本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種三萜類成分和制備方法以及在缺血性心臟病治療的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著我國人口老齡化速度與工作節(jié)奏加快，冠心病、心絞痛、急性心肌梗死及心律失常等缺血性心臟病已成為嚴(yán)重危害老年人群與亞健康工作人群的一類高發(fā)病。在這些缺血性心臟病發(fā)展過程中多伴有心肌細(xì)胞損傷，進(jìn)而發(fā)生細(xì)胞凋亡、鈣超載等，引起心血管功能紊亂。本發(fā)明前期從闊葉黃檀(dalbergialatifolia)中首次分離得到三萜類化學(xué)成分3-o-α-l-吡喃阿拉伯糖基-28-o-β-d-吡喃葡萄糖基坡摸酸酯的基礎(chǔ)上，證明其可通過減少自由基對細(xì)胞損傷從而保護(hù)心肌，達(dá)到治療缺血性心臟病的目的。然而，到目前為止，該植物三萜類化學(xué)成分研究，僅有β-谷甾醇和乙酰齊墩果酸兩個成分報道，加之，該類成分在抗缺血性心臟病相關(guān)藥理學(xué)研究方面尚未見報道。本發(fā)明可為今后開發(fā)抗缺血性心臟病藥物及闊葉黃檀植物資源的綜合利用提供依據(jù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對上述技術(shù)現(xiàn)狀和存在問題，本發(fā)明的目的是提供一種三萜類成分和制備方法以及在缺血性心臟病治療的應(yīng)用以及在缺血性心臟病治療的應(yīng)用，為闊葉黃檀植物資源高效利用與該成分抗缺血性心臟病的應(yīng)用提供支持。

為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種三萜類成分，其特征是，其成分為：3-o-α-l-吡喃阿拉伯糖基-28-o-β-d-吡喃葡萄糖基坡摸酸酯；其化學(xué)式為：

上述的三萜類成分的制備方法，其特征是，其制備方法及步驟為：

(1)取闊葉黃檀心材，粉碎，用50％～70％乙醇加熱回流提取1～5次，每次1～5h，合并提取液，回收溶劑，濃縮至無醇味，得浸膏；

(2)加適量水于浸膏中分散，得到混懸液，用石油醚萃取，回收溶劑，分別得到石油醚萃取部位；

(3)石油醚萃取部位經(jīng)硅膠柱色譜，用石油醚–乙酸乙酯梯度洗脫，得到12個流分，即frs.1-12；

(4)fr.9經(jīng)凝膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇洗脫，得到5個流分，即fr.9.a-e；

(5)將fr.9.b流分經(jīng)凝膠柱色譜純化得到化合物:3-o-α-l-吡喃阿拉伯糖基-28-o-β-d-吡喃葡萄糖基坡摸酸酯。

其核磁數(shù)據(jù)如下：

化合物黃色粉末，esi-msm/z:734.20[m+h]+。¹h-nmr(600mhz，cdcl3)δ3.13(1h，dd，j＝11.5，4.1hz，h-3)，1.98(2h，m，h-11)，5.30(1h，t，j＝5.9hz，h-12)，2.58(1h，dd，j＝13.3，9.3hz，h-16a)，0.97(3h，s，h-23)，0.77(3h，s，h-24)，1.03(3h，s，h-25)，0.83(3hs，h-26)，1.31(3h，s，h-27)，1.19(3h，s，h-29)，0.93(3h，d，j＝5.3hz，h-31)，4.27(1h，d，j＝6.7hz，h-arabinose-1')，3.52(1h，dd，j＝9.4，4.4hz，h-arabinose-3')，3.81(1h，dd，j＝19.2，6.9hz，h-arabinose-5'a)，3.52(1h，dd，j＝9.4，4.4hz，h-arabinose-5'b)，5.33(1h，d，j＝8.1hz，h-glucose-1')，3.33(1h，ddd，j＝11.8，5.2，4.4hz，h-glucose-5')，3.81(1h，dd，j＝19.2，6.9hz，h-glucose-6'a)，3.66(1h，dd，j＝12.0，3.8hz，h-glucose-6'b)；

¹³c-nmr(151mhz，cdcl3)δ38.76(c-1)，5.64(c-2)，89.40(c-3)，39.82(c-4)，55.57(c-5)，18.03(c-6)，32.70(c-7)，41.17(c-8)，36.42(c-10)，23.25(c-11)，128.31(c-12)，138.10(c-13)，41.49(c-14)，28.24(c-15)，25.62(c-16)，53.50(c-18)，71.37(c-19)，41.49(c-20)，25.64(c-21)，38.42(c-22)，27.15(c-23)，15.57(c-24)，14.57(c-25)，16.17(c-26)，23.29(c-27)，177.21(c-28)，25.77(c-29)，15.20(c-30)，105.72(3-arabinose，c-1')，72.25(c-2`)，72.87(c-3')，68.11(c-4')，65.00(c-5')，94.33(28-glucose，c-1')，72.39(c-2')，76.79(c-3')，69.63(c-4')，77.13(c-5')，60.94(c-6')。

進(jìn)一步地，本發(fā)明還特別對上述的三萜類成分在治療缺血性心臟病的應(yīng)用進(jìn)行了研究和實(shí)驗驗證，主要通過該成分對結(jié)扎左冠狀動脈所致心肌缺血大鼠的影響的實(shí)驗驗證，證明該成分對心肌缺血損傷心肌具有顯著的保護(hù)作用，治療缺血性心臟病應(yīng)用效果明顯。

具體藥效試驗如下：

(一)對大鼠h9c2心肌細(xì)胞缺氧損傷的影響

1.實(shí)驗方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)

體外培養(yǎng)h9c2心肌細(xì)胞，培養(yǎng)液為dmem(高糖)+10％fbs+0.1％雙抗。取對數(shù)生長期的細(xì)胞置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，恒溫培養(yǎng)36h后，分組處理。

1.2缺氧模型制備

取培養(yǎng)72h的h9c2心肌細(xì)胞去掉原培養(yǎng)基，換用無糖無血清dmem培養(yǎng)基后放入缺氧箱，充入混合氣體(5％co2+95％n2)，調(diào)節(jié)氧濃度為0以達(dá)到缺氧，將缺氧箱放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3分組處理

①正常組:培養(yǎng)板用pbs沖洗2次后換用高糖無胎牛血清的dmem培養(yǎng)液，置于37℃5％co2培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)16h。

②缺氧模型組：用pbs沖洗2次后換用無糖無胎牛血清的dmem培養(yǎng)液，放入缺氧箱中充入混合氣體(5％co2+95％n2)，調(diào)節(jié)氧濃度為0以達(dá)到缺氧，將缺氧箱放入37℃培養(yǎng)箱中密閉培養(yǎng)16h。

③給藥組：將含該成分的培養(yǎng)基(終濃度為50、10、2g·ml^-1)作用2h，用pbs沖洗2次后換用無糖無胎牛血清的dmem培養(yǎng)液配制的不同濃度的藥物及陽性藥n-乙酰半胱氨酸(0.08g·ml^-1)，放入缺氧箱中充入混合氣體(5％co2+95％n2)，調(diào)節(jié)氧濃度為0以達(dá)到缺氧，將缺氧箱放入37℃培養(yǎng)箱中密閉培養(yǎng)16h。

1.4指標(biāo)測定

①采用mts法測定細(xì)胞活力

②乳酸脫氫酶(ldh)活力測定：取各組樣本細(xì)胞培養(yǎng)液上清液，按照試劑盒操作說明書，在490nm處測定乳酸脫氫酶(ldh)的活性。

2.實(shí)驗結(jié)果

如表1-1，1-2所示，細(xì)胞缺氧16h后，與正常組比較，缺氧模型組存活率明顯降低，ldh漏出量明顯升高；藥物的2、10、50g·ml^-1提高了細(xì)胞存活率，有顯著差異，其余濃度沒有統(tǒng)計學(xué)意義。以上結(jié)果提示該藥物對細(xì)胞缺氧損傷具有保護(hù)作用。

表1-1對缺氧導(dǎo)致h9c2心肌細(xì)胞存活率的影響

表1-2對缺氧導(dǎo)致h9c2心肌細(xì)胞ldh活性的影響

注：與模型組比較，^**p<0.01,^***p<0.001

(二)對結(jié)扎左冠狀動脈所致心肌缺血大鼠的影響

1.實(shí)驗方法

1.1分組

sd大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、藥物低劑量(10mg·kg^-1)組、中劑量(20mg·kg^-1)組、高劑量(40mg·kg^-1)組，每組6只，各組實(shí)驗當(dāng)天各給一次藥，空白組和模型組腹腔注射等容量的生理鹽水。

1.2模型建立

給藥前大鼠禁食12h，不禁水。給藥15min后，用20％烏拉坦(0.6ml/100g)對大鼠進(jìn)行麻醉后，固定于恒溫(37℃)鼠解剖臺上。將針狀電極插入四肢皮下后導(dǎo)入power-lab多通道生理記錄儀描記心電圖。于環(huán)狀軟骨下1-2mm處剪開氣管，接動物呼吸機(jī)(頻率：90次·min^-1,吸呼比為1：1.5)；剪斷第3～5肋，撐開胸腔，鑷子撕開心包膜，充分暴露心臟并穩(wěn)定5min；用穿有5/0縫合線的小圓針從左心耳下緣2mm出進(jìn)針，垂直于左前降支由肺動脈錐旁出針，進(jìn)針深度控制在1.5mm左右，寬度為1.5～2mm，結(jié)扎左冠狀動脈前降支后迅速關(guān)閉胸腔，空白組只穿線不結(jié)扎。冠狀動脈結(jié)扎成功標(biāo)志:結(jié)扎線遠(yuǎn)端心肌顏色發(fā)紺，心電圖表現(xiàn)為s-t段抬高和(或)t波高聳。造模3h,由腹腔取血，測定血清酶的含量。缺血后，迅速開胸取心臟并染色。

1.3觀察指標(biāo)

(1)心肌梗死面積：3h后迅速開胸取心臟，用冷pbs溶液沖洗余血，保鮮膜包裹于-80℃冷凍15min，將心臟平行切成2mm厚切片；心臟切片放入1％ttc溶液中，置于37℃水浴中避光染色15min，將染色后的心臟切片于10％福爾馬林溶液中固定24h；濾紙吸干心臟切片表面福爾馬林溶液，按順序稱重，計算心肌梗死范圍。

(2)血清酶的檢測：3h后腹主動脈取血，分離血清。用相應(yīng)的試劑盒分別測定測定乳酸脫氫酶(ldh)含量、肌酸激酶(ck)含量和谷草轉(zhuǎn)氨酶(ast)含量。

2.實(shí)驗結(jié)果

2.1心肌梗死面積測定結(jié)果

與空白組比較，模型組心肌梗死面積具有極顯著差異(p<0.001)。與模型組比較，給藥高劑量組可明顯減少了心肌缺血大鼠心肌梗死面積(p<0.05)，結(jié)果表明：該藥物對心肌缺血損傷大鼠心肌具有顯著的保護(hù)作用。

表1-3對心肌缺血梗死范圍的影響

注：與空白組比較，^###p<0.001,與模型組比較，^*p<0.05

2.2乳酸脫氫酶(ldh)、肌酸激酶(ck)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(ast)含量的測定結(jié)果

與空白組比較，模型組ldh，ck及ast均顯著升高。與模型組比較，給藥高劑量組均可減少ldh漏出(p<0.05)、ck含量(p<0.05)及ast的含量(p<0.05)，結(jié)果表明：該藥物對心肌缺血損傷大鼠心肌具有顯著的保護(hù)作用。

表1-4對心肌缺血損傷大鼠ldh、ck和ast含量的影響

注：與空白組比較，^#p<0.05,^##p<0.01,^###p<0.001；與模型組比較，^*p<0.05。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的三萜類成分和制備方法具有成分富集效率高，節(jié)約藥材，方法明晰簡單等特點(diǎn)，同時該成分對于治療缺血性心臟病有顯著效果。

附圖說明

圖1為3-o-α-l-吡喃阿拉伯糖基-28-o-β-d-吡喃葡萄糖基坡摸酸酯核磁共振氫譜。

圖2為3-o-α-l-吡喃阿拉伯糖基-28-o-β-d-吡喃葡萄糖基坡摸酸酯核磁共振碳譜。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。

一種三萜類成分，其成分為：3-o-α-l-吡喃阿拉伯糖基-28-o-β-d-吡喃葡萄糖基坡摸酸酯；其化學(xué)式為：

上述的三萜類成分的制備方法，其制備方法及步驟為：

(1)取闊葉黃檀心材50.0kg，粉碎，用50％～70％乙醇加熱回流提取1～5次，每次1～5h，合并提取液，回收溶劑，濃縮至無醇味，得浸膏4.5kg；

(2)加適量水于浸膏中分散，得到混懸液，用石油醚萃取，回收溶劑，分別得到石油醚萃取部位；

(3)石油醚萃取部位經(jīng)硅膠柱色譜，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，得到12個流分，即frs.1-12；

(4)fr.9經(jīng)凝膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇洗脫，得到5個流分，即fr.9.a-e；

(5)將fr.9.b流分經(jīng)凝膠柱色譜純化得到化合物:3-o-α-l-吡喃阿拉伯糖基-28-o-β-d-吡喃葡萄糖基坡摸酸酯。

以上僅僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施方式，根據(jù)本發(fā)明的上述構(gòu)思，本領(lǐng)域的熟練人員對此發(fā)明作出的各種修改和改變均屬于本發(fā)明的實(shí)質(zhì)。