本發(fā)明涉及基因技術(shù)，尤其涉及一種促進(jìn)羅漢果ugt84a21基因表達(dá)的方法。

背景技術(shù)：

羅漢果甜苷v屬于葫蘆烷型四環(huán)三萜類物質(zhì)，羅漢果甜苷v生物合成的前體物質(zhì)是異戊烯二磷酸(ipp)和3,3-二甲基烯內(nèi)基焦磷酸(dmapp)，二者是通過甲羥戊酸(mva)和甲基赤蘚糖醇磷酸化(mep)兩條途徑形成，mva途徑發(fā)生在胞質(zhì)中，mep途徑發(fā)生在質(zhì)體中。來源于上述兩途徑的ipp或dmapp經(jīng)牻牛兒基焦磷酸合酶(gps)催化形成牻牛兒基焦磷酸(gpp)，ipp與gpp在法呢基焦磷酸合酶(fps)的催化作用下進(jìn)而形成法呢基焦磷酸(fpp)，然后經(jīng)角鯊烯合酶(ss)、角鯊烯環(huán)氧化酶(se)的催化形成2,3-氧化角鯊烯，葫蘆二烯醇合酶(cs)進(jìn)一步催化形成葫蘆二烯醇，最后在cyp450酶和葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(ugt)的作用下，形成羅漢果甜苷v。

異戊二烯類物質(zhì)的產(chǎn)生受到限速酶活性的嚴(yán)格調(diào)控，一直被認(rèn)為在其生物合成途徑中起著重要的調(diào)控作用。作為異戊二烯途徑中的限速酶，ugt基因的表達(dá)對(duì)羅漢果甜苷v的生物合成起著決定性作用。過表達(dá)ugt基因，可以促進(jìn)羅漢果甜苷v的積累；相反，如果抑制ugt基因的表達(dá)，羅漢果甜苷v的產(chǎn)量將顯著降低。現(xiàn)有技術(shù)中未見有促進(jìn)羅漢果ugt84a21基因表達(dá)的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述技術(shù)問題，本發(fā)明設(shè)計(jì)開發(fā)了一種促進(jìn)羅漢果ugt84a21基因表達(dá)的方法。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：

一種促進(jìn)羅漢果ugt84a21基因表達(dá)的方法，包括：

步驟一、羅漢果組培苗接種在含有茉莉酸甲酯的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中，茉莉酸甲酯在固體培養(yǎng)基中的濃度為50-400μmol/l；

步驟二、栽培所述步驟一培養(yǎng)得到的羅漢果植株，在栽培期間，將濃度為50-400μmol/l的茉莉酸甲酯噴灑于授粉后20-30d的羅漢果表面，至表面滴水為止，早、中、晚各噴灑一次，連續(xù)噴施5d；并且在每次噴灑茉莉酸甲酯的乙醇溶液時(shí)，預(yù)先將茉莉酸甲酯的乙醇溶液降溫至8℃；每次噴灑茉莉酸甲酯的乙醇溶液之前，先向羅漢果表面噴水霧，水霧溫度為10℃，每次噴灑茉莉酸甲酯的乙醇溶液之后，再向羅漢果表面噴水霧，水霧溫度為15℃，之后通風(fēng)。

優(yōu)選的是，所述的促進(jìn)羅漢果ugt84a21基因表達(dá)的方法中，所述步驟一中，所述培養(yǎng)條件為：相對(duì)濕度60-66％、光照強(qiáng)度1400lux，光照時(shí)間8h/d，溫度21-25℃條件下培養(yǎng)30d。

優(yōu)選的是，所述的促進(jìn)羅漢果ugt84a21基因表達(dá)的方法中，所述的固體培養(yǎng)基配比為ms+6-ba1.5mg/l，iba0.3mg/l，瓊脂3.5g/l，蔗糖30g/l，活性炭1.0g/l。

優(yōu)選的是，所述的促進(jìn)羅漢果ugt84a21基因表達(dá)的方法中，所述步驟一中，所述含有茉莉酸甲酯的固體培養(yǎng)基通過以下方式制備得到：用體積百分比濃度為2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成10000μmol/l的茉莉酸甲酯母液，并用0.22μm的微孔濾膜滅菌，將滅菌后的茉莉酸甲酯母液添加到固體培養(yǎng)基中，至茉莉酸甲酯的最終濃度為50-400μmol/l，將固體培養(yǎng)基滅菌并冷卻至24-26℃。

優(yōu)選的是，所述的促進(jìn)羅漢果ugt84a21基因表達(dá)的方法，還包括：

步驟三、利用qrt-pcr檢測(cè)所述步驟二栽培得到的羅漢果果實(shí)中的ugt84a21基因表達(dá)。

優(yōu)選的是，所述的促進(jìn)羅漢果ugt84a21基因表達(dá)的方法中，所述步驟三中，采用改良trizol法提取羅漢果果實(shí)總rna。

本發(fā)明通過在羅漢果組培苗和栽培羅漢果施加茉莉酸甲酯，短期內(nèi)快速誘導(dǎo)羅漢果甜苷v生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因ugt84a21的高表達(dá)，從而促進(jìn)羅漢果甜苷v含量的顯著提高。本發(fā)明操作簡(jiǎn)便，成本低，對(duì)環(huán)境友好，適于規(guī)模化生產(chǎn)，具有較強(qiáng)的實(shí)用性和推廣價(jià)值。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。

實(shí)施例一

一種促進(jìn)羅漢果ugt84a21基因表達(dá)的方法，包括：

步驟一、羅漢果組培苗接種在含有茉莉酸甲酯的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中，茉莉酸甲酯在固體培養(yǎng)基中的濃度為50μmol/l。所述培養(yǎng)條件為：相對(duì)濕度60-66％、光照強(qiáng)度1400lux，光照時(shí)間8h/d，溫度21℃條件下培養(yǎng)30d。所述的固體培養(yǎng)基配比為ms+6-ba1.5mg/l，iba0.3mg/l，瓊脂3.5g/l，蔗糖30g/l，活性炭1.0g/l。

所述含有茉莉酸甲酯的固體培養(yǎng)基通過以下方式制備得到：用體積百分比濃度為2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成10000μmol/l的茉莉酸甲酯母液，并用0.22μm的微孔濾膜滅菌，將滅菌后的茉莉酸甲酯母液添加到固體培養(yǎng)基中，至茉莉酸甲酯的最終濃度為50μmol/l，將固體培養(yǎng)基滅菌并冷卻至24-26℃。

步驟二、栽培所述步驟一培養(yǎng)得到的羅漢果植株，在栽培期間，將濃度為50μmol/l的茉莉酸甲酯噴灑于授粉后22d的羅漢果表面，至表面滴水為止，早、中、晚各噴灑一次，連續(xù)噴施5d；并且在每次噴灑茉莉酸甲酯的乙醇溶液時(shí)，預(yù)先將茉莉酸甲酯的乙醇溶液降溫至8℃；每次噴灑茉莉酸甲酯的乙醇溶液之前，先向羅漢果表面噴水霧，水霧溫度為10℃，每次噴灑茉莉酸甲酯的乙醇溶液之后，再向羅漢果表面噴水霧，水霧溫度為15℃，之后通風(fēng)。

步驟三、利用qrt-pcr檢測(cè)所述步驟二栽培得到的羅漢果果實(shí)中的ugt84a21基因表達(dá)。

先將羅漢果果實(shí)進(jìn)行處理，挑取果肉，切成2-4mm小塊并分別用錫箔紙包好，立即置于液氮中速凍，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

采用改良trizol法提取羅漢果果實(shí)總rna。

采用abi7500實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀。

將rna反轉(zhuǎn)錄為cdna的反應(yīng)體系為rna10.0μl，primescriptrtenzymemixi1.0μl，rtprimermix1.0μl，5×primescriptbuffer24.0μl，rnasefreedh2o4.0μl；反應(yīng)條件為37℃(15min)到85℃(5s)，再到4℃。

采用primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其中，ugt84a21引物序列為(fp：cgccatatgcaccaccaccaccaccacatggtaaaggaagttgcagatg(seqidno:1)，rp：ccgagctctcaagaagtcgccgaacaatgg(seqidno:2))，內(nèi)參基因用ubq5，序列為(fp：ataaaagacccagcaccacattc(seqidno:3)，rp：cccttgccgactacaacatcc(seqidno:4))。

qrt-pcr反應(yīng)體系(20μl)為sybrpremixextaqii(tlirnasehplus)(2×)10.0μl，pcrforwardprimer(10μm)0.8μl，pcrreverseprimer(10μm)0.8μl，roxreferencedyeofdyeii(50×)0.4μl，template2.0μl，dh2o6.0μl。反應(yīng)條件為95℃(30s)，接著進(jìn)行40個(gè)cycles[95℃(5s)，95℃(34s)]。采用hplc法測(cè)定羅漢果甜苷v的含量。色譜條件為：色譜柱：dikmadiamomsil(tm)c18(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(梯度0-40min；10％線性升至40％；40.01-45mm；回至10％)；流速：1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：203nm。供試品樣液的配制為：取羅漢果粉末2g，精密稱定，置于100ml具磨口塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，搖勻，稱定重量。超聲處理1h，放冷，再稱定重量，并用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，以0.45μm的濾液微孔濾膜過濾即可。

對(duì)比例一

步驟一、將羅漢果組培苗接種不含有茉莉酸甲酯的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；步驟二、不對(duì)羅漢果植株噴灑茉莉酸甲酯；其他條件與實(shí)施例一一致。

qrt-pcr檢測(cè)結(jié)果顯示，在對(duì)比例一中，羅漢果ugt73af1基因的表達(dá)量為1，而在實(shí)施例一中，羅漢果ugt73af1基因的表達(dá)量高達(dá)10.8，較對(duì)比例一提高了980％，可見，實(shí)施例一可以顯著促進(jìn)羅漢果ugt73af1基因的高表達(dá)。hplc檢測(cè)結(jié)果顯示，在對(duì)比例一中，羅漢果甜苷v含量為0.79％，而在實(shí)施例一中，羅漢果甜苷v含量高達(dá)2.13％，較對(duì)比例一提高了169.62％，可見，實(shí)施例一還可以顯著促進(jìn)羅漢果甜苷v產(chǎn)量的提高。

實(shí)施例二

一種促進(jìn)羅漢果ugt84a21基因表達(dá)的方法，包括：

步驟一、羅漢果組培苗接種在含有茉莉酸甲酯的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中，茉莉酸甲酯在固體培養(yǎng)基中的濃度為200μmol/l。所述培養(yǎng)條件為：相對(duì)濕度60-66％、光照強(qiáng)度1400lux，光照時(shí)間8h/d，溫度25℃條件下培養(yǎng)30d。所述的固體培養(yǎng)基配比為ms+6-ba1.5mg/l，iba0.3mg/l，瓊脂3.5g/l，蔗糖30g/l，活性炭1.0g/l。

步驟二、栽培所述步驟一培養(yǎng)得到的羅漢果植株，在栽培期間，將濃度為200μmol/l的茉莉酸甲酯噴灑于授粉后24d的羅漢果表面，至表面滴水為止，早、中、晚各噴灑一次，連續(xù)噴施5d；并且在每次噴灑茉莉酸甲酯的乙醇溶液時(shí)，預(yù)先將茉莉酸甲酯的乙醇溶液降溫至8℃；每次噴灑茉莉酸甲酯的乙醇溶液之前，先向羅漢果表面噴水霧，水霧溫度為10℃，每次噴灑茉莉酸甲酯的乙醇溶液之后，再向羅漢果表面噴水霧，水霧溫度為15℃，之后通風(fēng)。

其他條件均與實(shí)施例一一致。

對(duì)比例二

步驟一、將羅漢果組培苗接種于不含有茉莉酸甲酯的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；步驟二、不對(duì)羅漢果植株噴灑茉莉酸甲酯；其他條件與實(shí)施例二一致。

qrt-pcr檢測(cè)結(jié)果顯示，在對(duì)比例二中，羅漢果ugt73af1基因的表達(dá)量為1，而在實(shí)施例二中，羅漢果ugt73af1基因的表達(dá)量高達(dá)17.9，較對(duì)比例二提高了1690％，可見，實(shí)施例二可以顯著促進(jìn)羅漢果ugt73af1基因的高表達(dá)。hplc檢測(cè)結(jié)果顯示，在對(duì)比例二中，羅漢果甜苷v含量為0.78％，而在實(shí)施例二中，羅漢果甜苷v含量高達(dá)2.24％，較對(duì)比例二提高了187.18％，可見，實(shí)施例二還可以顯著促進(jìn)羅漢果甜苷v產(chǎn)量的提高。

實(shí)施例三

一種促進(jìn)羅漢果ugt84a21基因表達(dá)的方法，包括：

步驟一、羅漢果組培苗接種在含有茉莉酸甲酯的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中，茉莉酸甲酯在固體培養(yǎng)基中的濃度為300μmol/l。所述培養(yǎng)條件為：相對(duì)濕度60-66％、光照強(qiáng)度1400lux，光照時(shí)間8h/d，溫度25℃條件下培養(yǎng)30d。所述的固體培養(yǎng)基配比為ms+6-ba1.5mg/l，iba0.3mg/l，瓊脂3.5g/l，蔗糖30g/l，活性炭1.0g/l。

步驟二、栽培所述步驟一培養(yǎng)得到的羅漢果植株，在栽培期間，將濃度為300μmol/l的茉莉酸甲酯噴灑于授粉后28d的羅漢果表面，至表面滴水為止，早、中、晚各噴灑一次，連續(xù)噴施5d；并且在每次噴灑茉莉酸甲酯的乙醇溶液時(shí)，預(yù)先將茉莉酸甲酯的乙醇溶液降溫至8℃；每次噴灑茉莉酸甲酯的乙醇溶液之前，先向羅漢果表面噴水霧，水霧溫度為10℃，每次噴灑茉莉酸甲酯的乙醇溶液之后，再向羅漢果表面噴水霧，水霧溫度為15℃，之后通風(fēng)。

其他條件均與實(shí)施例一一致。

對(duì)比例三

步驟一、將羅漢果組培苗接種于不含有茉莉酸甲酯的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；步驟二、不對(duì)羅漢果植株噴灑茉莉酸甲酯；其他條件與實(shí)施例三一致。

qrt-pcr檢測(cè)結(jié)果顯示，在對(duì)比例三中，羅漢果ugt73af1基因的表達(dá)量為1，而在實(shí)施例三中，羅漢果ugt73af1基因的表達(dá)量高達(dá)15.3，較對(duì)比例三提高了1430％，可見，實(shí)施例三可以顯著促進(jìn)羅漢果ugt73af1基因的高表達(dá)。hplc檢測(cè)結(jié)果顯示，在對(duì)比例三中，羅漢果甜苷v含量為0.71％，而在實(shí)施例三中，羅漢果甜苷v含量高達(dá)2.11％，較對(duì)比例三提高了197.18％，可見，實(shí)施例三還可以顯著促進(jìn)羅漢果甜苷v產(chǎn)量的提高。

盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)。

sequencelisting

<110>李華政

<120>促進(jìn)羅漢果ugt84a21基因表達(dá)的方法

<130>2016

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