【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明涉及植物硒蛋白的提取領(lǐng)域，特別涉及一種從富硒大米中提取植物硒蛋白的方法。

背景技術(shù)：

硒是人和動物的必需微量元素之一，硒可以提高免疫力，能加速免疫球蛋白及抗體產(chǎn)生。保護心血管與心肌，降低心血管病與心絞痛的發(fā)生率。在抗氧化抗衰老與抗癌防癌等方面有多種作用，并具有降低重金屬毒害等特殊生理功能。被國內(nèi)外科學(xué)家們譽為人類“抗癌之王、長壽元素、生命的火種、天然解毒劑、心臟守護神”。

硒可分為有機硒和無機硒，無機硒主要以硒酸鹽、亞硒酸鹽為主，占硒總量的8％，一般具有較強的毒性。有機硒可分為大分子硒和小分子硒化物，占硒總量的80％以上，一般以硒代氨基酸和硒蛋白的形式存在，在生物體內(nèi)發(fā)揮作用的主要是有機硒化物。在植物體內(nèi)，硒積聚能力較強的植物硒結(jié)合蛋白較少，所以硒可能作為含硫氨基酸代謝中間產(chǎn)物類似物存在。在非積聚植物中，硒與蛋白質(zhì)往往比較多，而且主要以硒代蛋氨酸存在，也有硒代半胱氨酸存在。研究發(fā)現(xiàn)在水稻硒蛋白中存在著兩種硒結(jié)合態(tài)：硒代氨基酸和硒代半胱氨酸。

大米的成分有脂類、水分、淀粉和蛋白質(zhì)，其中淀粉和蛋白質(zhì)大米的兩大主要成分，其含量分別約為62-86％和9-15％之間。按蛋白溶解性的不同,大米蛋白質(zhì)可分為4種類型：水溶性白蛋白、鹽溶性球蛋白、堿溶性谷蛋白和醇溶蛋白。其中谷蛋白和醇溶蛋白為主要成分，各自占69％和11.5％，清蛋白和球蛋白各占9％和10.5％。硒蛋白中的硒主要以硒代甲硫氨酸存在，要準確檢測其中硒含量，必須找到合適的硒蛋白提取方法，提取出硒蛋白。

目前硒蛋白主要提取方法有溶劑提取法、柱分離技術(shù)、生物學(xué)方法、輔助提取技術(shù)等。溶劑提取法由于其高效率和低成本收到廣泛推廣，但是同時也存在著硒蛋白流失嚴重的問題，因此，研究一種具有高效提取硒蛋白的方法具有廣闊的市場推廣價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種從富硒大米中提取植物硒蛋白的方法，本發(fā)明先對富硒大米進行前處理，將富硒大米經(jīng)過酸性溶液浸泡后再進行酶解；然后在在遠紅外線照射的條件下進行浸提處理；最后通過在冰丙醇在低溫環(huán)境下，輔助以超聲波進行沉淀處理。本發(fā)明提取的植物硒蛋白具有粒徑小且提取率高的優(yōu)點，具有廣大的市場推廣價值。

為達到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種從富硒大米中提取植物硒蛋白的方法，包括以下步驟：

(1)前處理：按重量份數(shù)計，將200份富硒大米放在1000份酸性溶液中浸泡4～6h后，研磨成漿，加入1～3份淀粉酶制劑后，在25～35℃下酶解10～15h，然后在40～50℃下液化3～6h，得到酶解后的漿液；

(2)浸提處理：按重量份數(shù)計，將100份酶解后的漿液和1000～3000份浸提液混合后，放入水浴振蕩器中，輔以遠紅外線照射處理，在水浴溫度為20～60℃、振蕩速度為60～200r/min的條件下水浴振蕩1～6h，然后放入離心機中，在25℃下以3000～5000r/min的轉(zhuǎn)速離心15～22min，所得上清液即為蛋白液；

(3)沉淀處理：使蛋白液處于冰浴條件下，以1～3ml/min的速度加入4倍于蛋白液體積的冰丙酮后，置于-27～-17℃的環(huán)境中，在超聲波的聲能密度為10～18w/ml的輔助處理條件下放置3～5h以進行硒蛋白沉淀，然后在2～5℃下以10000～20000r/min的速度離心10～15min，最后取出沉淀物并進行噴霧干燥后，得到硒蛋白成品。

在本發(fā)明中，作為進一步說明，步驟(1)所述的淀粉酶制劑由下述方法制備：按重量份數(shù)計，將100份鮮玉米和100～130份去離子水混合后，放入反應(yīng)器中，進行均質(zhì)處理后，通入以0.01～0.02ml/min的速率通入一氧化碳氣體10～20min，以5000～8000r/min的速度離心5～10min，取上層清液并調(diào)節(jié)ph值至5～6.5，加入100～200份酶蛋白沉淀劑進行沉淀，靜置6～8h后，將沉淀物進行干燥處理，得到淀粉酶制劑。

在本發(fā)明中，作為進一步說明，所述的酶蛋白沉淀劑為乙醇、甲醇和丙酮中的任意一種。

在本發(fā)明中，作為進一步說明，步驟(1)所述的酸性溶液為質(zhì)量分數(shù)為2～4％的醋酸溶液或質(zhì)量分數(shù)為0.5～1％的鹽酸溶液。

在本發(fā)明中，作為進一步說明，步驟(2)所述的遠紅外線照射處理的條件：功率為200～400w，照射距離為10～20cm。

在本發(fā)明中，作為進一步說明，步驟(3)所述的超聲波的頻率為30000～40000hz。

部分原料的功能介紹如下：

富硒大米，在本發(fā)明中用作制備植物硒蛋白的原料。

冰丙酮，為處于零度以下的丙酮，在本發(fā)明中用于沉淀植物硒蛋白的用劑。

鮮玉米，在本發(fā)明中用作制備淀粉酶制劑的主要原料。

一氧化碳氣體，在本發(fā)明中用于和能量代謝類蛋白質(zhì)相結(jié)合，達到提高酶蛋白含量的效果。

乙醇、甲醇和丙酮，在本發(fā)明中用作酶蛋白質(zhì)沉淀劑的主要來源。

醋酸和鹽酸，在本發(fā)明中用作酸性溶液的主要來源。

本發(fā)明具有以下有益效果：

1.本發(fā)明能夠高效制備富硒大米植物硒蛋白。本發(fā)明以富硒大米為原料，通過酸性溶液浸泡的技術(shù)手段，使富硒大米的組織結(jié)構(gòu)在酸性條件下變得松散，有利于后續(xù)植物硒蛋白的浸提步驟的進行；然后通過研磨成漿的技術(shù)手段，使富硒大米的外部結(jié)構(gòu)能夠初步被打破，植物硒蛋白的保護層被打破，促進植物硒蛋白浸提步驟的進行；最后采用在淀粉酶制劑進行酶解的技術(shù)手段，使?jié){液中的淀粉進行酶解，提高了植物硒蛋白在漿液中的含量，有利于后續(xù)的浸提步驟的進行。本發(fā)明所采用的各個技術(shù)手段相互作用、相互配合、層層遞進，能夠共同促進后續(xù)的浸提處理的進行，提高了提取效率，所產(chǎn)生的總體效果遠遠高于單個技術(shù)手段所產(chǎn)生的效果的簡單加和。

2.本發(fā)明在對酶解后的漿液采取遠紅外線輔助處理的技術(shù)手段，能夠提高植物硒蛋白的提取率。本發(fā)明采用在遠紅外線的輔助照射的條件下進行浸提處理，通過遠紅外線的熱照射，使溶劑中的大分子水團能夠吸收熱量而劇烈振動，活化成小分子水團，進而促使?jié){液中的植物硒蛋白能夠更容易被浸提入溶劑中，有利于提高植物硒蛋白的提取率。

3.本發(fā)明采用在超聲波處理的條件下，使用冰丙酮在-27～-17℃的低溫環(huán)境中對植物硒蛋白進行沉淀，不僅能高效的沉淀植物硒蛋白，還可以使植物硒蛋白的粒徑變小，進而有利于人體吸收。一方面，本發(fā)明采用冰丙酮沉淀植物硒蛋白的技術(shù)手段，避免了常溫下丙酮會使蛋白質(zhì)變質(zhì)的現(xiàn)象的發(fā)生，保障了所提取的植物硒蛋白品質(zhì)的穩(wěn)定。另一方面，本發(fā)明還采用了超聲波輔助處理的技術(shù)手段，在超聲條件下，植物硒蛋白與丙酮的接觸面積增加，在超聲波的振動下，植物硒蛋白也隨之不斷振動，避免了植物硒蛋白團聚現(xiàn)象的發(fā)生，進而降低了植物硒蛋白的粒徑，有利于人體的吸收。

4.本發(fā)明制備淀粉酶制劑的工藝能夠高效制備酶解淀粉。本發(fā)明以鮮玉米為原料，先通過均質(zhì)處理，使玉米內(nèi)包覆的淀粉、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)能夠被釋放出來，有利于后續(xù)的浸提步驟的進行；然后采用通入一氧化碳氣體的技術(shù)手段，使一氧化碳氣體和能量代謝類蛋白質(zhì)相結(jié)合，促進溶液體系中能量代謝率蛋白質(zhì)的溶出，提高了溶液體系中酶蛋白的含量，有利于后續(xù)沉淀步驟的進行；最后在酸性條件下，使用酶蛋白沉淀劑對淀粉酶進行沉淀，能夠高效、單一和有選擇性地對淀粉酶進行沉淀，高效制備淀粉酶制劑。本發(fā)明所采用的各個技術(shù)手段相互配合、環(huán)環(huán)相扣，所產(chǎn)生的總體效果遠遠高于單個技術(shù)手段所產(chǎn)生的效果。

【具體實施方式】

實施例1：

1.前期準備：

淀粉酶制劑的制備：按重量份數(shù)計，將100份鮮玉米和100份去離子水混合后，放入反應(yīng)器中，進行均質(zhì)處理后，通入以0.01ml/min的速率通入一氧化碳氣體10min，以5000r/min的速度離心5min，取上層清液并調(diào)節(jié)ph值至5，加入100份乙醇進行沉淀，靜置6h后，將沉淀物進行干燥處理，得到淀粉酶制劑。

將上述前期制備而得的物質(zhì)用于下述從富硒大米中提取植物硒蛋白的方法上。

2.一種從富硒大米中提取植物硒蛋白的方法，包括以下步驟：

(1)前處理：按重量份數(shù)計，將200份富硒大米放在1000份質(zhì)量分數(shù)為2％的醋酸溶液中浸泡4h后，研磨成漿，加入1份淀粉酶制劑后，在25℃下酶解10h，然后在40℃下液化3h，得到酶解后的漿液；

(2)浸提處理：按重量份數(shù)計，將100份酶解后的漿液和1000份浸提液混合后，放入水浴振蕩器中，輔以遠紅外線照射處理，其中紅外線的使用功率為200w，照射距離為10cm，在水浴溫度為20℃、振蕩速度為60r/min的條件下水浴振蕩1h，然后放入離心機中，在25℃下以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min，所得上清液即為蛋白液；

(3)沉淀處理：使蛋白液處于冰浴條件下，以1ml/min的速度加入4倍于蛋白液體積的冰丙酮后，置于-27℃的環(huán)境中，在超聲波的聲能密度為10w/ml、頻率為30000hz的輔助處理條件下放置3h以進行硒蛋白沉淀，然后在2℃下以10000r/min的速度離心10min，最后取出沉淀物并進行噴霧干燥后，得到硒蛋白成品。

實施例2：

1.前期準備：

淀粉酶制劑的制備：按重量份數(shù)計，將100份鮮玉米和105份去離子水混合后，放入反應(yīng)器中，進行均質(zhì)處理后，通入以0.012ml/min的速率通入一氧化碳氣體13min，以6000r/min的速度離心6min，取上層清液并調(diào)節(jié)ph值至5.5，加入140份丙酮進行沉淀，靜置6.5h后，將沉淀物進行干燥處理，得到淀粉酶制劑。

將上述前期制備而得的物質(zhì)用于下述從富硒大米中提取植物硒蛋白的方法上。

2.一種從富硒大米中提取植物硒蛋白的方法，包括以下步驟：

(1)前處理：按重量份數(shù)計，將200份富硒大米放在1000份質(zhì)量分數(shù)為2.5％的醋酸溶液中浸泡5h后，研磨成漿，加入2份淀粉酶制劑后，在28℃下酶解13h，然后在44℃下液化4h，得到酶解后的漿液；

(2)浸提處理：按重量份數(shù)計，將100份酶解后的漿液和1500份浸提液混合后，放入水浴振蕩器中，輔以遠紅外線照射處理，其中紅外線的使用功率為280w，照射距離為14cm，在水浴溫度為30℃、振蕩速度為100r/min的條件下水浴振蕩2h，然后放入離心機中，在25℃下以3400r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，所得上清液即為蛋白液；

(3)沉淀處理：使蛋白液處于冰浴條件下，以1.5ml/min的速度加入4倍于蛋白液體積的冰丙酮后，置于-25℃的環(huán)境中，在超聲波的聲能密度為13w/ml、頻率為33000hz的輔助處理條件下放置4h以進行硒蛋白沉淀，然后在3℃下以17000r/min的速度離心11min，最后取出沉淀物并進行噴霧干燥后，得到硒蛋白成品。

實施例3：

1.前期準備：

淀粉酶制劑的制備：按重量份數(shù)計，將100份鮮玉米和110份去離子水混合后，放入反應(yīng)器中，進行均質(zhì)處理后，通入以0.015ml/min的速率通入一氧化碳氣體14min，以6000r/min的速度離心7min，取上層清液并調(diào)節(jié)ph值至6，加入190份甲醇進行沉淀，靜置7h后，將沉淀物進行干燥處理，得到淀粉酶制劑。

將上述前期制備而得的物質(zhì)用于下述從富硒大米中提取植物硒蛋白的方法上。

2.一種從富硒大米中提取植物硒蛋白的方法，包括以下步驟：

(1)前處理：按重量份數(shù)計，將200份富硒大米放在1000份質(zhì)量分數(shù)為4％的醋酸溶液中浸泡4.5h后，研磨成漿，加入2份淀粉酶制劑后，在29℃下酶解13h，然后在42℃下液化5h，得到酶解后的漿液；

(2)浸提處理：按重量份數(shù)計，將100份酶解后的漿液和2000份浸提液混合后，放入水浴振蕩器中，輔以遠紅外線照射處理，其中紅外線的使用功率為300w，照射距離為15cm，在水浴溫度為30℃、振蕩速度為90r/min的條件下水浴振蕩5h，然后放入離心機中，在25℃下以3800r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，所得上清液即為蛋白液；

(3)沉淀處理：使蛋白液處于冰浴條件下，以1.5ml/min的速度加入4倍于蛋白液體積的冰丙酮后，置于-20℃的環(huán)境中，在超聲波的聲能密度為14w/ml、頻率為36000hz的輔助處理條件下放置4h以進行硒蛋白沉淀，然后在3℃下以16000r/min的速度離心12min，最后取出沉淀物并進行噴霧干燥后，得到硒蛋白成品。

實施例4：

1.前期準備：

淀粉酶制劑的制備：按重量份數(shù)計，將100份鮮玉米和120份去離子水混合后，放入反應(yīng)器中，進行均質(zhì)處理后，通入以0.016ml/min的速率通入一氧化碳氣體14min，以7000r/min的速度離心7min，取上層清液并調(diào)節(jié)ph值至6.3，加入150份甲醇進行沉淀，靜置6.5h后，將沉淀物進行干燥處理，得到淀粉酶制劑。

將上述前期制備而得的物質(zhì)用于下述從富硒大米中提取植物硒蛋白的方法上。

2.一種從富硒大米中提取植物硒蛋白的方法，包括以下步驟：

(1)前處理：按重量份數(shù)計，將200份富硒大米放在1000份質(zhì)量分數(shù)為0.5％的鹽酸溶液中浸泡5.5h后，研磨成漿，加入1.5份淀粉酶制劑后，在33℃下酶解13h，然后在44℃下液化5h，得到酶解后的漿液；

(2)浸提處理：按重量份數(shù)計，將100份酶解后的漿液和2400份浸提液混合后，放入水浴振蕩器中，輔以遠紅外線照射處理，其中紅外線的使用功率為330w，照射距離為17cm，在水浴溫度為50℃、振蕩速度為150r/min的條件下水浴振蕩3h，然后放入離心機中，在25℃下以4500r/min的轉(zhuǎn)速離心21min，所得上清液即為蛋白液；

(3)沉淀處理：使蛋白液處于冰浴條件下，以2ml/min的速度加入4倍于蛋白液體積的冰丙酮后，置于-22℃的環(huán)境中，在超聲波的聲能密度為14w/ml、頻率為34000hz的輔助處理條件下放置4h以進行硒蛋白沉淀，然后在4℃下以12000r/min的速度離心13min，最后取出沉淀物并進行噴霧干燥后，得到硒蛋白成品。

實施例5：

1.前期準備：

淀粉酶制劑的制備：按重量份數(shù)計，將100份鮮玉米和125份去離子水混合后，放入反應(yīng)器中，進行均質(zhì)處理后，通入以0.013ml/min的速率通入一氧化碳氣體14min，以7500r/min的速度離心7min，取上層清液并調(diào)節(jié)ph值至6.1，加入140份乙醇進行沉淀，靜置7.5h后，將沉淀物進行干燥處理，得到淀粉酶制劑。

將上述前期制備而得的物質(zhì)用于下述從富硒大米中提取植物硒蛋白的方法上。

2.一種從富硒大米中提取植物硒蛋白的方法，包括以下步驟：

(1)前處理：按重量份數(shù)計，將200份富硒大米放在1000份質(zhì)量分數(shù)為0.7％的鹽酸溶液中浸泡5.5h后，研磨成漿，加入2份淀粉酶制劑后，在29℃下酶解11h，然后在47℃下液化5.5h，得到酶解后的漿液；

(2)浸提處理：按重量份數(shù)計，將100份酶解后的漿液和2500份浸提液混合后，放入水浴振蕩器中，輔以遠紅外線照射處理，其中紅外線的使用功率為300w，照射距離為18cm，在水浴溫度為50℃、振蕩速度為140r/min的條件下水浴振蕩4h，然后放入離心機中，在25℃下以4200r/min的轉(zhuǎn)速離心18min，所得上清液即為蛋白液；

(3)沉淀處理：使蛋白液處于冰浴條件下，以2ml/min的速度加入4倍于蛋白液體積的冰丙酮后，置于-19℃的環(huán)境中，在超聲波的聲能密度為16w/ml、頻率為36000hz的輔助處理條件下放置4.5h以進行硒蛋白沉淀，然后在3℃下以18000r/min的速度離心11min，最后取出沉淀物并進行噴霧干燥后，得到硒蛋白成品。

實施例6：

1.前期準備：

淀粉酶制劑的制備：按重量份數(shù)計，將100份鮮玉米和130份去離子水混合后，放入反應(yīng)器中，進行均質(zhì)處理后，通入以0.02ml/min的速率通入一氧化碳氣體20min，以8000r/min的速度離心10min，取上層清液并調(diào)節(jié)ph值至6.5，加入200份丙酮進行沉淀，靜置8h后，將沉淀物進行干燥處理，得到淀粉酶制劑。

將上述前期制備而得的物質(zhì)用于下述從富硒大米中提取植物硒蛋白的方法上。

2.一種從富硒大米中提取植物硒蛋白的方法，包括以下步驟：

(1)前處理：按重量份數(shù)計，將200份富硒大米放在1000份質(zhì)量分數(shù)為4％的醋酸溶液或質(zhì)量分數(shù)為1％的鹽酸溶液中浸泡6h后，研磨成漿，加入3份淀粉酶制劑后，在35℃下酶解15h，然后在50℃下液化6h，得到酶解后的漿液；

(2)浸提處理：按重量份數(shù)計，將100份酶解后的漿液和3000份浸提液混合后，放入水浴振蕩器中，輔以遠紅外線照射處理，其中紅外線的使用功率為400w，照射距離為20cm，在水浴溫度為60℃、振蕩速度為200r/min的條件下水浴振蕩6h，然后放入離心機中，在25℃下以5000r/min的轉(zhuǎn)速離心22min，所得上清液即為蛋白液；

(3)沉淀處理：使蛋白液處于冰浴條件下，以3ml/min的速度加入4倍于蛋白液體積的冰丙酮后，置于-17℃的環(huán)境中，在超聲波的聲能密度為18w/ml、頻率為40000hz的輔助處理條件下放置5h以進行硒蛋白沉淀，然后在5℃下以20000r/min的速度離心15min，最后取出沉淀物并進行噴霧干燥后，得到硒蛋白成品。

對比例1：從富硒大米中提取植物硒蛋白的過程中所采用的原料與實施例1基本相同，不同點在于：步驟(1)中沒有采用酶解的技術(shù)手段。

對比例2：從富硒大米中提取植物硒蛋白的過程中所采用的原料與實施例1基本相同，不同點在于：步驟(2)沒有采用遠紅外線照射處理。

對比例3：從富硒大米中提取植物硒蛋白的過程中所采用的原料與實施例1基本相同，不同點在于：步驟(3)沒有采用超聲波輔助處理。

對比例4：從富硒大米中提取植物硒蛋白的過程中所采用的原料與實施例1基本相同，不同點在于：步驟(3)采用的丙酮沉淀是在常溫條件下進行的。

對比試驗1：將對比例1-4與實施例1-6的方法提取植物硒蛋白，計算植物硒蛋白的提取率，檢測結(jié)果見表1。

對比試驗2：將對比例1-4與實施例1-6的方法提取植物硒蛋白，采用x射線衍射法，波長為0.05～0.25nm的條件下檢測植物硒蛋白的粒徑，檢測結(jié)果見表1。

表1：

表1的結(jié)果表明：提取率越高，說明從富硒大米中提取植物硒蛋白效率越高。對比例1的提取率最低，實施例3的提取率最高，說明通過酶解富硒大米，能夠達到高效提取植物硒蛋白的效果；

植物硒蛋白的粒徑越小，植物硒蛋白越容易被人體吸收。對比例3的提取率最低，實施例4的提取率最高，說明通過采用超聲波輔助處理，能夠達到降低植物硒蛋白粒徑的效果。

上述說明是針對本發(fā)明較佳可行實施例的詳細說明，但實施例并非用以限定本發(fā)明的專利申請范圍，凡本發(fā)明所提示的技術(shù)精神下所完成的同等變化或修飾變更，均應(yīng)屬于本發(fā)明所涵蓋專利范圍。