去孔內液體，并用tbst緩沖液和tbs緩沖液依次洗滌3次，每次5分鐘，拍甩除去洗滌液后加入hrp標記的小鼠抗m13抗體作為二抗(用封阻液稀釋到工作濃度)，37℃孵育2小時，棄去孔內液體，洗滌操作同上一操作。每孔加入100μltmb底物液進行顯色，室溫避光孵育10分鐘，孔內液體應由無色變?yōu)樗{色；每孔加入50μl1mh2so4終止液，終止顯色反應，在酶標儀上檢測od450值。

結果表明，隨著篩選輪數(shù)增加，洗脫物與frα重組蛋白結合的親和力逐步增加，但在第四輪時親和力有所下降(見圖1)。

實施例3噬菌體單克隆的elisa鑒定及測序鑒定

(1)elisa檢測單克隆噬菌體展示短肽對靶分子的結合能力

待測噬菌體的獲?。盒杼崆敖臃Ner2738菌種，37℃培養(yǎng)至對數(shù)前期，將此對數(shù)前期培養(yǎng)物轉移到2ml深孔板中，每孔600μl。選擇四輪篩選中用于檢測滴度的平板(總量在100個左右及以下的噬菌斑的平板)，用槍頭隨機挑取多個藍色噬菌斑至深孔板中，37℃，220rpm搖床培養(yǎng)4.5小時。4℃，10,000rpm離心10分鐘，棄去沉淀，每孔取100μl上清用于elisa檢測，其余上清收集起來暫4℃保存。

elisa檢測：以終濃度10μg/ml將靶分子frα重組蛋白溶于碳酸鹽緩沖液[ph9.6]中，每孔包被100μl，在密封的濕盒中4℃包被過夜。甩出多余靶分子溶液，并在干凈的紙巾上拍甩除去多余的液體后，每孔加200μl封閉液，37℃封閉1～2小時。甩出封阻液，tbst洗滌6次，拍甩干凈酶標板后，將深孔板中獲得的100μl上清按順序依次加入，室溫反應1～2小時，再用tbst洗滌6次(操作同上)，用封阻液按1∶10000比例稀釋hrp標記的抗m13抗體，按每孔100μl加入孔中，室溫反應1～2小時，tbst充分洗滌6次(步驟同上)，每孔加入100μltmb底物液(現(xiàn)配現(xiàn)用)顯色，避光作用10分鐘后每孔再加入50μl1mh2so4終止液，終止顯色反應，在酶標儀上檢測od450值。

結果見圖2。圖2a為初步檢測結果(圖2a所圈出的克隆為葉酸受體α特異性結合肽1展示克隆)，單獨挑取該克隆，經(jīng)過進一步elisa實驗驗證其與frα重組蛋白的結合能力(圖2b)，其中pbs作為空白對照，實驗組與pbs對照組比較有顯著差異(p＜0.05)。

(2)噬菌體陽性單克隆dna的制備及測序鑒定

根據(jù)上述elisa結果，選取陽性噬菌體單克隆進行擴增后再進行測序模塊的快速純化以產(chǎn)生足夠純的模板進行測序：將er2738過夜培養(yǎng)物按照1∶100接種于lb培養(yǎng)基中振搖到對數(shù)期后，分裝1ml到培養(yǎng)管中。取10μl噬菌體陽性克隆到上述1ml培養(yǎng)管中。37℃搖床培養(yǎng)4.5～5小時。培養(yǎng)物轉入微量離心管中，離心30秒。上清轉入一個干凈離心管，此即為擴增噬菌體貯液，若不立即進行接下去的實驗，可暫4℃貯存。

測序模板的快速純化：取上述收集的含噬菌體上清(體積約1ml)，加入400μlpeg/nacl，顛倒混勻，室溫放置10分鐘后12,000rpm離心10分鐘，棄上清，可再進行離心操作，徹底吸棄殘余上清。沉淀物中加入200μl碘化物緩沖液(10mmtris-hcl，1mmedta，4mnai[ph8.0])并徹底重懸沉淀物，再加入500μl乙醇，室溫孵育10分鐘(使dna沉淀)；12,000rpm離心10分鐘，棄上清。用1ml預冷的70％乙醇清洗沉淀一次后12,000rpm離心10分鐘，棄上清后開蓋過夜風干，使乙醇充分揮發(fā)。最后將沉淀重懸于30μl雙蒸水中，此即為測序模板，取5μl用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測合格后的dna選用-96giii測序引物送到公司進行測序，分析噬菌體相應的12肽序列。

通過比對，申請人獲得了一條短肽seqidno.1：mhtapgwgyrls。

實施例4細胞elisa檢測噬菌體展示短肽與細胞的結合

為驗證篩選出來的多肽與細胞表面表達的天然狀態(tài)下frα的結合情況，選取高表達frα的卵巢癌細胞skov3，并設置無關的肝癌細胞hepg2為對照，進行細胞elisa。skov3細胞和hepg2細胞培養(yǎng)至細胞密度達80％以上，在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)良好，經(jīng)0.25％胰酶消化后加入相應的新鮮培養(yǎng)基重懸并進行活細胞計數(shù)，調整細胞密度至2×10⁵個/ml，按每孔100μl鋪96孔細胞培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)過夜。隔天吸棄上清，用無菌pbs緩沖液(137mmnacl，2.7mmkcl，10mmna2hpo4，2mmkh2po4[ph7.4])輕柔洗滌兩次，每次5分鐘，室溫下用10％多聚甲醛固定15分鐘，吸棄固定液，并用pbs緩沖液輕柔洗板3次，每次5分鐘，以5％脫脂牛奶(pbs稀釋)作為封閉液37℃封閉2小時。棄封閉液，pbs可做簡單漂洗后，將對應的噬菌體適當稀釋后加入細胞培養(yǎng)板中，設置一組陰性對照(野生型m13)，每孔100μl，4℃孵育過夜。隔天吸棄上清，并用pbst(pbs+體積比0.1％[v/v]tween-20)、pbs緩沖液依次洗滌3次，每次5分鐘。再加入用封閉液稀釋到工作濃度(1∶10000)的hrp標記的抗m13抗體，每孔100μl，37℃孵育2小時，同上進行洗滌操作后，顯色反應與終止反應同噬菌體elisa步驟。

結果如圖3。與野生型m13相比，實驗組多肽與skov3有較好的結合，且相比于與hepg2的結合，具有明顯的特異性(p＜0.05)，說明篩選得到的frα結合肽與腫瘤細胞表面表達的天然frα可發(fā)生特異性結合。

實施例5流式檢測噬菌體展示短肽與細胞表面frα的結合情況

實驗目的同細胞elisa實驗。利用流式細胞術檢測篩選出來的陽性噬菌體單克隆對skov3腫瘤細胞的結合情況。

細胞處理：skov3細胞培養(yǎng)至細胞密度達80％以上，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)良好，經(jīng)0.25％胰酶消化，加入新鮮培養(yǎng)基終止消化作用，1,500rpm離心5分鐘，pbs重懸制備單細胞懸液，進行活細胞計數(shù)，調整細胞濃度至1～2×10⁶個/ml，分裝到1.5mlep管中，每管250μl～350μl。3,000rpm離心5分鐘后，每管加入100μl稀釋好的噬菌體上清作為一抗(稀釋液為2％fbs-pbs)，選擇與合成的多肽相對應的噬菌體上清，4℃孵育1小時后，取出3,000rpm離心5分鐘，棄上清，每管加1mlpbs洗滌2～3次，吸棄上清。加入100μl稀釋好的鼠源抗m13二抗，4℃放置1小時，取出同上操作進行洗滌，最后加入帶fitc標簽的羊抗鼠熒光二抗，按1∶500稀釋比用2％fbs-pbs稀釋，每孔100μl，注意此步驟需避光操作。4℃避光孵育1小時，洗滌步驟同上，最后一遍洗滌完后根據(jù)細胞沉淀加入適量體積的pbs重懸，上流式細胞儀進行檢測。

結果顯示，見圖4，合成的多肽能較好地與frα高表達的細胞株發(fā)生特異性結合，結合率可達51.2％。

實施例6體內歸巢實驗檢測噬菌體展示短肽在荷瘤裸鼠體內組織的分布

本實驗需在超凈臺下操作，動物實驗手術器械均需消毒滅菌后使用。選擇6～7周齡，體重20～25g之間的spf級balb/c雌性裸鼠，通過皮下注射方式對其進行植瘤操作，選擇鼠左側腋下(近心端)進行操作，每只裸鼠注射2×10⁶個skov3細胞。待瘤體積長到一定大小，進行體內歸巢實驗。

將擴增后的噬菌體200μl，2×10¹¹pfu，以尾靜脈注射的方式注入荷瘤裸鼠體內，經(jīng)過15～30分鐘充分循環(huán)，用10％水合氯醛以100mg/kg劑量腹腔注射麻醉，75％酒精棉擦拭裸鼠消毒。橫膈水平切開皮膚，使胸腔完全暴露，切斷胸骨，操作時避免損傷心臟及周邊大血管，充分暴露心臟后采用心臟灌注技術，在右心耳部位用手術剪剪開一個小口，將靜脈針穿刺入左心室，可觀察到針頭處有回流的血液后，緩慢推入無菌pbs，血液將從右心耳剪口處流出，待裸鼠實質性臟器發(fā)白即可停止灌注。剝取裸鼠部分腫瘤及組織器官并稱重，在組織勻漿器中研磨，加入1mlrmpi1640-pi溶液(1mlrmpi1640培養(yǎng)基中加入1mm蛋白酶抑制劑、20μg/ml抑肽酶及1μg/ml亮肽酶，pmsf現(xiàn)用現(xiàn)加，終濃度0.1mm)。將勻漿組織轉移到2mlep管中，加入rmpi1640-pi+1％bsa溶液進行非特異性洗滌，在渦旋振蕩器上渦旋10秒以充分洗滌，4000rpm離心5分鐘，共洗滌4～5次，隨后進行噬菌體的洗脫。加入1ml0.2m甘氨酸-鹽酸glycine-hcl緩沖液[ph2.2]，于室溫在脫色搖床上溫和搖動10分鐘以充分洗脫，再加100μl1mtris-hcl[ph9.1]中和上述洗脫液，4000rpm離心5分鐘，上清轉移至新的ep管中。取10μl洗脫液進行滴度的檢測，具體操作同前。設置m13噬菌體對照組。計算各器官單位重量的噬菌體數(shù)量。

結果如圖5所示，可以看出，該噬菌體在腫瘤部位富集，與其他正常組織相比有顯著性差異，且與m13對照組相比也有顯著差異。

實施例7通過活體成像儀觀察fitc標記多肽在荷瘤裸鼠器官組織中的分布

將這條多肽序列送至吉爾生化(上海)有限公司合成fitc標簽多肽，純度在95％以上。

選擇6～7周齡，體重20～25g之間的spf級balb/c雌性裸鼠，通過皮下注射方式對其進行植瘤操作，選擇鼠左側腋下(近心端)進行操作，每只裸鼠注射5×10⁶個skov3細胞。待瘤體積長到一定大小，通過尾靜脈注射將100μl2mg/mlfitc標記的合成多肽(無菌pbs稀釋)注入裸鼠體內，注意避光操作。待2小時后拉頸處死，剖離各個器官，利用成像儀觀察多肽在裸鼠各器官組織的熒光強度。

根據(jù)得到的mfi(平均熒光強度)發(fā)現(xiàn)，腫瘤部位熒光強度最強，肝部位次之，其次依次是腎，在心、肺及卵巢組織中幾乎無熒光強度。(見圖6)。