相關申請的交叉引用本申請根據(jù)35u.s.c.§119(e)要求2010年5月28日提交的美國臨時專利申請第61/349,783號、2010年7月6日提交的美國臨時專利申請第61/361,878號和2010年9月24日提交的美國臨時專利申請第61/386,428號的權益。關于序列表的聲明與本申請相關的序列表以代替紙件的文本形式提供，并據(jù)此通過引用的方式并入說明書。含有序列表的文本文件的名稱為120178_487pc_sequence_listing.txt。該文本文件為19kb，創(chuàng)建于2011年5月27日，并通過電子提交。
背景技術：
：發(fā)明領域本發(fā)明通常涉及用作反義化合物的寡核苷酸化合物(寡聚物)，更具體地涉及包含修飾的亞基間鍵和/或端基的寡聚化合物，以及所述寡聚化合物在反義應用中的用途。相關技術的描述反義寡聚物通常被設計為與導致疾病的蛋白的dna或rna結合，以阻止這類蛋白的產(chǎn)生。反義療法的成功實施的要求包括(a)體內穩(wěn)定性，(b)足夠的膜通透性和細胞攝取，和(c)結合親和性與序列特異性的良好平衡。已經(jīng)開發(fā)多種寡核苷酸類似物，其中天然dna的磷酸二酯鍵被耐核酸酶降解的其他鍵替代(參見，例如barawkar,d.a.etal.,proc.na't'lacad.sci.usa95(19):11047-52(1998)；linkletter,b.a.etal,nucleicacidsres.29(11):2370-6(2001)；micklefield,j.,curr,med,chem,8(10):1157-79(2001))。還已經(jīng)制備了具有其他各種主鏈修飾的反義寡核苷酸(crooke,s.t.,antisensedrugtechnology:principles,strategies,andapplications(反義藥物技術：原理、策略與應用),newyork,marceldekker(2001)；micklefield,j.,curr,med,chem,8(10):l157-79(2001)；crooke,s.t.,antisensedrugtechnology(反義藥物技術),bocaraton,crcpress(2008))。此外，已經(jīng)通過肽結合來修飾寡核苷酸以增強細胞攝取(moulton,h.m.etal.,bioconjugchem15(2):290-9(2004)；nelson,m.h.etal,bioconjug.chem.16(4):959-66(2005)；moulton,h.m.etal.,biochimbiophysacta(2010))。這類核酸類似物作為反義或抗基因藥物的表現(xiàn)已經(jīng)受限于多種類似物的某些特性。例如，具有帶負電荷鍵的類似物，包括硫代磷酸酯連接的類似物，遭受寡聚物與dna或rna靶的負電荷之間的相當大的靜電排斥。硫代磷酸酯也表現(xiàn)出與諸如蛋白的其他細胞內組分的非特異性結合。這些性質限制了由天然rna、天然dna和帶負電的類似物構成的反義寡聚物的療效(crooke,s.t.,antisensedrugtechnology:principles,strategies,andapplications(反義藥物技術：原理、策略與應用),newyork,marceldekker(2001)；crooke,s.t.,antisensedrugtechnology(反義藥物技術),bocaraton,crcpress(2008))。非離子甲基磷酸酯連接的寡核苷酸類似物可以通過被動擴散和/或液相內吞作用而轉運進細胞，但是它們的應用受限于立體異構的復雜性和較差的水溶性(crooke,s.t.,antisensedrugtechnology:principles,strategies,andapplications(反義藥物技術：原理、策略與應用),newyork,marceldekker(2001)；micklefield,j.,curr,med,chem,8(10):1157-79(2001))。多個團體已經(jīng)報道了帶正電的寡核苷酸的合成(bailey,cp.etal.nucleicacidsres.26(21):4860-7(1998)；micklefield,j.,curr,med,chem,8(10):1157-79(2001)；egli,m.etal,biochemistry44(25):9045-57(2005))。例如，已經(jīng)報道了通過用非手性胍基取代dna和rna中的磷酸酯鍵而形成的一類胍基連接的核苷(命名為dng)(dempcy,r.o.etal,proc.nat'lacad.sci.usa91(17):7864-8(1994)；dempcy,r.o.etal,proc.nat'lacad.sci.usa93(9):4326-30(1996)；barawkar,d.a.etal,proc.na't'lacad.sci.usa95(19):11047-52(1998)；linkletter,b.a.etal,nucleicacidsres.29(11):2370-6(2001))。還已經(jīng)報道了用帶正電的甲基化硫脲鍵連接的寡聚物(arya,d.p.etal,proc.nat'lacad.sciusa96(8):4384-9(1999))。已經(jīng)報道用中性尿素鍵取代這些鍵中的某些鍵以降低這類帶正電的寡聚物向非序列特異性結合的傾向(linkletter,b.a.etal,bioorg.med.chem.8(8):1893-901(2000))。之前已經(jīng)描述了嗎啉代寡聚物，其包含(1-哌嗪基)氧亞膦基氧基和(1-(4-(ω-胍基-?；?)-哌嗪基)氧亞膦基氧基鍵(參見，例如，wo2008036127)。盡管已經(jīng)作出顯著進步，本領域內仍然需要具有改良的反義或抗基因性能的寡核苷酸類似物。這類改良的反義或抗基因性能包括，對dna和rna的更強的親和性而不損害序列選擇性；改善的藥物動力學和組織分布；改善的細胞遞送以及體內分布的可靠性與可控性。簡述本發(fā)明的化合物克服了這些問題，并提供相對于本領域內現(xiàn)有反義分子的改善。對諸如嗎啉寡核苷酸的寡核苷酸類似物的5’和/或3’末端進行末端部分的亞基間鍵和/或結合的修飾產(chǎn)生了具有優(yōu)良性質的反義寡聚物。例如，在某些實施方案中，相對于其他寡核苷酸類似物，公開的寡聚物具有增強的細胞遞送、效能和/或組織分布，和/或可以有效地被遞送到靶器官。這些優(yōu)良性質產(chǎn)生有利的治療指數(shù)、降低的臨床劑量和更低的商品成本。在一實施方案中，本公開提供了包含主鏈的寡聚物，所述主鏈包含由亞基間鍵連接的嗎啉環(huán)結構序列，所述亞基間鍵使一個嗎啉環(huán)結構的3’末端連接于鄰近的嗎啉環(huán)結構的5’末端，其中每個嗎啉環(huán)結構結合于堿基配對部分，使得寡聚物可以以序列特異性方式與靶核酸結合，其中所述亞基間鍵具有以下一般結構(i)或其鹽或異構體：并且其中每個亞基間鍵(i)獨立地為鍵(a)或鍵(b)：其中對于鍵(a)：w每次出現(xiàn)時獨立地為s或o；x每次出現(xiàn)時獨立地為-n(ch3)2、-nr1r2、-or3或；y每次出現(xiàn)時獨立地為o或-nr2，r1每次出現(xiàn)時獨立地為氫或甲基；r2每次出現(xiàn)時獨立地為氫或-lnr4r5r7；r3每次出現(xiàn)時獨立地為氫或c1-c6烴基；r4每次出現(xiàn)時獨立地為氫、甲基、-c(＝nh)nh2、-z-l-nhc(＝nh)nh2或-[c(o)chr’nh]mh，其中z為羰基(c(o))或直連鍵(directbond)，r’為天然氨基酸的側鏈或其一個-或兩個-碳的同系物，并且m為1至6；r5每次出現(xiàn)時獨立地為氫、甲基或電子對；r6每次出現(xiàn)時獨立地為氫或甲基；r7每次出現(xiàn)時獨立地為氫、c1-c6烴基或c1-c6烴氧基烴基；l為任選的長度高達18個原子的連接基團，其包括烴基、烴氧基或烴基氨基或其組合；以及其中對于鍵(b)：w每次出現(xiàn)時獨立地為s或o；x每次出現(xiàn)時獨立地為-nr8r9或-or3；并且y每次出現(xiàn)時獨立地為o或-nr10，r8每次出現(xiàn)時獨立地為氫或c1-c12烴基；r9每次出現(xiàn)時獨立地為氫、c1-c12烴基、c1-c12芳烴基或芳基；r10每次出現(xiàn)時獨立地為氫、c1-c12烴基或-lnr4r5r7；其中r8和r9可以連接以形成5-18元單環(huán)或二環(huán)雜環(huán)，或者r8、r9或r3可以與r10連接以形成5-7元雜環(huán)，并且其中當x為4-哌嗪基時，x具有以下結構(iii)：其中：r11每次出現(xiàn)時獨立地為c2-c12烴基、c1-c12氨基烴基、c1-c12烴基羰基、芳基、雜芳基或雜環(huán)基；并且r每次出現(xiàn)時獨立地為電子對、氫或c1-c12烴基；并且r12每次出現(xiàn)時獨立地為氫、c1-c12烴基、c1-c12氨基烴基、-nh2、-conh2、-nr13r14、-nr13r14r15、c1-c12烴基羰基、氧、-cn、三氟甲基、酰胺基、脒基、脒基烴基、脒基烴基羰基、胍基、胍基烴基、胍基烴基羰基、膽酸酯、脫氧膽酸酯、芳基、雜芳基、雜環(huán)、-sr13、或c1-c12烴氧基，其中r13、r14和r15每次出現(xiàn)時獨立地為c1-c12烴基；以及其中至少一個亞基間鍵為鍵(b)。在另一實施方案中，本公開提供了包含修飾的端基的寡聚物，例如在一實施方案中，本公開提供了包含主鏈的寡聚物，所述主鏈包含有由(a)類型、(b)類型的亞基間鍵或其組合連接的嗎啉環(huán)結構序列，其中每個嗎啉環(huán)結構支持堿基配對部分，使得所述寡聚物化合物可以以序列特異性的方式與靶核酸結合，并且其中所述寡聚物包含3’末端、5’末端，并且具有以下結構(xvii)或其鹽或異構體:并且其中對于鍵(a)：w每次出現(xiàn)時獨立地為s或o；x每次出現(xiàn)時獨立地為-n(ch3)2，-nr1r2，-or3或；y每次出現(xiàn)時獨立地為o或-nr2，r1每次出現(xiàn)時獨立地為氫或甲基；r2每次出現(xiàn)時獨立地為氫或-lnr4r5r7；r3每次出現(xiàn)時獨立地為氫或c1-c6烴基；r4每次出現(xiàn)時獨立地為氫、甲基、-c(＝nh)nh2、-z-l-nhc(＝nh)nh2或-[c(o)chr’nh]mh，其中z為羰基(c(o))或直連鍵，r’為天然氨基酸的側鏈或其一個-或兩個-碳的同系物，并且m為1至6；r5每次出現(xiàn)時獨立地為氫、甲基或電子對；r6每次出現(xiàn)時獨立地為氫或甲基；r7每次出現(xiàn)時獨立地為氫、c1-c6烴基或c1-c6烴氧基烴基；l為任選的長度高達18個原子的連接基團，其包括烴基、烴氧基或烴基氨基，或其組合；以及其中對于鍵(b)：w每次出現(xiàn)時獨立地為s或o；x每次出現(xiàn)時獨立地為-nr8r9或-or3；以及y每次出現(xiàn)時獨立地為o或-nr10，r8每次出現(xiàn)時獨立地為氫或c1-c12烴基；r9每次出現(xiàn)時獨立地為氫、c1-c12烴基、c1-c12芳烴基或芳基；r10每次出現(xiàn)時獨立地為氫、c1-c12烴基或-lnr4r5r7；其中r8和r9可以連接以形成5-18元單環(huán)或二環(huán)雜環(huán)，或者r8、r9或r3可以與r10連接以形成5-7元雜環(huán)，并且其中當x為4-哌嗪基時，x具有以下結構(iii)：其中：r10每次出現(xiàn)時獨立地為c2-c12烴基、c1-c12氨基烴基、c1-c12烴基羰基、芳基、雜芳基或雜環(huán)基；以及r11每次出現(xiàn)時獨立地為電子對、氫或c1-c12烴基；r12每次出現(xiàn)時獨立地為氫、c1-c12烴基、c1-c12氨基烴基、-nh2、-conh2、-nr13r14、-nr13r14r15、c1-c12烴基羰基、-cn、三氟甲基、酰胺基、脒基、脒基烴基、脒基烴基羰基、胍基、胍基烴基、胍基烴基羰基、膽酸酯、脫氧膽酸酯、芳基、雜芳基、雜環(huán)、-sr13或c1-c12烴氧基，其中r13、r14和r15每次出現(xiàn)時獨立地為c1-c12烴基；以及r17每次出現(xiàn)時獨立地為不存在、氫或c1-c6烴基；r18和r19每次出現(xiàn)時獨立地為不存在、氫、細胞穿透肽、天然的或非天然的氨基酸、c2-c30烴基羰基、-c(＝o)or21或r20；r20每次出現(xiàn)時獨立地為胍基、雜環(huán)基、c1-c30烴基、c3-c8環(huán)烴基；c6-c30芳基、c7-c30芳烴基、c3-c30烴基羰基、c3-c8環(huán)烴基羰基、c3-c8環(huán)烴基烴基羰基、c7-c30芳基羰基、c7-c30芳烴基羰基、c2-c30烴氧基羰基、c3-c8環(huán)烴氧基羰基、c7-c30芳氧基羰基、c8-c30芳烴氧基羰基或-p(＝o)(r22)2；r21為包含至少一個或多個氧或羥基部分或其組合的c1-c30烴基；每個r22獨立地為c6-c12芳氧基；b為堿基配對部分；l1為任選的長度為高達18個原子的連接基團，其包括選自以下的鍵：烴基、羥基、烴氧基、烴基氨基、酰胺、酯、二硫基、羰基、氨基甲酸酯、二氨基磷酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、哌嗪和磷酸二酯。x為0或更大的整數(shù)；并且其中r18或r19中的至少一個為r20，并且條件是r17和r18都存在。在另一實施方案中，本公開提供了抑制蛋白的產(chǎn)生的方法，所述方法包括將編碼所述蛋白的核酸暴露于本公開的寡聚物。在另一實施方案中，本公開涉及治療個體中疾病的方法，所述方法包括給予治療有效量的寡聚物。還提供了制備所述寡聚物的方法，以及用于所述寡聚物應用的方法。本發(fā)明的這些和其他方面將參照以下的詳細描述而顯而易見。為此，在本文列出更詳細地描述某些背景信息、程序、化合物和/或組合物的多種參考文獻，并通過其整體形式各自并入本文作為參考。附圖簡述圖1a示出包含二氨基磷酸酯鍵的示例性嗎啉代寡聚物結構。圖1b示出圖1a的嗎啉代寡聚物，但其中主鏈鍵包含一個哌嗪基二氨基磷酸酯鍵。圖1c示出富精氨酸肽和反義寡聚物的結合物。圖1d-g示出示例性嗎啉基寡核苷酸的重復亞基片段，指定為1d至1g。圖2示出與嗎啉代-t部分連接的示例性亞基間鍵。圖3是示出制備用于固相合成的連接基團的反應流程。圖4示例用于寡聚物合成的固相支持物的制備。圖5示出典型寡聚物的外顯子跳躍活性。圖6是示出mdx小鼠模型中外顯子跳躍的柱狀圖。圖7a-7c提供用示例性寡聚物處理轉基因egfp小鼠的結果。圖8示出用示例性寡聚物處理的細胞的病毒m2蛋白水平的降低。圖9示出用示例性寡聚物處理的小鼠中抗病毒活性和重量減輕。圖10提供用示例性寡聚物處理的小鼠的體重數(shù)據(jù)。圖11是與pmo和pmo+寡聚物相比，來自用示例性寡聚物處理的小鼠的多種組織中egfp剪解-修正活性數(shù)據(jù)。圖12示出與pmo和pmo+寡聚物相比，來自用示例性寡聚物處理的小鼠的多種組織中egfp剪解-修正活性數(shù)據(jù)的子集。發(fā)明詳述i.定義在下述描述中，陳述了某些具體細節(jié)以提供多種實施方案的深入理解。然而，本領域技術人員應明白本發(fā)明可以在沒有這些細節(jié)的情況下而實施。在其他實例中，未將公知結構示出或詳細描述以避免使實施方案描述不必要地變得模糊。除非上下文另有需要，整個說明書和權利要求書遵循下述要求，措辭“包含”及其變體，例如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”應被解釋為開放式、包含的含義，即，解釋為“包括，但不限于”。此外，本文提供的標題僅為了便利，并不說明所要求保護的發(fā)明的范圍和內涵。整個本說明書對“一實施方案”或“實施方案”的參考是指實施方案中描述的特定特征、結構或特性包括在至少一個實施方案中。因此，在整個本說明書的多處中均出現(xiàn)的措辭“在一實施方案中”或“在實施方案中”不必全部涉及相同的實施方案。此外，在一個或多個實施方案中，特定特征、結構或特性可以以任何合適的方式組合。此外，在本說明書和附加的權利要求中所用的單數(shù)形式“a(一)”、“an(一個)”、“the(該)”包括復數(shù)形式，除非內容明顯地另有所指。還應注意，術語“或”通常以其包含“和/或”的含義而使用，除非內容明顯地另有所指。除非另有所指，本文所用的以下術語具有以下含義：“氨基”指-nh2基。“氰基”或“腈”指-cn基?！傲u基”或“氫氧基”指-oh基?！皝啺被敝福絥h取代基?！半一敝?nhc(＝nh)nh2取代基?！半呋敝?c(＝nh)nh2取代基?！跋趸敝?no2基。“氧基”指＝o取代基。“硫基”指＝s取代基?！澳懰狨ァ敝敢韵陆Y構：“脫氧膽酸酯”指以下結構：“烴基”是指直鏈或支鏈烴鏈基團，其是飽和的或未飽和的(即，包含一個或多個雙鍵和/或叁鍵)，具有1-30個碳原子，并且通過單鍵連接到分子的其余部分。包括了包含從1至30的任何數(shù)目碳原子的烴基。包含高達30個碳原子的烴基被稱作c1-c30烴基，同樣地，例如，包含高達12個碳原子的烴基為c1-c12烴基。包含其他數(shù)目碳原子的烴基(以及本文定義的其他部分)類似地表示。烴基包括但不限于，c1-c30烴基、c1-c20烴基、c1-c15烴基、c1-c10烴基、c1-c8烴基、c1-c6烴基、c1-c4烴基、c1-c3烴基、c1-c2烴基、c2-c8烴基、c3-c8烴基和c4-c8烴基。典型的烴基包括但不限于，甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(異丙基)、正丁基、異丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基乙基(叔丁基)、3-甲基己基、2-甲基己基、乙烯基、丙-1-烯基、丁-1-烯基、戊-1-烯基、戊-1,4-二烯基、乙炔基、丙炔基、丁-2-炔基、丁-3-炔基、戊炔基、己炔基等。除非說明書中具體說明，烴基可以任選地如以下所述取代。“亞烴基”或“亞烴基鏈”指直鏈或支鏈二價烴鏈，其使分子的其余部分與基團連接。亞烴基可以是飽和的或未飽和的(即，包含一個或多個雙鍵和/或叁鍵)。典型的亞烴基包括但不限于，c1-c12亞烴基、c1-c8亞烴基、c1-c6亞烴基、c1-c4亞烴基、c1-c3亞烴基、c1-c2亞烴基、c1亞烴基。典型的亞烴基包括但不限于，亞甲基、亞乙基、亞丙基、正亞丁基、亞乙烯基、亞丙烯基、正亞丁烯基、亞丙炔基、正亞丁炔基等。亞烴基鏈通過單鍵或雙鍵連接到分子的其余部分，并通過單鍵或雙鍵連接到基團。亞烴基鏈與分子其余部分的連接點和與基團的連接點可以通過鏈中的一個碳或任意兩個碳。除非說明書中具體說明，亞烴基可以任選地如以下所述取代?！盁N氧基”指通式-ora的基團，其中ra為如本文所定義的烴基。除非說明書中具體說明，烴氧基可以任選地如以下所述取代。“烴氧基烴基”指通式-rbora的基團，其中ra為所定義的烴基，并且其中rb為所定義的亞烴基。除非說明書中具體說明，烴氧基烴基可以任選地如以下所述取代?！盁N基羰基”指通式-c(＝o)ra的基團，其中ra為上述所定義的烴基。除非說明書中具體說明，烴基羰基可以任選地如以下所述取代?！盁N氧基羰基”指通式-c(＝o)ora的基團，其中ra為所定義的烴基。除非說明書中具體說明，烴氧基羰基可以任選地如以下所述取代。“烴基氨基”指通式-nhra或-nrara的基團，其中每個ra獨立地為上述所定義的烴基。除非說明書中具體說明，烴基氨基可以任選地如以下所述取代?！磅０坊敝竿ㄊ?n(h)c(＝o)ra的基團，其中ra為如本文所定義的烴基或芳基。除非說明書中具體說明，酰胺基可以任選地如以下所述取代?！半呋鶡N基”指通式-rb-c(＝nh)nh2的基團，其中rb為上述所定義的亞烴基。除非說明書中具體說明，脒基烴基可以任選地如以下所述取代?！半呋鶡N基羰基”指通式-c(＝o)-rb-c(＝nh)nh2的基團，其中rb為上述所定義的亞烴基。除非說明書中具體說明，脒基烴基羰基可以任選地如以下所述取代。“氨基烴基”指通式-rb-nrara的基團，其中rb為上述所定義的亞烴基，并且每個ra獨立地為氫或烴基?！傲虼鸁N基”指通式-sra的基團，其中ra為上述所定義的烴基。除非說明書中具體說明，硫代烴基可以任選地被取代。“芳基”指從環(huán)烴體系衍生的基團，其包含氫、6-30個碳原子和至少一個芳環(huán)。芳基可以是單環(huán)的、二環(huán)的、三環(huán)的或四環(huán)的環(huán)體系，其可以包含稠合的或橋接的環(huán)體系。芳基包括但不限于，從環(huán)烴體系衍生的芳基：醋蒽烯、苊烯、醋菲烯、蒽、薁、苯、屈(chrysene)、熒蒽、芴、不對稱引達省(as-indacene)、對稱引達省(s-indacene)、二氫茚、茚、萘、萉、菲、七曜烯、芘和苯并菲。除非說明書中具體說明，術語“芳基”或前綴“芳-”(例如在“芳烴基”中)意指包括被任選地取代的芳基?！胺紵N基”指通式-rb-rc的基團，其中rb是上述所定義的亞烴基，并且rc是一個或多個上述所定義的芳基，例如芐基、二苯甲基、三苯甲基等。除非說明書中具體說明，芳烴基可以任選地被取代?！胺蓟驶敝竿ㄊ?c(＝o)rc的基團，其中rc為一個或多個上述所定義的芳基，例如苯基。除非說明書中具體說明，芳基羰基可以任選地被取代?！胺佳趸驶敝竿ㄊ?c(＝o)orc的基團，其中rc為一個或多個上述所定義的芳基，例如苯基。除非說明書中具體說明，芳氧基羰基可以任選地被取代?！胺紵N基羰基”指通式-c(c＝o)rb-rc的基團，其中rb是上述所定義的亞烴基，并且rc是一個或多個上述所定義的芳基，例如苯基。除非說明書中具體說明，芳烴基羰基可以任選地被取代。“芳烴氧基羰基”指通式-c(c＝o)orb-rc的基團，其中rb是上述所定義的亞烴基，并且rc是一個或多個上述所定義的芳基，例如苯基。除非說明書中具體說明，芳烴氧基羰基可以任選地被取代。“芳氧基”指通式-orc的基團，其中rc為一個或多個上述所定義的芳基，例如苯基。除非說明書中具體說明，芳基羰基可以任選地被取代。“環(huán)烴基”指穩(wěn)定的、非芳族的、單環(huán)或多環(huán)碳環(huán)，其可包括稠合的或橋接的環(huán)體系，可以是飽和的或不飽和的，并通過單鍵連接到分子的其余部分。典型的環(huán)烴基包括，但不限于，具有3-15個碳原子和3-8個碳原子的環(huán)烴基，單環(huán)環(huán)烴基包括，例如，環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基和環(huán)辛基。多環(huán)基團包括，例如，金剛烷基、降莰基、十氫萘基和7,7-二甲基-二環(huán)[2.2.1]庚基。除非說明書中具體說明，環(huán)烴基可以任選地被取代?！碍h(huán)烴基烴基”指通式-rbrd的基團，其中rb為一個或多個上述所定義的亞烴基，并且rd為上述所定義的環(huán)烴基。除非說明書中具體說明，環(huán)烴基烴基可以任選地被取代。“環(huán)烴基羰基”指通式-c(＝o)rd的基團，其中rd為上述所定義的環(huán)烴基。除非說明書中具體說明，環(huán)烴基羰基可以任選地被取代?！碍h(huán)烴氧基羰基”指通式-c(＝o)ord的基團，其中rd為上述所定義的環(huán)烴基。除非說明書中具體說明，環(huán)烴氧基羰基可以任選地被取代。“稠合”指與現(xiàn)存環(huán)結構稠合的本文所述的任意環(huán)結構。當稠環(huán)是雜環(huán)或雜芳環(huán)時，成為稠合雜環(huán)或稠合雜芳環(huán)的一部分的現(xiàn)存環(huán)結構上的任意碳原子可以被氮原子替代?！半一鶡N基”指通式-rb-nhc(＝nh)nh2的基團，其中rb為上述所定義的亞烴基。除非說明書中具體說明，胍基烴基可以任選地如以下所述取代。“胍基烴基羰基”指通式-c(＝o)-rb-nhc(＝nh)nh2的基團，其中rb為上述所定義的亞烴基。除非說明書中具體說明，胍基烴基羰基可以任選地如以下所述取代。“鹵代”或“鹵素”指溴、氯、氟或碘。“鹵代烴基”指被一個或多個鹵素基團取代的上述所定義的烴基，例如三氟甲基、二氟甲基、氟甲基、三氯甲基、2,2,2-三氟乙基、1,2-二氯乙基、3-溴-2-氟丙基、1,2-二溴乙基等。除非說明書中具體說明，鹵代烴基可以任選地被取代?！叭u代”或“全氟代”指其中每個氫原子已經(jīng)分別被鹵原子或氟原子替代的部分?！半s環(huán)基”、“雜環(huán)”或“雜環(huán)(heterocyclicring)”指穩(wěn)定的3-至24-元非芳環(huán)基團，其包含2-23個碳原子和1-8個選自氮、氧、磷和硫的雜原子。除非說明書中具體說明，雜環(huán)基團可以是單環(huán)、二環(huán)、三環(huán)或四環(huán)的環(huán)體系，其可以包括稠合的或橋接的環(huán)體系，并且雜環(huán)基團中的氮、碳或硫原子可以任選地被氧化；氮原子可以任選地被季銨化；并且雜環(huán)基團可以為部分飽和或完全飽和。這類雜環(huán)基團的實例包括但不限于，二氧戊環(huán)基，噻吩基[1，3]二噻烷基、十氫化異喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、異噻唑烷基、異噁唑烷基、嗎啉基、八氫吲哚基、八氫異吲哚基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎寧環(huán)基、噻唑烷基、四氫呋喃基、三噻烷基、四氫吡喃基、硫代嗎啉基、硫嗎啉基、1-氧-硫代嗎啉基、1,1-二氧-硫代嗎啉基、12-冠-4、15-冠-5、18-冠-6、21-冠-7、氮雜-18-冠-6、二氮雜-18-冠-6、氮雜-21-冠-7和二氮雜-21-冠-7。除非說明書中具體說明，雜環(huán)基可以任選地被取代?！半s芳基”指5-至14-元環(huán)體系基團，其包含氫原子、1-13個碳原子、1-6個選自氮、氧、磷和硫的雜原子以及至少一個芳環(huán)。為本發(fā)明目的，雜芳基可以是單環(huán)、二環(huán)、三環(huán)或四環(huán)的環(huán)體系，其可以包括稠合的或橋接的環(huán)體系，并且雜芳基中的氮、碳或硫原子可以任選地被氧化；氮原子可以任選地季銨化。實例包括但不限于，吖庚因基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并吲哚基、苯并間二氧雜環(huán)戊烯基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并[b][1,4]二氧雜環(huán)庚二烯基(dioxepinyl)、1,4-苯并二噁烷基、苯并萘并呋喃基、苯并噁唑基、苯并間二氧雜環(huán)戊烯基、苯并二噁英基、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基(benzothienyl)(苯并噻吩基(benzothiophenyl))、苯并三唑基、苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基、咔唑基、噌啉基、二苯并呋喃基、二苯并噻吩基、呋喃基、呋喃酮基、異噻唑基、咪唑基、吲唑基、吲哚基、吲唑基、異吲哚基、二氫吲哚基、異二氫吲哚基、異喹啉基、吲哚嗪基、異噁唑基、二氮雜萘基、噁二唑基、2-氧氮雜卓基、噁唑基、環(huán)氧乙烷基、1-氧化吡啶基、1-氧化嘧啶基、1-氧化吡嗪基、1-氧化噠嗪基、1-苯基-1h-吡咯基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、二氮雜萘基、喋啶基、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、噠嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、喹啉基、奎寧環(huán)基、異喹啉基、四氫喹啉基、噻唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、三嗪基和噻吩基(thiophenyl)(即噻吩基(thienyl))。除非說明書中具體說明，雜芳基可以任選地被取代。所有上述基團可以是取代的或未取代的。本文所用的術語“取代的”意指任何上述基團(即，烴基、亞烴基、烴氧基、烴氧基烴基、烴基羰基、烴氧基羰基、烴基氨基、酰胺基、脒基烴基、脒基烴基羰基、氨基烴基、芳基、芳烴基、芳基羰基、芳氧基羰基、芳烴基羰基、芳烴氧基羰基、芳氧基、環(huán)烴基、環(huán)烴基烴基、環(huán)烴基羰基、環(huán)烴基烴基羰基、環(huán)烴氧基羰基、胍基烴基、胍基烴基羰基、鹵代烴基、雜環(huán)基和/或雜芳基)可以被進一步官能化，其中至少一個氫原子被非氫原子取代基的鍵替代。除非說明書中具體指出，取代基可以包括選自以下的一個或多個取代基：氧、-co2h、-conh2、腈、硝基、羥基、硫氧基、烴基、亞烴基、烴氧基、烴氧基烴基、烴基羰基、烴氧基羰基、芳基、芳烴基、芳基羰基、芳氧基羰基、芳烴基羰基、芳烴氧基羰基、芳氧基、環(huán)烴基、環(huán)烴基烴基、環(huán)烴基羰基、環(huán)烴基烴基羰基、環(huán)烴氧基羰基、雜環(huán)基、雜芳基、二烴基胺、芳基胺、烴基芳基胺、二芳基胺、n-氧化物、酰亞胺和烯胺；基團中的硅原子，例如三烴基硅基、二烴基芳基硅基、烴基二芳基硅基、三芳基硅基；全氟烴基或全氟烴氧基，例如三氟甲基或三氟甲氧基?！叭〈摹边€意指任意上述基團，其中一個或多個氫原子被雜原子的更高級的鍵(例如雙鍵或叁鍵)取代，所述雜原子例如氧基、羰基、羧基和酯基中的氧；以及例如亞胺、肟、腙和腈的基團中的氮。例如，“取代的”包括任意上述基團，其中一個或多個氫原子被-nrgc(＝o)nrgrh、-nrgc(＝o)orh、-nrgso2rh、-oc(＝o)nrgrh、-org、-srg、-sorg、-so2rg、-oso2rg、-so2org、＝nso2rg和-so2nrgrh取代?！叭〈摹边€意指任意上述基團，其中一個或多個氫原子被-c(＝o)rg、-c(＝o)org、-ch2so2rg、-ch2so2nrgrh、-sh、-srg或-ssrg取代。在前述內容中，rg和rh是相同或不同的，并獨立地為氫、烴基、烴氧基、烴基氨基、硫代烴基、芳基、芳烴基、環(huán)烴基、環(huán)烴基烴基、鹵代烴基、雜環(huán)基、n-雜環(huán)基、雜環(huán)基烴基、雜芳基、n-雜芳基和/或雜芳基烴基。此外，每個前述取代基還可以任選地被一個或多個上述取代基取代。另外，任意上述基團可以被取代以包含一個或多個內部氧原子或硫原子。例如，烴基可以被一個或多個內部氧原子取代以形成醚或多聚醚基團。類似地，烴基可以被一個或多個內部硫原子取代以形成硫醚、二硫化物等。酰胺基部分可以被多達2個鹵素原子取代，而其他上述基團可以被一個或多個鹵素原子取代。除烴基之外，所有其他基團還可以被氨基或單烴基氨基取代。除烴基和烴基羰基之外，所有其他基團還可以被胍基或脒基取代。任意上述基團的任選的取代基還包括芳基磷酰基，例如-rap(ar)3其中ra為亞烴基并且ar為芳基部分，例如苯基。術語“反義寡聚物”或“反義化合物”可交換地使用，并指亞基的序列，每個亞基具有在由核糖或其他戊糖或嗎啉基組成的主鏈亞基上攜帶的堿基，并且其中所述主鏈基團通過允許化合物中堿基與核酸(通常為rna)中靶序列通過沃特森-克里克堿基配對而雜化的亞基間鍵連接，以在靶序列中形成核酸：寡聚物異源雙鏈。寡聚物可以具有與靶序列精確互補的序列或近似互補的序列。這類反義寡聚物被設計用于阻斷或抑制包含靶序列的mrna的翻譯，并且被稱為“針對”與其雜化的序列。“嗎啉代寡聚物”或“pmo”指具有支持堿基的主鏈的聚合物分子,所述堿基可以氫鍵結合至典型的多核苷酸，其中所述聚合物缺乏戊糖主鏈部分，并且更具體地缺乏核苷酸和核苷的典型的通過磷酸二酯鍵連接的核糖主鏈，取而代之的是包含環(huán)氮，并通過環(huán)氮結合。示例性“嗎啉代”寡聚物包含通過(硫代)氨基磷酸酯或(硫代)二氨基磷酸酯鍵(使一個亞基的嗎啉基氮連接于鄰近亞基的5’環(huán)外碳)連接在一起的嗎啉代亞基結構，包含嘌呤或嘧啶堿基配對部分的每個亞基通過堿基特異性氫鍵有效地結合到多核苷酸中的堿基。嗎啉代寡聚物(包括反義寡聚物)在例如，美國專利號5,698,685；5,217,866；5,142,047；5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,521,063；5,506,337和未決的美國專利申請12/271,036；12/271,040；以及pct申請?zhí)杦o/2009/064471中詳述，并且通過引用將其整體全部并入本文。典型的pmo包括其中亞基間鍵為鍵(a1)的pmo?！皃mo+”指二氨基磷酸酯嗎啉代寡聚物，其包含任意數(shù)量的前述(l-哌嗪基)氧亞膦基氧基鍵、(l-(4-(ω-胍基-?；?)-哌嗪基)氧亞膦基氧基鍵(a2和a3)(參見，例如pct公開wo/2008/036127，通過引用將其整體并入本文)?！皃mo-x”指包含至少一個(b)鍵或至少一個公開的末端修飾的本文公開的二氨基磷酸酯嗎啉代寡聚物?！鞍被姿狨ァ被鶊F包含具有3個連接的氧原子和1個連接的氮原子的磷，而“二氨基磷酸酯”基團(參見，例如圖1d-e)包含具有2個連接的氧原子和2個連接的氮原子的磷。在本文和共同未決的美國專利申請?zhí)?1/349,783和11/801,885所述的寡聚物的不帶電或修飾的亞基間鍵中，一個氮總是懸掛在主鏈上。二氨基磷酸酯鍵中的第二個氮通常為嗎啉環(huán)結構的環(huán)氮。“硫代氨基磷酸酯”或“硫代二氨基磷酸酯”鍵分別是其中一個氧原子、通常為懸掛在主鏈上的氧被硫替代的氨基磷酸酯鍵或二氨基磷酸酯鍵?！皝喕g鍵”指連接兩個嗎啉代亞基的鍵，例如結構(i)。本文所用的“帶電”、“不帶電”、“陽離子的”和“陰離子的”指化學部分在近中性ph值(例如約6-8)時的主要狀態(tài)。例如，所述術語可以指化學部分在生理ph值、即約7.4時的主要狀態(tài)。“低級烷基”指1至6個碳原子的烷基，例如甲基、乙基、正丁基、異丁基、叔丁基、異戊基、正戊基以及異戊基。在某些實施方案中，“低級烷基”基團具有1至4個碳原子。在其他實施方案中，“低級烷基”基團具有1至2個碳原子，即甲基或乙基。類似地，“低級烯基”指2至6個、優(yōu)選3或4個碳原子的烯基，例如丙烯基和丁烯基?！胺歉蓴_”取代基是不會對本文所述的反義寡聚物與其預期靶結合的能力產(chǎn)生不利影響的取代基。這類取代基包括小的和/或相對非極性的基團，例如甲基、乙基、甲氧基、乙氧基或氟。如果寡聚物與靶標在生理狀態(tài)下雜化，并伴有大于37℃，大于45℃，優(yōu)選至少50℃，通常60℃-80℃或更高的tm，那么寡核苷酸或反義寡聚物與靶多核苷酸“特異性雜化”。寡聚物的“tm”是寡聚物與互補多核苷酸50％雜化的溫度。tm在生理鹽水中的標準條件下確定，例如，描述于miyadaetal,methodsenzymol.154:94-107(1987)。這類雜化可以通過反義寡聚物與靶序列的“近似”或“基本上”的互補，以及精確互補而發(fā)生。當兩個單鏈多核苷酸之間以反平行構型發(fā)生雜化時，則多核苷酸被描述為與另一多核苷酸“互補”?；パa性(一個多核苷酸與另一個多核苷酸互補的程度)可通過按照通常接受的堿基配對原則，根據(jù)相反鏈中預期互相形成氫鍵的堿基的比例而定量。如果序列為第一序列的多核苷酸與第二多核苷酸序列在生理條件下結合或特異性雜化，則第一序列為第二序列的“反義序列”。術語“靶向序列”為寡核苷酸類似物中與rna基因組中靶序列互補(還指基本上互補)的序列。類似物化合物的全部序列或僅一部分可以與靶序列互補。例如，在具有20個堿基的類似物中，僅12-14個為靶向序列。通常，類似物中的連續(xù)堿基形成靶向序列，或者非連續(xù)序列放置在一起(例如從類似物的相反末端)構成跨越靶序列的序列時，形成靶向序列。當反向平行構型中發(fā)生雜化時，靶標和靶向序列被描述為互相“互補”。靶向序列可以具有與靶序列“近似”或“基本上”的互補性，并仍為了本文所述方法的目的而發(fā)揮作用，即仍是“互補”的。優(yōu)選地，本文所述方法中使用的寡核苷酸類似物與超過10個核苷酸的靶序列具有至多1個錯配，并優(yōu)選地與超過20個核苷酸的靶序列具有至多1個錯配。或者，利用的反義寡聚物與本文指定的示例性靶向序列具有至少90％同源性，并優(yōu)選地至少95％序列同源性。為了互補結合rna靶，并如下文討論的，鳥嘌呤堿基可以與胞嘧啶或尿嘧啶rna堿基互補。“異源雙鏈體”指寡核苷酸類似物和靶rna的互補部分之間的雙鏈體?！澳秃怂崦傅漠愒措p鏈體”指由反義寡聚物與其互補靶標結合而形成的異源雙鏈體，從而使得異源雙鏈體為基本上耐細胞內或細胞外核酸酶的體內降解，諸如核糖核酸酶(rnaseh)，其能夠切割雙鏈的rna/rna或rna/dna復合物。當制劑可以通過機制而不是被動擴散穿過細胞膜進入細胞時，制劑為“被哺乳動物細胞主動攝取”。例如制劑可例如通過“主動轉運”而被轉運，意即制劑穿過哺乳動物細胞膜的轉運，例如通過atp依賴的轉運機制，或通過“易化轉運”，意即反義制劑通過下述轉運機制而穿過細胞膜，即所述轉運機制需要制劑與轉運蛋白結合，然后該轉運蛋白使結合的制劑穿過膜的通道變得容易。術語“調節(jié)表達”和/或“反義活性”指反義寡聚物通過干擾rna的表達或翻譯而增強或更通常地降低給定蛋白的表達的能力。在降低蛋白表達的情況下，反義寡聚物可以直接阻斷給定基因的表達，或促進從該基因轉錄的rna的加速降解。本文所述的嗎啉代寡聚物被認為通過前一機制(空間阻斷)而起作用。空間阻斷寡聚物的優(yōu)選的反義靶包括atg起始密碼子區(qū)域、剪接位點、緊密鄰近剪接位點的區(qū)域以及mrna的5’非翻譯區(qū)域，盡管已經(jīng)使用嗎啉代寡聚物成功靶向其他區(qū)域?！鞍被醽喕眱?yōu)選地指α-氨基酸殘基(-co-chr-nh-)；其還可以是β-或其他氨基酸殘基(例如-co-ch2chr-nh-)，其中r為氨基酸側鏈。術語“天然氨基酸”指存在于自然界中發(fā)現(xiàn)的蛋白中的氨基酸。術語“非天然氨基酸”指不存在于自然界中發(fā)現(xiàn)的蛋白中的那些氨基酸，實例包括β-丙氨酸(β-ala)和6-氨基己酸(ahx)?！坝行Я俊被颉爸委熡行Я俊敝附o予哺乳動物個體的反義寡聚物的量(作為單獨劑量或一系列劑量的一部分)，其通常通過抑制所選靶核酸序列的翻譯而有效地產(chǎn)生所需治療效果。個體(例如哺乳動物，例如人)或細胞的“治療”是嘗試改變個體或細胞的天然進程而使用的任何類型的介入。治療包括但不限于，給予藥物組合物，并且可預防性地進行或繼病理學事件的啟動或與病因學因子接觸之后而進行。ii.反義寡聚物a.具有修飾的亞基間鍵的寡聚物如上文所述，本公開的一個實施方案涉及包含新的亞基間鍵的寡聚物。在一些實施方案中，寡聚物具有比相應的未修飾寡聚物更高的針對dna和rna的親和力，并且與具有其他亞基間鍵的寡聚物相比表現(xiàn)出改善的細胞遞送、效能和/或組織分布性質。在一實施方案中，寡聚物包含至少一個上述所定義的(b)型亞基間鍵。寡聚物還可以包含一個或多個上文所定義的(a)型亞基間鍵。各種鍵類型和寡聚物的結構特征和性質在下面討論中更詳細地描述。1.鍵(a)申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以通過制備具有多種亞基間鍵的寡聚物來優(yōu)化反義活性、生物分布和/或其他所需性質的增強。例如，寡聚物可以任選地包含一個或多個(a)型亞基間鍵，并且在某些實施方案中，寡聚物包含至少一個(a)型鍵。在一些其他實施方案中，每個(a)型鍵具有相同的結構。(a)型鍵可以包括共同擁有的美國專利第7,943,762號所公開的鍵，通過引用將其整體并入本文。鍵(a)具有以下結構(i)或其鹽或異構體，其中3’和5’分別指嗎啉環(huán)(即，下文所述結構(i))的3’和5’末端的連接點：其中：w每次出現(xiàn)時獨立地為s或o；x每次出現(xiàn)時獨立地為-n(ch3)2，-nr1r2，-or3或；y每次出現(xiàn)時獨立地為o或-nr2，r1每次出現(xiàn)時獨立地為氫或甲基；r2每次出現(xiàn)時獨立地為氫或-lnr4r5r7；r3每次出現(xiàn)時獨立地為氫或c1-c6烴基；r4每次出現(xiàn)時獨立地為氫、甲基、-c(＝nh)nh2、-z-l-nhc(＝nh)nh2或-[c(o)chr’nh]mh，其中z為-c(＝o)-或直連鍵，r’為天然氨基酸的側鏈或其一個-或兩個-碳的同系物，并且m為1至6；r5每次出現(xiàn)時獨立地為氫、甲基或電子對；r6每次出現(xiàn)時獨立地為氫或甲基；r7每次出現(xiàn)時獨立地為氫、c1-c6烴基或c1-c6烴氧基烴基；以及l(fā)為任選的長度高達18個原子的連接基團，其包括烴基、烷氧基或烷氨基或者其組合。在一些實例中，寡聚物包含至少1個(a)型鍵。在一些其他實施方案中，寡聚物包含至少兩個連續(xù)的(a)型鍵。在其他實施方案中，寡聚物中至少5％的鍵為(a)型；例如在一些實施方案中，5％-95％、10％-90％、10％-50％或10％-35％的鍵可以是(a)型鍵。在一些具體實施方案中，至少一個(a)型鍵是-n(ch3)2。在其他實施方案中，每個(a)型鍵是-n(ch3)2。在其他實施方案中，至少一個(a)型鍵是哌嗪-1-基，例如未取代的哌嗪-1-基(例如，a2或a3)。在其他實施方案中，每個(a)型鍵是哌嗪-1-基，例如未取代的哌嗪-1-基。在一些實施方案中，w每次出現(xiàn)時獨立地為s或o，并且在某些實施方案中w為o。在一些實施方案中，x每次出現(xiàn)時獨立地為-n(ch3)2、-nr1r2、-or3。在一些實施方案中，x為-n(ch3)2。在其他方面，x為-nr1r2，并且在其他實例中x為-or3。在一些實施方案中，r1每次出現(xiàn)時獨立地為氫或甲基。在一些實施方案中，r1為氫。在其他實施方案中，x為甲基。在一些實施方案中，r2每次出現(xiàn)時為氫。在一些實施方案中，r2每次出現(xiàn)時為-lnr4r5r7。在一些實施方案中，r3每次出現(xiàn)時獨立地為氫或c1-c6烴基。在其他實施方案中，r3為甲基。在其他實施方案中，r3為乙基。在一些其他實施方案中，r3為正丙基或異丙基。在一些其他實施方案中，r3為c4烴基。在其他實施方案中，r3為c5烴基。在一些實施方案中，r3為c6烴基。在某些實施方案中，r4每次出現(xiàn)時獨立地為氫。在其他實施方案中，r4為甲基。在其他實施方案中，r4為-c(＝nh)nh2，并且在其他實施方案中，r4為-z-l-nhc(＝nh)nh2。在其他實施方案中r4為-[c(＝o)chr’nh]mh。在一實施方案中z為-c(＝o)-，并且在另一實施方案中z為直連鍵。r’為天然氨基酸的側鏈。在一些實施方案中，r’為天然氨基酸的側鏈的一個-或兩個-碳的同系物。m為1-6的整數(shù)。m可以為1。m可以為2。m可以為3。m可以為4。m可以為5。m可以為6。在一些實施方案中，r5每次出現(xiàn)時獨立地為氫、甲基或電子對。在一些實施方案中，r5為氫。在其他實施方案中，r5為甲基。在其他實施方案中，r5為電子對。在一些實施方案中，r6每次出現(xiàn)時獨立地為氫或甲基。在一些實施方案中，r6為氫。在其他實施方案中，r6為甲基。在其他實施方案中，r7每次出現(xiàn)時獨立地為氫、c1-c6烴基或c2-c6烴氧基烴基。在一些實施方案中，r7為氫。在其他實施方案中，r7為c1-c6烴基。在其他實施方案中，r7為c2-c6烴氧基烴基。在其他實施方案中，r7為甲基。在其他實施方案中，r7為乙基。在其他實施方案中，r7為正丙基或異丙基。在一些其他實施方案中，r7為c4烴基。在一些實施方案中，r7為c5烴基。在一些實施方案中，r7為c6烴基。在其他實施方案中，r7為c2烴氧基烴基。在其他實施方案中，r7為c3烴氧基烴基。在其他實施方案中，r7為c4烴氧基烴基。在一些實施方案中，r7為c5烴氧基烴基。在其他實施方案中，r7為c6烴氧基烴基。如上文所述，連接體基團l在其主鏈中包含選自烴基(例如-ch2-ch2-)、烴氧基(-c-o-c-)以及烴基氨基(例如-ch2-nh-)的鍵，條件是l中的端原子(例如鄰近羰基或氮的那些)為碳原子。盡管支鏈鍵(例如-ch2-chch3-)是可能的，連接子通常為無支鏈的。在一實施方案中，連接子為碳氫化合物連接基團。此類連接子可具有結構(ch2)n-，其中n為1-12，優(yōu)選2-8并且更優(yōu)選2-6。提供了具有任何數(shù)量的(a)型鍵的寡聚物。在一些實施方案中，寡聚物不包含(a)型鍵。在某些實施方案中，百分之5、10、20、30、40、50、60、70、80或90的鍵為(a)鍵。在選擇的實施方案中，百分之10-80、20-80、20-60、20-50、20-40或20-35的鍵為(a)鍵。2.鍵b在一些實施方案中，寡聚物包含至少一個(b)型鍵。例如，寡聚物可以包含1、2、3、4、5、6或更多個(b)型鍵。(b)型鍵可以鄰近或散布在整個寡聚物。(b)型鍵具有以下結構(i)或其鹽或異構體:其中：w每次出現(xiàn)時獨立地為s或o；x每次出現(xiàn)時獨立地為-nr8r9或-or3；并且y每次出現(xiàn)時獨立地為o或-nr10，r3每次出現(xiàn)時獨立地為氫或c1-c6烴基；r8每次出現(xiàn)時獨立地為氫或c2-c12烴基；r9每次出現(xiàn)時獨立地為氫、c1-c12烴基、c1-c12芳烴基或芳基；r10每次出現(xiàn)時獨立地為氫、c1-c12烷基或-lnr4r5r7；其中r8和r9可以連接以形成5-18元單環(huán)或二環(huán)雜環(huán)，或者r8、r9或r3可以與r10連接以形成5-7元雜環(huán)，并且其中當x為4-哌嗪基時，x具有以下結構(iii)：其中：r11每次出現(xiàn)時獨立地為c2-c12烴基、c1-c12氨基烴基、c1-c12烴基羰基、芳基、雜芳基或雜環(huán)基；r每次出現(xiàn)時獨立地為電子對、氫或c1-c12烴基；以及r12每次出現(xiàn)時獨立地為氫、c1-c12烴基、c1-c12氨基烴基、-nh2、-conh2、-nr13r14、-nr13r14r15、c1-c12烴基羰基、氧、-cn、三氟甲基、酰胺基、脒基、脒基烴基、脒基烴基羧基、胍基、胍基烴基、胍基烴基羰基、膽酸酯、脫氧膽酸酯、芳基、雜芳基、雜環(huán)基、-sr13、或c1-c12烴氧基，其中r13、r14和r15每次出現(xiàn)時獨立地為c1-c12烴基。在一些實例中，寡聚物包含一個(b)型鍵。在一些其他實施方案中，寡聚物包含兩個(b)型鍵。在一些其他實施方案中，寡聚物包含三個(b)型鍵。在一些其他實施方案中，寡聚物包含四個(b)型鍵。在其他實施方案中，(b)型鍵是連續(xù)的(即，b型鍵互相鄰近)。在其他實施方案中，寡聚物中至少5％的鍵為(b)型；例如在一些實施方案中，5％-95％、10％-90％、10％-50％或10％-35％的鍵可以是(b)型鍵。在其他實施方案中，r3每次出現(xiàn)時獨立地為氫或c1-c6烴基。在其他實施方案中，r3可以為甲基。在一些實施方案中，r3可以為乙基。在一些其他實施方案中，r3可以為正丙基或異丙基。在其他實施方案中，r3可以為c4烴基。在一些實施方案中，r3可以為c5烴基。在一些實施方案中，r3可以為c6烴基。在一些實施方案中，r8每次出現(xiàn)時獨立地為氫或c2-c12烴基。在一些實施方案中，r8為氫。在其他實施方案中，r8為乙基。在一些其他實施方案中，r8為正丙基或異丙基。在一些實施方案中，r8為c4烴基。在其他實施方案中，r8為c5烴基。在其他實施方案中，r8為c6烴基。在一些實施方案中，r8為c7烴基。在其他實施方案中，r8為c8烴基。在其他實施方案中，r8為c9烴基。在其他實施方案中，r8為c10烴基。在一些其他實施方案中，r8為c11烴基。在其他實施方案中，r8為c12烴基。在一些實施方案中，r8為c2-c12烴基，并且所述c2-c12烴基包含一個或多個雙鍵(例如烯烴)、叁鍵(例如炔烴)或以上二者。在一些實施方案中，r8為未取代的c2-c12烴基。在一些實施方案中，r9每次出現(xiàn)時獨立地為氫、c1-c12烴基、c1-c12芳烴基或芳基。在一些實施方案中，r9為氫。在其他實施方案中，r9為c1-c12烴基。在其他實施方案中，r9為甲基。在其他實施方案中，r9為乙基。在一些其他實施方案中，r9為正丙基或異丙基。在一些實施方案中，r9為c4烴基。在一些實施方案中，r9為c5烴基。在其他實施方案中，r9為c6烴基。在一些其他實施方案中，r9為c7烴基。在一些實施方案中，r9為c8烴基。在一些實施方案中，r9為c9烴基。在一些其他實施方案中，r9為c10烴基。在一些其他實施方案中，r9為c11烴基。在其他實施方案中，r9為c12烴基。在一些其他實施方案中，r9為c1-c12芳烴基。例如，在一些實施方案中，r9為芐基，并且所述芐基可以在苯基環(huán)或芐基碳上任選地被取代。在這方面，取代基包括烴基和烴氧基，例如甲基或甲氧基。在一些實施方案中，芐基被甲基在芐基碳上取代。例如，在一些實施方案中，r9具有以下結構(xiv)：在其他實施方案中，r9為芳基。例如，在一些實施方案中，r9為苯基，并且所述苯基可以被任選地取代。在這方面，取代基包括烴基和烴氧基，例如甲基或甲氧基。在其他實施方案中，r9為苯基并且所述苯基包含冠醚部分，例如12-18元冠醚。在一實施方案中，冠醚為18元的并且還可以包含額外的苯基部分。例如，在一實施方案中，r9具有以下結構(xv)或(xvi)之一：在一些實施方案中，r10每次出現(xiàn)時獨立地為氫、c1-c12烴基或-lnr4r5r7，其中r4、r5和r7為上文(a)鍵所定義的那樣。在其他實施方案中，r10為氫。在其他實施方案中，r10為c1-c12烴基，并且在其他實施方案中，r10為-lnr4r5r7。在一些實施方案中，r10為甲基。在其他實施方案中，r10為乙基。在一些實施方案中，r10為c3烴基。在一些實施方案中，r10為c4烴基。在其他實施方案中，r10為c5烴基。在一些其他實施方案中，r10為c6烴基。在其他實施方案中，r10為c7烴基。在其他實施方案中，r10為c8烴基。在一些實施方案中，r10為c9烴基。在其他實施方案中，r10為c10烴基。在其他實施方案中，r10為c11烴基。在一些其他實施方案中，r10為c12烴基。在一些實施方案中，r8和r9結合形成5-18元單環(huán)或二環(huán)雜環(huán)。在一些實施方案中，所述雜環(huán)為5元或6元的單環(huán)雜環(huán)。例如，在一些實施方案中，(b)鍵具有以下結構(iv)：在其他實施方案中，雜環(huán)為雙環(huán)，例如12元雙環(huán)雜環(huán)。雜環(huán)可以為哌嗪基。雜環(huán)可以為嗎啉基。雜環(huán)可以為哌啶基。雜環(huán)可以為十氫異喹啉。典型的雜環(huán)包括以下：在一些實施方案中，r11每次出現(xiàn)時獨立地為c2-c12烴基、c1-c12氨基烴基、芳基、雜芳基或雜環(huán)基。在一些實施方案中，r11為c2-c12烴基。在一些實施方案中，r11為乙基。在一些實施方案中，r11為c3烴基。在其他實施方案中，r11為異丙基。在一些其他實施方案中，r11為c4烴基。在其他實施方案中，r11為c5烴基。在一些實施方案中，r11為c6烴基。在其他實施方案中，r11為c7烴基。在一些實施方案中，r11為c8烴基。在其他實施方案中，r11為c9烴基。在其他實施方案中，r11為c10烴基。在一些其他實施方案中，r11為c11烴基。在一些實施方案中，r11為c12烴基。在其他實施方案中，r11為c1-c12氨基烴基。在一些實施方案中，r11為甲氨基。在一些實施方案中，r11為乙氨基。在其他實施方案中，r11為c3氨基烴基。在其他實施方案中，r11為c4氨基烴基。在一些其他實施方案中，r11為c5氨基烴基。在其他實施方案中，r11為c6氨基烴基。在其他實施方案中，r11為c7氨基烴基。在一些實施方案中，r11為c8氨基烴基。在其他實施方案中，r11為c9氨基烴基。在其他實施方案中，r11為c10氨基烴基。在一些其他實施方案中，r11為c11氨基烴基。在其他實施方案中，r11為c12氨基烴基。在其他實施方案中，r11為c1-c12烴基羰基。在其他實施方案中，r11為c1烴基羰基。在其他實施方案中，r11為c2烴基羰基。在一些實施方案中，r11為c3烴基羰基。在其他實施方案中，r11為c4烴基羰基。在一些實施方案中，r11為c5烴基羰基。在一些其他實施方案中，r11為c6烴基羰基。在其他實施方案中，r11為c7烴基羰基。在其他實施方案中，r11為c8烴基羰基。在一些實施方案中，r11為c9烴基羰基。在其他實施方案中，r11為c10烴基羰基。在一些其他實施方案中，r11為c11烴基羰基。在一些實施方案中，r11為c12烴基羰基。在其他實施方案中，r11為-c(＝o)(ch2)nco2h，其中n為1-6。例如，在一些實施方案中，n為1。在其他實施方案中，n為2。在其他實施方案中，n為3。在一些其他實施方案中，n為4。在其他實施方案中，n為5。在其他實施方案中，n為6。在其他實施方案中，r11為芳基。例如，在一些實施方案中，r11為苯基。在一些實施方案中，苯基被取代，例如被硝基取代。在其他實施方案中，r11為雜芳基。例如，在一些實施方案中，r11為吡啶基。在其他實施方案中，r11為嘧啶基。在其他實施方案中，r11為雜環(huán)基。例如，在一些實施方案中，r11為哌啶基，例如哌啶-4-基。在一些實施方案中，r11為乙基、異丙基、哌啶基、嘧啶基、膽酸酯、脫氧膽酸酯或-c(＝o)(ch2)nco2h，其中n為1-6。在一些實施方案中，r為電子對。在其他實施方案中，r為氫，并且在其他實施方案中，r為c1-c12烴基。在一些實施方案中，r為甲基。在一些實施方案中，r為乙基。在其他實施方案中，r為c3烴基。在其他實施方案中，r為異丙基。在一些其他實施方案中，r為c4烴基。在其他實施方案中，r為c5烴基。在一些實施方案中，r為c6烴基。在其他實施方案中，r為c7烴基。在其他實施方案中，r為c8烴基。在其他實施方案中，r為c9烴基。在一些實施方案中，r為c10烴基。在其他實施方案中，r為c11烴基。在一些實施方案中，r為c12烴基。在一些實施方案中，r12每次出現(xiàn)時獨立地為氫、c1-c12烴基、c1-c12氨基烴基、-nh2、-conh2、-nr13r14、-nr13r14r15、氧、-cn、三氟甲基、酰胺基、脒基、脒基烴基、脒基烴基羰基、胍基、胍基烴基、胍基烴基羰基、膽酸酯、脫氧膽酸酯、芳基、雜芳基、雜環(huán)、-sr13或c1-c12烴氧基，其中r13、r14和r15每次出現(xiàn)時獨立地為c1-c12烴基。在一些實施方案中，r12為氫。在一些實施方案中，r12為c1-c12烴基。在一些實施方案中，r12為c1-c12氨基烴基。在一些實施方案中，r12為-nh2。在一些實施方案中，r12為-conh2。在一些實施方案中，r12為-nr13r14。在一些實施方案中，r12為-nr13r14r15。在一些實施方案中，r12為c1-c12烴基羰基。在一些實施方案中，r12為氧。在一些實施方案中，r12為-cn。在一些實施方案中，r12為三氟甲基。在一些實施方案中，r12為酰胺基。在一些實施方案中，r12為脒基。在一些實施方案中，r12為脒基烴基。在一些實施方案中，r12為脒基烴基羰基。在一些實施方案中，r12為胍基、例如單甲基胍基或二甲基胍基。在一些實施方案中，r12為胍基烴基。在一些實施方案中，r12為脒基烴基羰基。在一些實施方案中，r12為膽酸酯。在一些實施方案中，r12為脫氧膽酸酯。在一些實施方案中，r12為芳基。在一些實施方案中，r12為雜芳基。在一些實施方案中，r12為雜環(huán)。在一些實施方案中，r12為-sr13。在一些實施方案中，r12為c1-c12烴氧基。在一些實施方案中，r12為二甲胺。在其他實施方案中，r12為甲基。在其他實施方案中，r12為乙基。在一些實施方案中，r12為c3烴基。在一些實施方案中，r12為異丙基。在一些實施方案中，r12為c4烴基。在其他實施方案中，r12為c5烴基。在其他實施方案中，r12為c6烴基。在一些其他實施方案中，r12為c7烴基。在一些實施方案中，r12為c8烴基。在其他實施方案中，r12為c9烴基。在一些實施方案中，r12為c10烴基。在其他實施方案中，r12為c11烴基。在其他實施方案中，r12為c12烴基。在其他實施方案中，烴基部分被一個或多個氧原子取代以形成酯部分，例如甲氧基甲基部分。在一些實施方案中，r12為甲基氨基。在其他實施方案中，r12為乙基氨基。在其他實施方案中，r12為c3氨基烴基。在一些實施方案中，r12為c4氨基烴基。在其他實施方案中，r12為c5氨基烴基。在一些其他實施方案中，r12為c6氨基烴基。在一些實施方案中，r12為c7氨基烴基。在一些實施方案中，r12為c8氨基烴基。在其他實施方案中，r12為c9氨基烴基。在一些其他實施方案中，r為c10氨基烴基。在其他實施方案中，r12為c11氨基烴基。在其他實施方案中，r12為c12氨基烴基。在一些實施方案中，氨基烴基為二甲基氨基烴基。在其他實施方案中，r12為乙?；Ｔ谝恍┢渌麑嵤┓桨钢?，r12為c2烴基羰基。在一些實施方案中，r12為c3烴基羰基。在其他實施方案中，r12為c4烴基羰基。在一些實施方案中，r12為c5烴基羰基。在其他實施方案中，r12為c6烴基羰基。在一些其他實施方案中，r12為c7烴基羰基。在一些實施方案中，r12為c8烴基羰基。在其他實施方案中，r12為c9烴基羰基。在一些其他實施方案中，r12為c10烴基羰基。在一些實施方案中，r12為c11烴基羰基。在其他實施方案中，r12為c12烴基羰基。烴基羰基被羧基部分取代，例如烴基羰基被取代以形成琥珀酸部分(即，3-羧基烴基羰基)。在其他實施方案中，烴基羰基被端-sh基團取代。在一些實施方案中，r12為酰胺基。在一些實施方案中，酰胺基包含被進一步取代的烴基部分，例如用-sh、氨基甲酸酯或其組合取代。在其他實施方案中，酰胺基被芳基部分取代，例如苯基。在某些實施方案中，r12可以具有以下機構(ix):其中r16每次出現(xiàn)時獨立地為氫、c1-c12烴基、c1-c12烴氧基、-cn、芳基或雜芳基。在一些實施方案中，r12為甲氧基。在其他實施方案中，r12為乙氧基。在其他實施方案中，r12為c3烴氧基。在一些實施方案中，r12為c4烴氧基。在一些實施方案中，r12為c5烴氧基。在一些其他實施方案中，r12為c6烴氧基。在其他實施方案中，r12為c7烴氧基。在一些其他實施方案中，r12為c8烴氧基。在一些實施方案中，r12為c9烴氧基。在其他實施方案中，r12為c10烴氧基。在一些實施方案中，r為c11烴氧基。在其他實施方案中，r為c12烴氧基。在某些實施方案中，r12為吡咯烷基，例如吡咯烷-l-基。在其他實施方案中，r12為哌啶基，例如哌啶-l-基或哌啶-4-基。在其他實施方案中，r12為嗎啉基，例如嗎啉基-4-基。在其他實施方案中，r12為苯基，并且在其他實施方案中，苯基是被取代的，例如被硝基取代。在其他實施方案中，r12為嘧啶基，例如嘧啶-2-基。在其他實施方案中，r13、r14和r15每次出現(xiàn)時獨立地為c1-c12烴基。在一些實施方案中，r13、r14或r15為甲基。在其他實施方案中，r13、r14或r15為乙基。在其他實施方案中，r13、r14或r15為c3烴基。在其他實施方案中，r13、r14或r15為異丙基。在其他實施方案中，r13、r14或r15為c4烴基。在一些實施方案中，r13、r14或r15為c5烴基。在一些其他實施方案中，r13、r14或r15為c6烴基。在其他實施方案中，r13、r14或r15為c7烴基。在其他實施方案中，r13、r14或r15為c8烴基。在其他實施方案中，r13、r14或r15為c9烴基。在一些實施方案中，r13、r14或r15為c10烴基。在一些實施方案中，r13、r14或r15為c11烴基。在其他實施方案中，r13、r14或r15為c12烴基。如上文所述，在一些實施方案中，r12為被芳基部分取代的酰胺基。在這種情況下，r16每次出現(xiàn)時可以是相同的或不同的。在某些這些實施方案中，r16為氫。在其他實施方案中，r16為-cn。在其他實施方案中，r16為雜芳基，例如四唑基。在某些其他實施方案中，r16為甲氧基。在其他實施方案中，r16為芳基，并且芳基任選地被取代。在這方面，任選的取代基包括：c1-c12烴基、c1-c12烴氧基，例如甲氧基；三氟甲氧基；鹵素，例如氯；以及三氟甲基。在其他實施方案中，r16為甲基。在其他實施方案中，r16為乙基。在一些實施方案中，r16為c3烴基。在一些其他實施方案中，r16為異丙基。在其他實施方案中，r16為c4烴基。在其他實施方案中，r16為c5烴基。在其他實施方案中，r16為c6烴基。在一些其他實施方案中，r16為c7烴基。在一些實施方案中，r16為c8烴基。在其他實施方案中，r16為c9烴基。在一些其他實施方案中，r16為c10烴基。在其他實施方案中，r16為c11烴基。在一些其他實施方案中，r16為c12烴基。在一些實施方案中，r16為甲氧基。在一些實施方案中，r16為乙氧基。在其他實施方案中，r16為c3烴氧基。在一些其他實施方案中，r16為c4烴氧基。在其他實施方案中，r16為c5烴氧基。在一些其他實施方案中，r16為c6烴氧基。在其他實施方案中，r16為c7烴氧基。在一些其他實施方案中，r16為c8烴氧基。在其他實施方案中，r16為c9烴氧基。在一些其他實施方案中，r16為c10烴氧基。在一些實施方案中，r16為c11烴氧基。在一些其他實施方案中，r16為c12烴氧基。在一些其他實施方案中，r8和r9結合以形成12-18元冠醚。例如，在一些實施方案中，冠醚為18元的，并且在其他實施方案中，冠醚為15元的。在某些實施方案中，r8和r9結合以形成具有以下結構(x)或(xi)之一的雜環(huán):在一些實施方案中，r8、r9或r3與r10結合以形成5-7元雜環(huán)。例如，在一些實施方案中，r3與r10結合以形成5-7元雜環(huán)。在一些實施方案中，雜環(huán)為5元的。在其他實施方案中，雜環(huán)為6元的。在其他實施方案中，雜環(huán)為7元的。在一些實施方案中，雜環(huán)由以下結構(xii)表示:其中z’表示5-7元雜環(huán)。在結構(xi)的某些實施方案中，r12每次出現(xiàn)時為氫。例如，鍵(b)可以具有以下結構(bl)、(b2)或(b3)之一:在某些其他實施方案中，r12為c1-c12烴基羰基或酰胺基，其被芳基磷?；糠诌M一步取代，例如被三苯基磷?；糠秩〈?。具有該結構的鍵的實例包括b56和b55。在某些實施方案中，鍵(b)不具有結構a1-a5的任何一種。表1示出典型的(a)型鍵和(b)型鍵。表1.典型的亞基間鍵在以下序列和討論中，鍵的上述名稱經(jīng)常使用。例如，包含pmoapn鍵的堿基表示為apnb，其中b為堿基。其他鍵類似地命名。此外，可以使用縮寫的命名，例如，可以使用括號中的縮寫命名(例如，ab指apnb)。還可以使用其他容易確定的縮寫。b.具有修飾的端基的寡聚物如上所述，本公開還提供包含修飾的端基的寡聚物。申請人已發(fā)現(xiàn)，用多種化學部分修飾寡聚物的3’和/或5’末端對所述寡聚物提供了有益的治療性質(例如，增強的細胞遞送、效能和/或組織分布等)。在多個實施方案中，修飾的端基包含疏水性部分，而在其他實施方案中，修飾的端基包含親水性部分。修飾的末端基團可以與上文所述的鍵同時或不同時存在。例如，在一些實施方案中，寡聚物包含一個或多個修飾的端基和(a)型鍵，例如其中x為-n(ch3)2的鍵。在其他實施方案中，寡聚物包含一個或多個修飾的端基和(b)型鍵，例如其中x為4-氨基哌啶-l-基(即，apn)的鍵。在其他實施方案中，寡聚物包含一個或多個修飾的端基和(a)型鍵與(b)型鍵的混合。例如，寡聚物可以包含一個或多個修飾的端基(例如，三苯甲基或三苯基乙?；?以及其中x為-n(ch3)2的鍵和其中x為4-氨基哌啶-l-基的鍵。修飾的端基和修飾的鍵的其他組合也向寡聚物提供了有利的治療性質。在一實施方案中，包含末端修飾的寡聚物具有以下結構(xvii)或其鹽或異構體：其中x、w和y如上文(a)鍵和(b)鍵中的任何一個所定義，以及：r17每次出現(xiàn)時獨立地為不存在、氫或c1-c6烴基；r18和r19每次出現(xiàn)時獨立地為不存在、氫、細胞穿透肽、天然或非天然氨基酸、c2-c30烴基羰基、-c(＝o)or21或r20；r20每次出現(xiàn)時獨立地為胍基、雜環(huán)基、c1-c30烴基、c3-c8環(huán)烴基；c6-c30芳基、c7-c30芳烴基、c3-c30烴基羰基、c3-c8環(huán)烴基羰基、c3-c8環(huán)烴基烴基羰基、c7-c30芳基羰基、c7-c30芳烴基羰基、c2-c30烴氧基羰基、c3-c8環(huán)烴氧基羰基、c7-c30芳氧基羰基、c8-c30芳烴氧基羰基或-p(＝o)(r22)2；b為堿基配對部分；l1為任選的長度高達18個原子的連接基團，其包括選自以下的鍵：烴基、羥基、烴氧基、烴基氨基、酰胺、酯、二硫化物、羰基、氨基甲酸酯、二氨基磷酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、哌嗪和磷酸二酯；以及x為0或更大的整數(shù)；并且其中r18或r19中的至少一個為r20；并且其中r18或r19中的至少一個為r20，并且條件是r17和r18都存在。具有修飾的端基的寡聚物可以包含任意數(shù)量的(a)型鍵和(b)型鍵。例如，寡聚物可以僅包含(a)型鍵。例如，每個鍵中的x可以為-n(ch3)2。或者，寡聚物可以僅包含(b)鍵。在某些實施方案中，寡聚物包含(a)鍵和(b)鍵的混合，例如包含1-4個(b)型鍵，剩下的鍵為(a)型。在這種情況下，鍵包括但不限于，其中對于(b)型而言x為氨基哌啶基的鍵，以及對于(a)型而言x為二甲基氨基的鍵。在一些實施方案中，r17不存在。在一些實施方案中，r17為氫。在一些實施方案中，r17為c1-c6烴基。在一些實施方案中，r17為甲基。在其他實施方案中，r17為乙基。在一些實施方案中，r17為c3烴基。在一些其他實施方案中，r17為異丙基。在其他實施方案中，r17為c4烴基。在其他實施方案中，r17為c5烴基。在一些其他實施方案中，r17為c6烴基。在其他實施方案中，r18不存在。在一些實施方案中，r18為氫。在一些實施方案中，r18為下文更詳述的細胞穿透肽。在一些實施方案中，r18為天然或非天然氨基酸，例如三甲基甘氨酸。在一些實施方案中，r18為r20。在其他實施方案中，r19不存在。在一些實施方案中，r19為氫。在一些實施方案中，r19為下文更詳述的細胞穿透。在一些實施方案中，r19為天然或非天然氨基酸，例如三甲基甘氨酸。在一些實施方案中，r19為-c(＝o)or17，例如r19可以具有以下結構:在其他實施方案中，r18或r19為c2-c30烴基羰基，例如-c(＝o)(ch2)nco2h，其中n為1-6，例如為2。在其他實例中，r18或r19為乙?；?。在一些實施方案中，r20每次出現(xiàn)時獨立地為胍基、雜環(huán)基、c1-c30烴基、c3-c8環(huán)烴基；c6-c30芳基、c7-c30芳烴基、c3-c30烴基羰基、c3-c8環(huán)烴基羰基、c3-c8環(huán)烴基烴基羰基、c6-c30芳基羰基、c7-c30芳烴基羰基、c2-c30烴氧基羰基、c3-c8環(huán)烴氧基羰基、c7-c30芳氧基羰基、c8-c30芳烴氧基羰基、-c(＝o)or21或-p(＝o)(r22)2，其中r21為包含一個或多個氧或羥基部分或其組合的c1-c30烴基，并且每個r22為c6-c12芳氧基。在某些其他實施方案中，r19為-c(＝o)or21并且r18為氫、胍基、雜環(huán)基、c1-c30烴基、c3-c8環(huán)烴基；c6-c30芳基、c3-c30烴基羰基、c3-c8環(huán)烴基羰基、c3-c8環(huán)烴基烴基羰基、c7-c30芳基羰基、c7-c30芳烴基羰基、c2-c30烴氧基羰基、c3-c8環(huán)烴氧基羰基、c7-c30芳氧基羰基、c8-c30芳烴氧基羰基或-p(＝o)(r22)2，其中每個r22為c6-c12芳氧基。在其他實施方案中，r20每次出現(xiàn)時獨立地為胍基、雜環(huán)基、c1-c30烴基、c3-c8環(huán)烴基；c6-c30芳基、c3-c30烴基羰基、c3-c8環(huán)烴基羰基、c3-c8環(huán)烴基烴基羰基、c7-c30芳基羰基、c7-c30芳烴基羰基、c2-c30烴氧基羰基、c3-c8環(huán)烴氧基羰基、c7-c30芳氧基羰基、c8-c30芳烴氧基羰基或-p(＝o)(r22)2。而在其他實例中，r20每次出現(xiàn)時獨立地為胍基、雜環(huán)基、c1-c30烴基、c3-c8環(huán)烴基；c6-c30芳基、c7-c30芳烴基、c3-c8環(huán)烴基羰基、c3-c8環(huán)烴基烴基羰基、c7-c30芳基羰基、c7-c30芳烴基羰基、c2-c30烴氧基羰基、c3-c8環(huán)烴氧基羰基、c7-c30芳氧基羰基、c8-c30芳烴氧基羰基或-p(＝o)(r22)2。在一些實施方案中，r20為胍基，例如單甲基胍基或二甲基胍基。在其他實施方案中，r20為雜環(huán)基。例如，在一些實施方案中，r20為哌啶-4-基。在一些實施方案中，哌啶-4-基被三苯甲基或boc基團取代。在其他實施方案中，r20為c3-c8環(huán)烴基。在其他實施方案中，r20為c6-c30芳基。在一些實施方案中，r20為c7-c30芳基羰基。例如，在一些實施方案中，r20具有以下結構(xviii):其中r23每次出現(xiàn)時獨立地為氫、鹵素、c1-c30烴基、c1-c30烴氧基、c1-c30烴氧基羰基、c7-c30芳烴基、芳基、雜芳基、雜環(huán)基或雜環(huán)烴基，并且其中一個r23可以與另一個r23連接以形成雜環(huán)基環(huán)。在一些實施方案中，至少一個r23為氫，例如在一些實施方案中，每個r23為氫。在其他實施方案中，至少一個r23為c1-c30烴氧基，例如在一些實施方案中，每個r23為甲氧基。在其他實施方案中，至少一個r23為雜芳基，例如在一些實施方案中，至少一個r23具有以下結構(xviiia)或(xviiib)之一:在其他實施方案中，一個r23與另一個r23連接以形成雜環(huán)基環(huán)。例如，在一實施方案中，r20為5-羧基熒光素。在其他實施方案中，r20為c7-c30芳烴基羰基。例如，在多個實施方案中，r20具有以下結構(xix)、(xx)或(xxi)之一:其中r23每次出現(xiàn)時獨立地為氫、鹵素、c1-c30烴基、c1-c30烴氧基、c1-c30烴氧基羰基、c7-c30芳烴基、芳基、雜芳基、雜環(huán)基或雜環(huán)烴基，其中一個r23可以與另一個r23連接以形成雜環(huán)基環(huán)，x為-oh或鹵素，并且m為0-6的整數(shù)。在一些具體實施方案中，m為0。在其他實施方案中，m為1，而在其他實施方案中，m為2。在其他實施方案中，至少一個r23為氫，例如在一些實施方案中，每個r23為氫。在一些實施方案中，x為氫。在其他實施方案中，x為-oh。在其他實施方案中，x為cl。在其他實施方案中，至少一個r23為c1-c30烴氧基，例如甲氧基。在其他實施方案中，r20為c7-c30芳烴基，例如三苯甲基。在其他實施方案中，r20為甲氧基三苯甲基。在一些實施方案中，r20具有以下結構(xxii):其中r23每次出現(xiàn)時獨立地為氫、鹵素、c1-c30烴基、c1-c30烴氧基、c1-c30烴氧基羰基、c7-c30芳烴基、芳基、雜芳基、雜環(huán)基或雜環(huán)烴基、并且其中一個r23可以與另一個r23連接以形成雜環(huán)基環(huán)。例如，在一些實施方案中，每個r23為氫。在其他實施方案中，至少一個r23為c1-c30烴氧基，例如甲氧基。在其他實施方案中，r20為c7-c30芳烴基并且r20具有以下結構(xxiii):在一些實施方案中，至少一個r23為鹵素，例如氯。在一些其他實施方案中，一個r23為處于對位的氯。在其他實施方案中，r20為c1-c30烴基。例如，在一些實施方案中，r20為c4-c20烴基并且任選地包含一個或多個雙鍵。例如，在一些實施方案中，r20為包含叁鍵的c4-10烴基，例如末端叁鍵。在一些實施方案中，r20為己炔-6-基。在一些實施方案中，r20具有以下結構(xxiv)、(xxv)、(xxvi)或(xxvii)之一:在其他實施方案中，r20為c3-c30烴基羰基，例如c3-c10烴基羰基。在一些實施方案中，r20為-c(＝o)(ch2)psh或-c(＝o)(ch2)psshet，其中p為1-6的整數(shù)，并且het為雜芳基。例如，p可以為1或p可以為2。在其他實例中het為吡啶基，例如吡啶-2-基。在其他實施方案中，c3-c30烴基羰基被另一寡聚物取代，例如在一些實施方案中，寡聚物在3’位包含c3-c30烴基羰基，所述c3-c30烴基羰基將該寡聚物與另一寡聚物的3’位連接。這種末端修飾可以包括在本公開的范圍內。在其他實施方案中，r20為被諸如三苯基磷?；姆蓟柞；糠诌M一步取代的c3-c30烴基羰基。這類r20基團的實例包括表2中的結構33。在其他實例中，r20為c3-c8環(huán)烴基羰基，例如c5-c7烴基羰基。在這些實施方案中，r20具有以下結構(xxviii):其中r23每次出現(xiàn)時獨立地為氫、鹵素、c1-c30烴基、c1-c30烴氧基、c1-c30烴氧基羰基、c7-c30芳烴基、芳基、雜芳基、雜環(huán)基或雜環(huán)烴基，并且其中一個r23可以與另一個r23連接以形成雜環(huán)基環(huán)。在一些實施方案中，r23為雜環(huán)基烴基，例如在一些實施方案中，r23具有以下結構:在一些其他實施方案中，r20為c3-c8環(huán)烴基烴基羰基。在其他實施方案中，r20為c2-c30烴氧基羰基。在其他實施方案中，r20為c3-c8環(huán)烴氧基羰基。在其他實施方案中，r20為c7-c30芳氧基羰基。在其他實施方案中，r20為c8-c30芳烴氧基羰基。在其他實施方案中，r20為-p(＝o)(r22)2，其中每個r22為c6-c12芳氧基，例如在一些實施方案中，r20具有以下結構(c24):在其他實施方案中，r20包含一個或多個鹵素原子。例如，在一些實施方案中，r20包括任意上述r20部分的全氟類似物。在其他實施方案中，r20為對-三氟甲基苯基、三氟甲基三苯甲基、全氟戊基或五氟苯基。在一些實施方案中，3’末端包含修飾，并且在其他實施方案中5’末端包含修飾。在其他實施方案中，3’和5’末端都包含修飾。因此，在一些實施方案中，r18不存在且r19為r20。在其他實施方案中，r19不存在且r18為r20。在其他實施方案中，r18和r19各自為r20。在一些實施方案中，除了3’或5’修飾，寡聚物包含細胞穿透肽。因此，在一些實施方案中，r19為細胞穿透肽并且r18為r20。在其他實施方案中，r18為細胞穿透肽并且r19為r20。在前述的其它實施方案中，細胞穿透肽為富精氨酸肽。在一些實施方案中，連接5’端基(即，r19)與寡聚物的連接基團l1可以存在或不存在。連接基團包含任意數(shù)量的官能團和長度，條件是連接基團保留其使5’端基與寡聚物連接的能力，并且條件是連接基團不干擾寡聚物以序列特異性方式結合其靶序列的能力。在一實施方案中，l包括二氨基磷酸酯鍵和哌嗪鍵。例如，在一些實施方案中，l具有以下結構(xxix):其中r24為不存在、氫或c1-c6烴基。在一些實施方案中，r24不存在。在一些實施方案中，r24為氫。在一些實施方案中，r24為c1-c6烴基。在一些實施方案中，r24為甲基。在其他實施方案中，r24為乙基。在其他實施方案中，r24為c3烴基。在一些其他實施方案中，r24為異丙基。在其他實施方案中，r24為c4烴基。在一些實施方案中，r24為c5烴基。在其他實施方案中，r24為c6烴基。在其他實施方案中，r20為c3-c30烴基羰基、并且r20具有以下結構(xxx):其中r25為氫或-sr26，其中r26為氫、c1-c30烴基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基、并且q為0至6的整數(shù)。在任意上述的其他實施方案，r23每次出現(xiàn)時獨立地為氫、鹵素、c1-c30烴基、c1-c30烴氧基、芳基、雜芳基、雜環(huán)基或雜環(huán)烴基。在一些其他實施方案中，僅寡聚物的3’末端結合到上述基團之一。在一些其他實施方案中，僅寡聚物的5’末端結合到上述基團之一。在其他實施方案中，3’和5’末端均包含上述基團之一。端基可以選自上述基團中的任一個或表2列出的任意具體基團。表2.典型的端基1.肽轉運蛋白在一些實施方案匯總，個體寡聚物結合到肽轉運蛋白部分上，例如細胞穿透肽轉運部分，其有效地增強寡聚物轉運進細胞中。例如，在一些實施方案中，肽轉運蛋白部分為富精氨酸肽。在另一實施方案中，轉運部分連接到寡聚物的5’或3’末端，例如圖1c中所示。當這類肽結合到任一末端，則相反的末端可用于進一步結合到本文所述的修飾的端基。在前述的一些實施方案中，肽轉運部分包含6-16個選自以下的亞基：x’亞基、y’亞基和z’亞基，其中(a)每個x’亞基獨立地表示賴氨酸、精氨酸或精氨酸類似物，所述類似物為包含r33n＝c(nh2)r34結構的側鏈的陽離子α-氨基酸，其中r33為h或r；r34為r35、nh2、nhr或nr34，其中r35為低級烷基或低級烯基并且還可包括氧或氮；r33與r34可共同形成環(huán)；并且側鏈經(jīng)由r33或r34連接至所述氨基酸；(b)每個y’亞基獨立地表示中性氨基酸-c(o)-(chr)n-nh-，其中n為2-7并且每個r獨立地為h或甲基；以及(c)每個z’亞基獨立地表示具有中性芳烴基側鏈的α-氨基酸；其中，所述肽包含由(x’y’x’)p、(x’y’)m和(x’z’z’)p之一表示的序列，其中p為2-5并且m為2-8。在選擇的實施方案中，對每個x’而言，側鏈部分為胍基，如在氨基酸亞基精氨酸(arg)中。在其他實施方案中，每個y’為-co-(ch2)n-chr-nh-，其中n為2-7并且r為h。例如，當n為5并且r為h時，y’為6-氨基己酸亞基，本文簡寫為ahx；當n為2并且r為h時，y’為β-丙氨酸亞基。在某些實施方案中，該類型的肽包括包含被單個y’亞基間隔的精氨酸二聚物的那些肽，其中y’為ahx。實例包括具有通式(ry’r)p或通式(rry’)p的肽，其中y’為ahx。在一實施方案中，y’為6-氨基己酸亞基，r為精氨酸并且p為4。在其他實施方案中，每個z’為苯基丙氨酸，并且m為3或4。在一些實施方案中，結合的肽通過連接基團ahx-b連接到寡聚物末端，其中ahx為6-氨基己酸亞基并且b為β-丙氨酸亞基。在選擇的實施方案中，對于每個x’而言，側鏈部分獨立地選自：胍基(hn＝c(nh2)nh-)、脒基(hn＝c(nh2)c-)、2-氨基二氫嘧啶基、2-氨基四氫嘧啶基、2-氨基吡啶基和2-氨基嘧啶酮基，并且其優(yōu)選選自胍基和脒基。在一實施方案中，側鏈部分為胍基，如在氨基酸亞基精氨酸(arg)中。在一些實施方案中，y’亞基可為連續(xù)的，因為沒有x’亞基介于y’亞基之間，或y’亞基可單獨散布在x’亞基之間。然而，在一些實施方案中，連接亞基可在y’亞基之間。在一實施方案中，y’亞基在肽轉運蛋白的末端；在其他實施方案中，它們在x’亞基的側翼。在其他實施方案中，每個y’為-co-(ch2)n-chr-nh-，其中n為2-7并且r為h。例如，當n為5并且r為h時，y’為6-氨基己酸亞基，本文縮寫為ahx。在選擇的該基團的實施方案中，每個x’包含胍基側鏈部分，如在精氨酸亞基中。該類型的示例性肽包括包含被單個y’亞基間隔的精氨酸二聚物的那些肽，其中y’優(yōu)選為ahx。實例包括具有通式(ry’r)4或通式(rry’)4的肽，其中y’優(yōu)選為ahx。在一些實施方案中，核酸類似物連接到末端y’亞基，優(yōu)選在c末端處，如圖1c所示。在其他實施方案中，連接基團具有結構ahxb，其中ahx為6-氨基己酸亞基并且b為β-丙氨酸亞基。上文所述的肽轉運部分已表明，相對于在結合的轉運部分不存在的情況下的寡聚物攝取以及相對于通過缺乏疏水性亞基y’的結合的轉運部分而進行的攝取，極大地增強了結合的寡聚物進入細胞。這類增強的攝取，在化合物到哺乳動物細胞的攝取方面，相對于通過缺乏疏水性亞基y’的結合的轉運部分而進行制劑攝取，可以被至少兩倍的增加或在其他實施方案中四倍的增加所證實。在一些實施方案中，相對于未結合的化合物，攝取增強至少20倍，或至少40倍。肽轉運部分的其他益處是其預期穩(wěn)定反義寡聚物和它的靶核酸序列之間的雙鏈體的能力。不希望被理論限制，穩(wěn)定雙鏈體的該能力可能是由于帶正電的轉運部分和待負電的核酸之間的靜電相互作用。在一些實施方案中，如上文所述，轉運蛋白中帶電的亞基數(shù)目少于14個，或在其他實施方案中為8-11個，因為太高數(shù)目的帶電亞基可能導致序列特異性的降低。包含連接基團(b或ahxb)的示例性富精氨酸細胞穿透肽轉運蛋白在以下表3中給出：表3.富精氨酸細胞穿透肽轉運蛋白命名為seqidno的a序列不包括連接基團部分(例如，c、g、ahx、b、ahxb，其中ahx和b分別指6-氨基己酸和β-丙氨酸)。c.寡聚物的性質如上文所述，本公開涉及包含多個修飾的寡聚物，所述修飾影響寡聚物的所需性質(例如增強的反義活性)。在某些實施方案中，寡聚物包含主鏈，所述主鏈包含由亞基間鍵連接的嗎啉環(huán)結構序列，所述亞基間鍵使一個嗎啉環(huán)結構的3’末端連接于鄰近的嗎啉環(huán)結構的5’末端，其中每個嗎啉環(huán)結構結合于堿基配對部分，使得寡聚物可以以序列特異性方式與靶核酸結合。嗎啉環(huán)結構可以具有以下結構(i)：其中b每次出現(xiàn)時獨立地為堿基配對部分。每個嗎啉環(huán)結構支持堿基配對部分(pi)以形成堿基配對部分的序列，其通常設計為與細胞中或被治療的個體中選擇的反義靶標雜化。堿基配對部分可為天然dna或rna(例如a、g、c、t或u)或類似物中得到的嘌呤或嘧啶，例如次黃嘌呤(核苷肌苷的堿基組分)或5-甲基胞嘧啶。還可以利用賦予寡聚物改善的結合親和性的類似物堿基。在這種情況下，示例性類似物包括c5-丙炔基-修飾的嘧啶、9-(氨基乙氧基)吩噁嗪(g型夾)等。如上所述，根據(jù)本發(fā)明的一方面，寡聚物可被修飾以包括一個或多個(b)鍵，例如多達約1個/每2個-5個不帶電荷的鍵，通常3-5個/每10個不帶電荷的鍵。某些實施方案還包括一個或多個(b)型鍵。當高達約一半的主鏈鍵為(b)型時，可得到反義活性的優(yōu)化的改善。當小數(shù)目、例如10-20％的b鍵時，通?？梢娨恍┑⒎亲畲蟮脑鰪姟Ｔ谝粚嵤┓桨钢?，(a)型鍵和(b)型鍵沿主鏈散布。在一些實施方案中，寡聚物沿其整個長度不具有(a)鍵和(b)鍵的嚴格交替形式。寡聚物可以任選地包含上文所述的5’和/或3’修飾。還考慮的是具有(a)鍵嵌段和(b)鍵嵌段的寡聚物；例如，(b)鍵的嵌段還可以位于(a)鍵的中心嵌段側面，或反之亦然。在一實施方案中，寡聚物具有大致等長的5’、3’和中心區(qū)，并且中心區(qū)中的(b)或(a)鍵的百分比大于約50％，或大于約70％。用于反義應用的寡聚物通常長度范圍在約10個至約40個亞基，更優(yōu)選約15個至25個亞基。例如，具有19至20個亞基(反義寡聚物的有用長度)的本發(fā)明寡聚物可以理論上具有2至7個，例如4至6個或3至5個(b)鍵，剩余的為(a)鍵。具有14個至15個亞基的寡聚物可以理論上具有2至5個，例如3個或4個(b)鍵，并且剩余的為(a)鍵。嗎啉代亞基還可以通過如下文進一步描述的非基于磷的亞基間鍵連接，其中至少一個鍵為(b)鍵。還可使用其他的寡核苷酸類似物鍵，其在它們未修飾的狀態(tài)中為不帶電荷的但是其也可帶有側胺取代基。例如，嗎啉環(huán)上的5’氮原子可以用于磺酰胺鍵(或尿素鍵，其中磷分別被碳或硫替代)。在一些用于反義應用的實施方案中，寡聚物可以與核酸靶序列100％互補，或其可以包含錯配，例如以適應變體，只要在寡聚物和核酸靶序列之間形成的異源雙鏈體足夠穩(wěn)定從而耐受細胞核酸酶作用和體內可能發(fā)生的其他模式的降解。如果存在錯配，則錯配對雜化雙鏈體的末端區(qū)域比在中部更穩(wěn)定(lessdestabilizing)。根據(jù)雙鏈體穩(wěn)定性的公知的原則，允許錯配的數(shù)目將取決于寡聚物的長度、雙鏈體中g：c堿基對的百分比以及雙鏈體中錯配的位置。盡管這樣的反義寡聚物不必與核酸靶序列100％互補，其有效地與靶序列穩(wěn)定且特異性結合，從而調節(jié)核酸靶標的生物活性，例如編碼的蛋白的表達。寡聚物和靶序列之間形成的雙鏈體的穩(wěn)定性是結合tm和雙鏈體對細胞酶切割的易感性的函數(shù)。反義化合物關于互補序列rna的tm可以通過常規(guī)方法測量，例如hamesetal.,nucleicacidhybridization(核酸雜化),irlpress,1985,pp.107-108所述的那些，或在miyadac.g.和wallacer.b.,1987,oligonucleotidehybridizationtechniques(寡核苷酸雜交技術),methodsenzymol.vol.154pp.94-107.中所述。在一些實施方案中，每個反義寡聚物與互補序列rna之間的結合tm高于體溫，或在其他實施方案中高于50℃。在其他實施方案中，tm’為60-80℃或更高。根據(jù)公知的原則，可以通過增加雙鏈體中c：g配對堿基的比例和/或通過增加異源雙鏈體的長度(以堿基對計)來增加寡聚物化合物對于互補堿基的rna混雜物的tm。同時，出于使細胞攝取最佳化的目的，限制寡聚物的尺寸應是有利的。因此，在20個堿基或更小的長度上顯出高tm(50℃或更高的)的化合物通常優(yōu)于為高tm值而需要大于20個堿基的那些化合物。對于一些應用，更長的寡聚物，例如長于20個堿基可能具有某些優(yōu)勢。例如，在某些實施方案中，更長的寡聚物可以在外顯子跳躍或剪切調節(jié)的用途中得到特別的效用。靶向序列堿基可以為正常的dna堿基或其類似物，例如能與靶序列rna堿基沃特森-克里克堿基配對的尿嘧啶和肌苷。當靶核苷酸為尿嘧啶殘基時，寡聚物還可以并入鳥嘌呤堿基來代替腺嘌呤。當靶序列對不同的病毒株變化并且在任何給定的核苷酸殘基處的變化是胞嘧啶或尿嘧啶時，這是有用的。通過在變異性位置處的靶向寡聚物中使用鳥嘌呤，可以利用公知的鳥嘌呤與尿嘧啶堿基配對的能力(被稱為c/u：g堿基配對)。通過在這些位置并入鳥嘌呤，單個寡聚物可以有效地靶向更廣的rna靶變異性。化合物(例如，寡聚物，亞基間鍵，端基)可以以不同異構體形式存在，例如結構異構體(例如，互變異構體)。對于立體異構體，化合物可以具有手性中心并且可能以外消旋體、富對映異構體的混合物、單獨的對映異構體、混合物或非對映異構體或單獨的非對映異構體而存在。所有這樣的異構體形式包括在本發(fā)明內，包括它們的混合物?；衔镞€可以具有導致阻轉異構體的軸手性。此外，化合物的一些晶體形式可能以多晶型物而存在，這也包括在本發(fā)明內。另外，一些化合物還可以與水或其他有機溶劑形成溶劑化物。同樣地，這類溶劑化物包括在本發(fā)明的范圍內。本文所述的寡聚物可以用于抑制蛋白的產(chǎn)生或病毒的復制的方法。因此，在一實施方案中，編碼這類蛋白的核酸暴露于本文所述的寡聚物。在前述的其他實施方案中，反義寡聚物包含本文所公開的5’或3’修飾的端基或其組合，并且堿基配對部分b形成在有效抑制蛋白產(chǎn)生的位置與一部分核酸有效雜化的序列。在一實施方案中，該位置為mrna的atg起始密碼子區(qū)域，前mrna的剪切位點或下文所述的病毒靶序列。在一實施方案中，寡聚物具有對于結合靶序列為高于約50℃的tm，并且被哺乳動物細胞或細菌細胞攝取。在另一實施方案中，寡聚物可以結合于本文所述的轉運部分，例如富精氨酸肽，以促進這樣的攝取。在另一實施方案中，本文所述的末端修飾可以起到轉運部分的作用以促進哺乳動物和/或細菌細胞的攝取。嗎啉代寡聚物的制備和性質在下文和美國專利第5,185,444號以及wo/2009/064471中更詳細地描述，將每一個以整體形式并入本文作為參考。d.寡聚物的制劑和給藥本公開還提供了公開的寡聚物的制劑和遞送。因此，在一實施方案中，本公開涉及包含本文所述的寡聚物和藥物可接受的媒介物的組合物。反義寡聚物向靶核酸的有效遞送是治療的重要方面。反義寡聚物遞送的途徑包括但不限于各種全身途徑，包括口服和胃腸外途徑，如靜脈內、皮下、腹膜內和肌肉內，以及吸入、經(jīng)皮和局部遞送。本領域中技術人員可確定適當?shù)耐緩?，視治療中個體的狀態(tài)而定。例如，皮膚的病毒感染治療中，適當?shù)挠糜诜戳x寡聚物遞送的途徑為局部遞送，而用于病毒性呼吸系統(tǒng)感染的治療的反義寡聚物的遞送為通過吸入遞送。寡聚物也可直接遞送至病毒感染的部位或血液循環(huán)。反義寡聚物可以以任意便捷的生理學可接受的和/或藥物可接受的媒介物而給藥。這類組合物可以包括本領域技術人員利用的任何各種標準藥物可接受的載體。實例包括但不限于，鹽水、磷酸鹽緩沖液(pbs)、水、乙醇水溶液、乳劑如油/水乳劑或甘油三酯乳劑、片劑和膠囊。合適的生理學可接受的載體的選擇因所選擇的給藥模式而不同。本發(fā)明的化合物(例如，寡聚物)通?？梢砸杂坞x酸或游離堿形式使用?；蛘?，本發(fā)明的化合物可以以酸加成鹽或堿加成鹽的形式使用。本發(fā)明的游離氨基化合物的酸加成鹽可以通過本領域公知方法而制備，并且可以由有機酸和無機酸形成。合適的有機酸包括馬來酸、富馬酸、苯甲酸、抗壞血酸、琥珀酸、甲磺酸、乙酸、三氟乙酸、草酸、丙酸、酒石酸、水楊酸、檸檬酸、葡糖酸、乳酸、扁桃酸、肉桂酸、天冬氨酸、硬脂酸、軟脂酸、乙醇酸、谷氨酸和苯磺酸。合適的無機酸包括鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸和硝酸。堿加成鹽包括與羧酸根陰離子形成的那些鹽，并且包括與有機陽離子和無機陽離子形成的鹽，例如選自堿金屬和堿土金屬(例如，鋰、鈉、鉀、鎂、鋇和鈣)的那些，以及銨離子及其取代的衍生物(例如，二芐基銨、芐基銨、2-羥基乙基銨等)。因此，術語結構(i)的“藥物可接受的鹽”旨在包括任意和所有可接受的鹽形式。此外，前藥也包括在本發(fā)明的內容中。前藥是任意共價連接的載體，當所述前藥給予患者時，其體內釋放結構(i)的化合物。前藥通常通過以當修飾由常規(guī)操作而裂解或體內裂解時產(chǎn)生母體化合物的方式修飾官能團來制備。前藥包括，例如，本發(fā)明的化合物，其中羥基、氨基或巰基與當給予患者時裂解而形成羥基、氨基或巰基的任何基團結合。因此，前藥的典型實例包括(但不限于)：結構(i)化合物的醇和胺官能團的乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物。此外，對于羧酸(-cooh)，可以利用酯，例如甲酯、乙酯等。在一些情況下，可應用脂質體以促進細胞對反義寡核苷酸的攝取(例如參見williams,s.a.,leukemia10(12):1980-1989,1996；lappalainenetal.,antiviralres.23:119,1994；uhlmannetal.,antisenseoligonucleotides:anewtherapeuticprinciple,chemicalreviews,volume90,no.4,pages544-584,1990；gregoriadis,g.,chapter14,liposomes,drugcarriersinbiologyandmedicine,pp.287-341,academicpress,1979)。水凝膠也可用作媒介物以用于反義寡聚物給藥，例如，如wo93/01286所述。可選擇地，寡核苷酸可以以微球或微粒形式給藥(例如參見wu,g.y.andwu,c.h.,j.biol.chem.262:4429-4432,1987)。可選擇地，與反義寡聚物復合的充氣微泡的使用可增強對靶組織的遞送，如美國專利申請第6,245,747號所述。還可以使用緩釋組合物。這些可包括有形制品形式的半滲透的聚合物基質，諸如膜劑或微囊劑。在一實施方案中，通過將感染有病毒的細胞與有效抑制該特定病毒的復制的反義制劑接觸，從而反義抑制有效地治療宿主動物的病毒感染。將反義制劑在合適的藥物載體中給予被給定的病毒感染的諸如人類或家畜的哺乳動物個體。值得關注的是反義寡核苷酸阻止rna病毒在宿主中生長。rna病毒可在數(shù)量上降低或以對宿主的正常生長或發(fā)育幾乎沒有或無損害效應的方式而去除。在方法的一方面，個體為人類個體，例如被診斷患有局部的或全身的病毒感染的患者。患者的狀態(tài)也可指示本發(fā)明的反義寡聚物的預防性給藥，例如在患者為(1)免疫功能低下的；(2)燒傷；(3)有留置導管；或(4)將接受或最近接受了手術的情況下。在一優(yōu)選實施方案中，寡聚物為二氨基磷酸酯嗎啉代寡聚物，包含在藥物可接受的載體中，并且口服遞送。在另一優(yōu)選的實施方案中，寡聚物為二氨基磷酸酯嗎啉代寡聚物，包含在藥物可接受的載體中，并且靜脈內遞送(i.v)。在方法的另一應用中，個體為家畜動物，例如雞、火雞、豬、牛或山羊等，并且治療為預防性的或治療性的。本發(fā)明還包括家畜和家禽食物組合物，其包含添加有亞治療量的上文所述類型的抗病毒反義化合物的食糧。在用添加有亞治療水平的抗病毒劑的食糧喂養(yǎng)家畜和家禽的方法中，還預期的改善為，其中所述食糧添加有亞治療量的上文所述的抗病毒寡核苷酸組合物。在一實施方案中，反義化合物可以以有效導致血液濃度峰值為至少200-400nm反義寡聚物的量和方式來給藥。通常，給予一種或多種劑量的反義寡聚物，通常以規(guī)律的間隔，持續(xù)約1-2周的時間段。用于口服給藥的優(yōu)選劑量為約1-1000mg寡聚物/70kg。在一些情況下，可需要大于1000mg寡聚物/患者的劑量。對i.v.給藥而言，優(yōu)選的劑量為約0.5mg-1000mg寡聚物/70kg。反義寡聚物可以以規(guī)律的間隔短時間給藥，例如通常兩周或更少的時間內每天給藥。然而，在一些情況下，寡聚物在較長的時間段內間隔地給藥?？稍诮o藥之后或與給藥同時進行抗生素給藥或其他治療處理。如所示，可以基于免疫測定、其他生物化學測試以及治療中個體的生理學檢查的結果調整治療方案(劑量、頻率、途徑等)。利用本發(fā)明反義寡核苷酸的有效體內治療方案可根據(jù)持續(xù)時間、劑量、頻率和給藥途徑，以及治療中個體的狀態(tài)而變化(即預防性給藥與響應局部的或全身的感染的給藥比較)。因此，此類體內療法將經(jīng)常要求通過適合于治療中特定類型病毒感染的試驗而監(jiān)測，以及相應調整劑量或治療方案，以便實現(xiàn)最佳的治療結果?？赏ㄟ^疾病和/或感染的一般指標，諸如全血細胞計數(shù)(cbc)、核酸檢測方法、免疫診斷試驗、病毒培養(yǎng)或異源雙鏈體的檢測來監(jiān)測治療?？蓮娜∽越o予反義寡聚物之前、期間以及之后的個體的生物學樣品(組織、血液、尿液等)檢測本發(fā)明抗病毒反義寡聚物體內給藥在抑制或消除一種或多種類型的rna病毒生長方面的功效。此類樣品的測定包括(1)利用本領域中技術人員已知的程序，例如電泳凝膠流動分析，監(jiān)測由靶序列和非靶序列所形成的異源雙鏈體的存在或不存在；(2)如通過諸如elisa或免疫印跡(westernblotting)的標準技術所測定的，監(jiān)測病毒蛋白產(chǎn)生的量，或(3)測量對病毒滴度的影響，例如通過spearman-karber的方法(參見，例如pari,g.s.etal.,antimicrob.agentsandchemotherapy.39(5):1157-1161,1995；anderson,k.p.etal.,antimicrob.agentsandchemotherapy.40:2004-2011,1996；cottral,g.e.(ed)in:manualofstandardmethodsforveterinarymicrobiology,pp.60-93,1978)。在一些實施方案中，寡聚物由哺乳動物細胞主動攝取。在其他實施方案中，寡聚物可以結合到本文所述的轉運部分(例如轉運肽)，以促進這種攝取。e.寡聚物的制備嗎啉代亞基、修飾的亞基間鍵和包含它們的寡聚物可以根據(jù)實施例和美國專利第5,185,444和7,943,762號所述的那樣而制備，將其整體并入本文作為參考。嗎啉代亞基可以根據(jù)以下通用反應方案i制備。反應方案1.嗎啉代亞基的制備參照反應方案1，其中b表示堿基配對部分，并且pg表示保護基團，嗎啉代亞基可以從所示的相應的核糖核苷(1)制備。嗎啉代亞基(2)可以任選地通過與諸如三苯甲基氯的適當保護基團前體反應來保護。如下文更詳述地，3’保護基團通常在固態(tài)寡聚物合成過程中移除。堿基配對部分可以合適地保護以用于固態(tài)寡聚物合成。對于腺嘌呤和胞嘧啶，合適的保護基團包括苯甲?；瑢τ邙B嘌呤，合適的保護基團包括苯乙?；?，并且對于次黃嘌呤(i)，合適的保護基團包括新戊酰氧基甲基。新戊酰氧基甲基可以引入到次黃嘌呤雜環(huán)堿基的n1位。盡管可以利用未保護的次黃嘌呤亞基，當堿基被保護時活化反應的產(chǎn)率十分出眾。其他合適的保護基團包括描述于共同未決的美國申請第12/271,040號公開的那些，將其整體并入本文作為參考。3與活化的磷化合物4的反應導致具有所需鍵部分的嗎啉代亞基(5)。結構4的化合物可以通過本領域技術人員已知的許多方法制備。例如，這類化合物可以通過將相應的胺與氧氯化磷反應來制備。在這種情況下，胺起始材料可以使用本領域內已知的任意方法制備，例如實施例和美國專利第7,943,762號所述的那些方法。盡管以上方案示出了(b)型鍵(例如，x為-nr8r9)的制備，(a)型鍵(例如，x為二甲基胺)可以以類似的方式制備。結構5的化合物可以在用于制備包含亞基間鍵的寡聚物的固態(tài)自動化寡聚物合成中使用。這類方法是領域內公知的。簡而言之，結構5的化合物可以在5’末端修飾以包含與固體支持物的連接基團。例如，化合物5可以通過包含l1和/或r19的連接基團而連接到固體支持物。示例性方法在圖3和4中示出。以這種方式，在寡聚物合成完成并且寡聚物從固體支持物裂解之后，低聚物(oligo)可以包含5’末端修飾。一旦被支持，5的保護基團(例如三苯甲基)被移除，并且游離氨基與結構5的第二化合物的活化的含磷部分反應。重復該順序直到獲得所需長度的低聚物。如果需要5’修飾，則終端5’末端的保護基團可以被移除或保留。可以使用許多方法，或使用堿的示例性處理來裂解與固體支持物的鍵，從而使低聚物從固體支持物移除。在一實施方案中，本公開提供了用于制備寡聚物的嗎啉代亞基，以及相關的方法。嗎啉代亞基具有以下結構(xxxi)，其中w、x和y為上文(b)鍵所定義的，b為堿基配對部分，z為與固體支持物的鍵或合適的殘余基團，并且pg為保護基團，例如c7-c30芳烴基。在一些實施方案中，pg為三苯甲基，例如甲氧基三苯甲基。在其他實施方案中，與固體支持物的鍵包括上文定義的l2和/或r19。l2為任選的連接基團，其包括選自以下的鍵：烴基、羥基、烴氧基、烴基氨基、酰胺、酯、二硫化物、羰基、氨基甲酸酯、二氨基磷酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、哌嗪和磷酸二酯。l2的長度沒有特殊限定。在一些實施方案中，l2長度小于60個原子，長度小于50個原子或長度小于40個原子。在一些其他實施方案中，z為鹵素，例如氯。在另一實施方案中，本公開提供了制備任意所公開寡聚物的方法。所述方法包括使用結構(xxxi)的化合物以制備寡聚物。修飾的嗎啉代亞基和嗎啉代寡聚物的制備在實施例中更詳細地描述。包含任意數(shù)量的修飾的鍵的嗎啉代寡聚物可以使用本文所述方法、本領域已知和/或在本文作為參考所述的方法而制備。實例中還描述了通過前述(參見，例如pct公開wo2008036127)制備的pmo+嗎啉代寡聚物的整體修飾。f.寡聚物的反義活性本公開還提供了抑制蛋白的產(chǎn)生的方法，所述方法包括將編碼所述蛋白的核酸暴露于本文公開的寡聚物。因此，如本文所公開的，在一實施方案中，編碼這類蛋白的核酸暴露于包含至少一個(b)型鍵的反義寡聚物，或在其他實施方案中，包含10％-50％的這類修飾的鍵，其中堿基配對部分pi形成在有效抑制蛋白產(chǎn)生的位置與一部分核酸有效雜化的序列。寡聚物可以靶向例如mrna的atg起始密碼子區(qū)域，前mrna的剪切位點或下文所述的病毒靶序列。在另一實施方案中，所述方法包括將編碼這類蛋白的核酸暴露于包含至少一個末端修飾(例如，至少一個r20部分)的反義寡聚物。在另一實施方案中，本公開提供了增強具有通過亞基間鍵連接的嗎啉代亞基序列的寡聚物的反義活性的方法，所述亞基間鍵支持堿基配對部分，所述方法包括修飾本文所述寡聚物以包含至少一個修飾的端基、至少一個(b)型亞基間鍵或其組合。在一些實施方案中，反義活性的增強可以通過以下證明：(i)當反義寡聚物與其靶序列的結合有效地阻斷編碼的蛋白的翻譯起始密碼子時，編碼的蛋白的表達相對于由相應的未修飾的寡聚物提供的表達降低，或(ii)當反義寡聚物與其靶序列的結合有效地阻斷當正確剪切時編碼所述蛋白的前mrna中異常剪切位點時，編碼的蛋白的表達相對于由相應的未修飾的寡聚物提供的表達增加。適用于測量這些效果的測定在下文描述。在一實施方案中，修飾在本文所述的無細胞翻譯測定、細胞培養(yǎng)中的剪切修正翻譯測定或功能動物模型系統(tǒng)的剪切修正增益中提供這種活性。在一實施方案中，活性增加系數(shù)為至少2、至少5或至少10。下文描述的是本發(fā)明的寡聚物的多種示例性應用，包括抗病毒應用，治療神經(jīng)肌肉疾病、細菌感染、炎癥和多囊性腎病。這種描述不意圖以任何方式限制本發(fā)明，而是用于例證通過使用本文所述的包含修飾的亞基間鍵的寡聚物可以處理的人類和動物疾病的范圍。g.無細胞測定中的體外活性通過體外和體內的增強的反義活性所證明的，具有部分修飾的鍵的寡聚物，例如pmoapn(b10)和pmosuc(b45)，對于dna和rna比相應的中性化合物具有更高的親和性。表明本發(fā)明的寡聚物當針對多種不同的靶時，相對于完全未修飾的寡聚物提供出眾的反義活性。如材料和方法以及實施例27中所述，在第一系列的實驗中，制備了靶向mdx小鼠肌營養(yǎng)不良蛋白基因的外顯子23的多種未修飾的、修飾的和連接肽的ppmo。順序如實施例27所示，對于seqidno：2-5，用“+”指示每個位置處的前述的(1-哌嗪基)氧亞膦基氧基鍵(如圖1b所示)；對于seqidno：5，用“a”指示4-氨基哌啶基鍵(結構(b10)；圖2)；或用“s”指示4-琥珀酰胺哌嗪基鍵(結構(b45)；圖2)。如實施例27所述，包含本發(fā)明的示例性鍵的pmo寡聚物(例如，pmoapn)相對于前述的pmo+化合物更有效。1.靶向ssrna病毒的莖環(huán)二級結構一類示例性的反義抗病毒化合物為本文所述的嗎啉代寡聚物，例如包含至少一個(b)型鍵和/或至少一個末端修飾(例如，至少一個r20)或其組合的寡聚物，其具有12-40個亞基序列以及與莖環(huán)二級結構相關區(qū)域互補的靶向序列，所述莖環(huán)二級結構相關區(qū)域位于所靶向的病毒的正義rna鏈的5’末端40個堿基內。(參見，例如，pct公開第wo/2006/033933號或美國申請公開第20060269911和2005009291號，將其并入本文作為參考。)該方法包括首先鑒定病毒靶序列，即，感染病毒的正鏈的5’末端40個堿基內的區(qū)域，其序列可以形成內部莖環(huán)二級結構。然后通過逐步固相合成構建包含至少一個(b)型鍵和/或至少一個末端修飾(例如，至少一個r20)或其組合的寡聚物，并且在其他實施方案中包含20％至50％的這類修飾的鍵，并且具有與可以形成內部雙鏈體結構的病毒基因組區(qū)域互補的至少12個亞基的靶向序列，其中所述寡聚物可以與病毒靶序列形成由病毒的正義鏈和寡核苷酸化合物構成的異源雙鏈體結構，并且其特征在于解離tm為至少45℃，以及這類莖環(huán)結構的破壞。可以基于對輸入rna序列的最小游離能量狀態(tài)的搜索，使用能進行二級結構預測的計算機程序，通過分析5’末端序列、例如5’末端40個堿基來鑒定靶序列。在相關方面，寡聚物可以在抑制哺乳動物宿主細胞中感染rna病毒的復制的方法中使用，所述rna病毒具有單鏈的正義基因組并選自黃病毒科(flaviviridae)、小核糖核酸病毒科(picornoviridae)、杯狀病毒科(caliciviridae)、披膜病毒科(togaviridae)、動脈炎病毒科(arteriviridae)、冠狀病毒科(coronaviridae)、星狀病毒科(astroviridae)或肝炎病毒科(hepeviridae)之一。該方法包括向受感染的宿主細胞給予病毒抑制量的本文所述的寡聚物，所述寡聚物具有至少12個亞基的靶向序列，所述靶向序列與可以形成內部莖環(huán)二級結構的正鏈病毒基因組的5’末端40個堿基內的區(qū)域互補。當給予宿主細胞時，化合物有效地形成異源雙鏈體結構，其(i)由病毒的正義鏈和寡核苷酸化合物組成，以及(ii)特征在于解離tm為至少45℃和這類莖環(huán)二級結構的破壞。化合物可給予病毒感染的或處于病毒感染風險中的哺乳動物個體。靶向登革熱和日本腦炎病毒的末端莖環(huán)結構的示例性靶向序列在下文分別列舉為seqidno：1和2。靶向ssrna病毒的末端莖環(huán)結構的其他示例性靶向序列也可以見于美國申請第11/801,885號和pct公開第wo/2008/036127號，將其并入本文作為參考。2.靶向ssrna病毒的第一開放閱讀框第二類示例性反義抗病毒化合物用于抑制具有少于12kb的單鏈、正義基因組和第一開放閱讀框(其編碼包含多個功能性蛋白的多蛋白)的小核糖核酸病毒科、杯狀病毒科、披膜病毒科、冠狀病毒科和黃病毒科的病毒的生長。在具體實施方案中，病毒為來自冠狀病毒科的rna病毒或來自黃病毒科的西尼羅病毒、黃熱病病毒或登革熱病毒。抑制化合物包括本文所述的反義寡聚物，例如包含至少一個(b)型鍵和/或至少一個末端修飾(例如，至少一個r20)或其組合的寡聚物，其具有與病毒靶序列基本上互補的靶向堿基序列，所述病毒靶序列跨越病毒基因組的第一開放閱讀框的aug起始位點。在方法的一實施方案中，將寡聚物給予感染所述病毒的哺乳動物個體。參見，例如pct公開第wo/2005/007805號和美國申請公開第2003224353號，將其并入本文作為參考。優(yōu)選的靶序列是跨越病毒基因組的第一開放閱讀框(orf1)的aug起始位點的區(qū)域。第一orf通常編碼包含非結構蛋白如聚合酶、解旋酶和蛋白酶的多蛋白。“跨越aug起始位點”意指靶序列包括aug起始位點一側的至少3個堿基和另一側的至少2個堿基(總共至少8個堿基)。優(yōu)選地，其包含起始位點每側上的至少4個堿基(總共至少11個堿基)。更通常地，優(yōu)選的靶位點包括在多個病毒分離物之間保存的靶。其他有利的位點包括ires(內部核糖體進入位點)、反式激活蛋白結合位點和復制起始位點。通過靶向編碼病毒進入和宿主對病毒存在的應答的宿主細胞基因，可以有效地靶向可提供多份冗余基因的復雜且大的病毒基因組。多個病毒基因組序列可從公知來源獲得，例如ncbigenbank數(shù)據(jù)庫。orf1的aug起始位點還可以在可信的基因數(shù)據(jù)庫或參考文獻中鑒定，或其可以通過在序列中掃描預期orf1起始位點區(qū)域的aug密碼子來發(fā)現(xiàn)。4個病毒科中每一個的一般基因組結構在下文給出，然后是對各個科內的所選成員(屬、種或株)獲得示例性靶序列。3.靶向流感病毒第三類示例性反義抗病毒化合物用于抑制正粘病毒科的病毒的生長，并用于治療病毒感染。在一實施方案中，宿主細胞與本文所述的寡聚物接觸，例如包含至少一個(b)型鍵和/或至少一個末端修飾(例如，至少一個r20)或其組合的寡聚物，或者在其他實施方案中包含20％至50％的這類修飾的鍵，并且包含與選自以下的靶區(qū)域有效雜化的堿基序列：1)負義病毒rna片段的5’或3’末端25個堿基；2)正義crna的5’或3’末端的25個端堿基；3)流感病毒mrna的aug起始密碼子周邊的45個堿基，以及4)經(jīng)過可變剪接的流感mrna的剪接供體或受體位點周邊的50個堿基。(參見，例如pct公開第wo/2006/047683號；美國申請公開第20070004661號；和pct申請第2010/056613號以及美國申請第12/945,081號，將其并入本文作為參考。)使用基于下文表4中列出和實施例29中描述的seqidno：3的寡聚物，進行支持本發(fā)明的實驗，并該實驗設計為利用具有本發(fā)明的修飾的鍵的pmo靶向甲型流感病毒(h1n1株pr8)的m1/m2片段的實驗。表4.包括修飾的亞基間鍵或端基的流感靶向序列**3’-二苯甲基；*+鍵為pmoplus鍵的?；娜谆拾彼?；pmom表示在3-氮位上具有甲基的t堿基。該化合物在治療哺乳動物的流感病毒感染中特別有用。寡聚物可給予流感病毒感染的或處于流感病毒感染風險中的哺乳動物個體。4.靶向小核糖核酸病毒科的病毒第四類示例性反義抗病毒化合物用于抑制小核糖核酸病毒科的病毒的生長，并用于治療病毒感染。該化合物在治療哺乳動物的腸病毒和/或鼻病毒感染中特別有用。在該實施方案中，反義抗病毒化合物包括嗎啉代寡聚物，例如包含至少一個(b)型鍵和/或至少一個末端修飾(例如，至少一個r20)或其組合的嗎啉代寡聚物，并且具有12-40個亞基的序列，包括具有與病毒rna序列相關區(qū)域互補的靶向序列的至少12個亞基，所述病毒rna序列位于病毒5’非翻譯區(qū)的兩個32個保守核苷酸區(qū)域之一中。(參見，例如pct公開第wo/2007/030576和wo/2007/030691號；或共同未決且共有的美國申請第11/518,058和11/517,757號，將其并入本文作為參考。)示例性靶序列在下文列為seqno：6。5.靶向黃病毒科的病毒第五類示例性反義抗病毒化合物用于在動物細胞中抑制黃病毒的復制。該類的示例性反義寡聚物為包含至少一個(b)型鍵和/或至少一個末端修飾(例如，至少一個r20)或其組合的嗎啉代寡聚物，長度為8-40個核苷酸堿基，并具有與病毒正鏈rna基因組區(qū)域互補的至少8個堿基的序列，所述區(qū)域包括至少一部分的正鏈黃病毒rna的5’環(huán)化序列(5’-cs)或3’-cs序列。非常優(yōu)選的靶為3’-cs，并且登革熱病毒的示例性靶向序列在下文列為seqidno：7。(參見，例如pct公開第wo/2005/030800號或共同未決且共有的美國申請第10/913,996號，將其并入本文作為參考。)6.靶向巢病毒科的病毒第六類示例性的反義抗病毒化合物用于在病毒感染的動物細胞中抑制巢病毒(nidovirus)的復制。該類的示例性反義寡聚物為本公開描述的包含至少一個(b)型鍵和/或至少一個末端修飾(例如，至少一個r20)或其組合的嗎啉代寡聚物，并且其包含8-25個核苷酸堿基，并具有破壞正鏈病毒基因組的5’前導區(qū)中的轉錄調節(jié)序列(trs)與負鏈3’次基因組區(qū)之間的堿基配對的序列(參見例如pct公開第wo/2005/065268號或美國申請公開第20070037763號，將其并入本文作為參考)。7.絲狀病毒的靶向在另一實施方案中，本文所述的一種或多種寡聚物可以在抑制宿主細胞中埃博拉病毒或馬爾堡病毒的復制的方法中使用，通過將該細胞與本文所述的寡聚物接觸，例如包含至少一個(b)型鍵和/或至少一個末端修飾(例如，至少一個r20)或其組合的嗎啉代寡聚物，或在其他實施方案中包含20％-50％的這類修飾的鍵，如下文進一步詳述，其具有與靶序列互補的靶向堿基序列，所述靶序列由正鏈mrna的aug起始位點區(qū)域內的至少12個連續(xù)的堿基組成。絲狀病毒基因組為不分節(jié)的反義方向的約19,000個堿基的單鏈rna?；蚪M編碼來自與vrna互補的單順反子mrna的7種蛋白。靶序列為跨越選擇的埃博拉病毒蛋白的aug起始密碼子或僅位于其下游(25個堿基內)或上游(100個堿基內)的正鏈(有義)rna序列，或負鏈病毒rna的3’末端30個堿基。優(yōu)選的蛋白靶為病毒聚合酶亞基vp35和vp24，盡管還涉及l(fā)、核蛋白np和vp30。其中，早期蛋白是有利的，例如vp35比更晚表達的l聚合酶更有利。在另一實施方案中，本文所述的一種或多種寡聚物可以在抑制宿主細胞中埃博拉病毒或馬爾堡病毒復制的方法中使用，通過將該細胞與本文所述的包含至少一個修飾的亞基間鍵的寡聚物接觸，或在其他實施方案中包含20％至50％的這類修飾的鍵，并且其具有與靶序列互補的靶向堿基序列，所述靶序列由絲狀病毒mrna序列的正鏈mrna的aug起始位點區(qū)域內的至少12個連續(xù)堿基組成。(參見，例如pct公開第wo/2006/050414號或美國專利第7,524,829和7,507,196號，以及美國申請第12/402,455；12/402,461；12/402,464和12/853,180號繼續(xù)申請，將其并入本文作為參考。)8.沙粒病毒的靶向在另一實施方案中，本文所述的寡聚物可以在抑制哺乳動物細胞中沙粒病毒科物種的病毒感染的方法中使用。在一方面，寡聚物可以用于治療受所述病毒感染的哺乳動物個體。(參見，例如pct公開第wo/2007/103529號或美國申請第7,582,615號，將其并入本文作為參考。)表5是根據(jù)舊大陸或新大陸沙粒病毒分類所組織的被本發(fā)明寡聚物靶向的示例性靶病毒列表。表5.靶向的沙粒病毒科屬病毒沙粒病毒科沙粒病毒屬舊大陸沙粒病毒沙拉病毒(lasv)淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒(lcmv)mopeia病毒(mopv)新大陸沙粒病毒瓜納瑞托病毒(gtov)胡寧病毒(junv)馬丘波病毒(macv）皮欽德病毒(picv)皮里陶病毒(pirv)薩比亞病毒(sabv)塔卡布病毒(tcrv)白水阿羅約病毒(wwav)沙粒病毒的基因組由命名為s(小)和l(大)的兩條單鏈rna片段組成。在病毒體中，s片段rna與l片段rna的摩爾比約為2∶1。多種沙粒病毒的完整s片段rna序列已經(jīng)被確認，范圍為3,366-3,535個核苷酸。多種沙粒病毒的完整l片段rna序列也已經(jīng)被確認，范圍為7,102-7,279個核苷酸。s和lrna片段的3’末端序列在最后19個核苷酸中17個相同。這些末端序列在所有已知的沙粒病毒中保守。每個基因組rna起始處的5’末端19或20個核苷酸與每個相應的3’末端不完美的互補。由于這種互補性，3’和5’末端被認為是堿基配對的并形成鍋柄樣結構。在感染的細胞中發(fā)生感染病毒體或病毒rna(vrna)的復制，以形成反基因鏈的病毒互補的rna(vcrna)鏈。vrna和vcrna均編碼互補mrna；因此，沙粒病毒被分類為雙義rna病毒而不是反義或正義rna病毒。病毒基因的雙義方向在l片段和s片段上。np和聚合酶基因分別位于s和lvrna片段的3’端處，并且以常規(guī)的反義方式被編碼(即，它們通過轉錄vrna或基因組互補mrna來表達)。gpc和z分別位于s和lvrna片段的5’末端處，以mrna有義方式被編碼，但沒有證據(jù)表明它們是從基因組vrna直接翻譯的。這些基因被表達而不是通過來自反基因組(即，vcrna)的基因組有義mrna的轉錄，基因組vrna的全長互補拷貝用作復制中間體。沙粒病毒科的病毒的示例性靶向序列在下文列為seqidno：8。9.呼吸道合胞病毒的靶向呼吸道合胞病毒(rvs)是幼兒最重要的呼吸道病原體。rsv引發(fā)的下游呼吸道疾病狀況，例如毛細支氣管炎和肺炎，經(jīng)常需要對小于1歲齡的兒童進行住院治療?；加行姆渭膊〉膬和湍切┰绠a(chǎn)兒特別易于患有源自于這種感染的嚴重病癥。rsv感染也是老年成人和高危成人的重要疾病，并且其是老年人中病毒性肺炎的第二常見的明確病因(falsey,hennesseyetal.2005)。世界衛(wèi)生組織估計rsv在世界范圍內每年導致六千四百萬例臨床感染和十六萬例死亡。目前沒有可用的預防rsv感染的疫苗。盡管在過去的數(shù)十年內，我們對rsv生物學、傳染病學、病理生理學和宿主免疫應答方面的理解有了許多重要進步，但關于患有rsv感染的嬰兒和兒童的最佳管理仍然存在相當大的爭議。三唑核苷是唯一被批準的用于治療rsv感染的抗病毒藥物，但其的使用受限于高?；驀乐鼗疾〉膵雰骸Ｈ蚝塑盏膶嵱眯允芟抻谄涑杀?、多變的功效和產(chǎn)生抗性病毒的趨勢(marquardt1995；prince2001)。公知目前需要其他有效的抗rsv制劑。已知肽結合的pmo(ppmo)可以在組織培養(yǎng)中和體內動物模型系統(tǒng)中有效地抑制rsv(lai,steinetal.2008)。在兩種人呼吸道細胞系的培養(yǎng)物中測試了兩種反義ppmo的抗rsv活性，所述ppmo被設計為靶向包含rsvlmrna的5’末端區(qū)域和反義起始位點區(qū)域的序列。它們中的一個(rsv-aug-2；seqidno10)使病毒滴度降低了大于2.0log10。用rsv-aug-2ppmo在rsv接種之前鼻內(i.n.)處理ralb/c小鼠，在感染后(p.i.)第5天產(chǎn)生肺組織中病毒滴度的1.2log10的降低，并在感染后第7天減弱肺炎。這些數(shù)據(jù)表明rsv-aug-2提供潛在的抗rsv活性，值得作為潛在的治療應用的候選者而進一步研究(lai,steinetal.2008)。盡管上文所述的rsv-aug-2ppmo的成功，但出于毒性關注和商品成本考慮，還需要避免在反義抗rsv治療劑中并入肽結合物。因此，在本發(fā)明的另一實施方案中，本文所述的一種或多種寡聚物可以在抑制宿主細胞中rsv復制的方法中使用，通過將該細胞與本文所述的寡聚物接觸，例如包含至少一個(b)型鍵和/或至少一個末端修飾(例如，至少一個r20)或其組合的嗎啉代寡聚物，或在其他實施方案中10％-50％的這類修飾的鍵，如下文進一步描述的，其具有與靶序列互補的靶向堿基序列，所述靶序列由來自rsv的mrna的aug起始位點區(qū)域內的至少12個連續(xù)堿基組成。rsv的l基因編碼病毒rna依賴性rna聚合酶復合物的關鍵組分。設計為針對跨越rsvl基因mrna的aug反義起始位點密碼子的序列的反義ppmo，以rsv-aug-2ppmo的形式與來自“基因起始”序列(gs)的序列互補，所述“基因起始“序列存在于lmrna的5’末端至編碼序列中的13個nt。因此，優(yōu)選的l基因靶向序列與來自下列的任意12個連續(xù)堿基互補，即來自l基因mrna的5’端沿3’方向延伸的40個堿基，或來自向l基因編碼序列延伸的22個堿基(在下文表3中示為seqidno：9)。示例性rsvl基因靶向序列在下文表3中列為seqidno：10-14。任何本文所述的亞基間修飾可以并入寡聚物以提供增加的反義活性、改善的細胞內遞送和/或組織特異性，以用于改善治療活性。包含本發(fā)明的亞基間鍵的示例性寡聚物在下文表6中列出。表6.rsv靶和靶向序列10.神經(jīng)肌肉疾病在另一實施方案中，提供治療寡聚物以用于治療與哺乳動物個體的神經(jīng)肌肉疾病相關的疾病狀態(tài)。已證明增強向肌肉組織的轉運的示例性亞基間寡聚物修飾包括具有結構b6、b10、b51和b54的亞基間鍵的那些。在m23d反義寡聚物(seqidno：16)中包括這類鍵的反義寡聚物如實施例中所述的那樣，在杜興氏肌營養(yǎng)不良(dmd)的mdx小鼠模型中測試活性。在一些實施方案中使用的包括所述鍵的示例性寡聚物在表7中列出。在一些實施方案中，治療化合物可以選自：(a)如之前所述，靶向人肌生成抑制蛋白的用于治療肌肉消耗疾病狀況的反義寡聚物，其具有與鑒定為seqidno：18的人肌生成抑制蛋白mrna的靶區(qū)域中的至少12個連續(xù)堿基互補的堿基序列(參見，例如美國專利申請第12/493,140號，將其并入本文作為參考；和pct公開第wo2006/086667號)。示例性鼠科靶向序列被列為seqidno：19-20。(b)如之前所述，可以在dmd蛋白(肌營養(yǎng)不良蛋白)中產(chǎn)生外顯子跳躍以恢復肌營養(yǎng)不良蛋白的部分活性而用于治療dmd的反義寡聚物，例如具有選自seqidno：22-35的序列的pmo(參見，例如pct公開第wo/2010/048586和wo/2006/000057號或美國專利公開第us09/061960號，將所有這些并入本文作為參考)。多種其他神經(jīng)肌肉疾病可以通過使用本發(fā)明的修飾的鍵和端基而治療。治療脊髓性肌肉萎縮癥(sma)和強直性肌營養(yǎng)不良(dm)的示例性化合物在下文討論。sma是常染色體隱形疾病，由脊索中的α運動神經(jīng)元的慢性損失引起，并可以影響兒童和成人。降低的存活運動神經(jīng)元(smd)的表達是該疾病的原因(hua,sahashietal.2010)。引起sma的突變位于smn1基因，而非同源基因smn2如果從缺乏外顯子7的可變剪接形式(δ7smn2)表達，可以允許通過補償smn1的損失而存活。靶向內含子6、外顯子7和內含子7的反義化合物已經(jīng)被證明不同程度地誘導外顯子7內含。靶向內含子7的反義化合物是優(yōu)選的(參見，例如pct公開第wo/2010/148249、wo/2010/120820、wo/2007/002390號和美國專利第7838657號)。靶向smn2前mrna并誘導增強的外顯子7內含的示例性反義序列在下文列舉為seqidno：36-38。預期使用本文所述的修飾的鍵和端基的這些寡聚物序列的所選修飾相對于本領域內已知的那些具有改善的性質。此外，預期靶向smn2基因的內含子7并包含本發(fā)明特征的任何寡聚物具有誘導外顯子7內含的性質并向sma患者提供治療益處。1型(dm1)和2型(dm2)強直性肌營養(yǎng)不良是由導致神經(jīng)肌肉退化的毒性rna的表達引起的顯性遺傳性疾病。dm1和dm2分別與轉錄本強直性肌營養(yǎng)不良蛋白激酶(dmpk)和鋅指蛋白9(znf9)的3’-utr和內含子1區(qū)域中的長聚cug和聚ccug重復有關(參見，例如wo2008/036406)。盡管正常個體具有多達30個ctg重復，但dm1患者攜帶大量重復，范圍為50至數(shù)千個。疾病的嚴重程度和發(fā)作的年齡與重復的數(shù)目相關。成年發(fā)作的患者顯示更溫和的癥狀并具有少于100個重復，青少年發(fā)作的dm1患者攜帶多達500個重復，而先天性案例通常具有約上千個ctg重復。包含cug重復的擴大的轉錄本形成二級結構，以細胞核聚集點的形式在核中積累，并螯合rna結合蛋白(rna-bp)。多種rna-bp已經(jīng)與該疾病有牽連，包括盲肌樣(mbnl)蛋白和cug結合蛋白(cugbp)。mbnl蛋白與果蠅盲肌(mbl)蛋白是同源的，是光感受器和肌肉分化所必須的。mbnl和cugbp已被鑒定為dm1中受影響的轉錄本的拮抗剪接調節(jié)劑，例如心肌肌鈣蛋白t(ctnt)、胰島素受體(ir)和肌肉特異性氯通道(cic-1)。本領域內已知，靶向dmpk基因的擴大的重復的反義寡核苷酸可以移除rna-bp螯合，并逆轉dm1動物模型中的強直性癥狀(wo2008/036406)。預期包括本發(fā)明特征的寡聚物會向dm1和dm2患者提供改善的活性和治療潛能。上述靶向聚cug和聚ccug重復的示例性序列在下文列舉為seqidno：39-55，并進一步描述于美國申請第13/101,942號，將其并入本文作為參考。預期本發(fā)明的其他實施方案用于治療神經(jīng)肌肉疾病，并包括設計為治療其他dna重復不穩(wěn)定性遺傳疾病的寡聚物。這些疾病包括wo2008/018795所描述的亨廷頓病、脊髓小腦性共濟失調、x連鎖脊髓和延髓肌肉萎縮和10型脊髓小腦共濟失調(sca10)。實施例27描述了使用mdx小鼠(dmd的鼠科模型)的為支持本發(fā)明而進行的實驗。表7.包括修飾的亞基間鍵和/或3’和/或5’端團的m23d序列(seqidno：15)*二聚化是指寡聚物通過連接兩個單體的3’端的鍵而二聚化。例如，鍵可以為-coch2ch2-s-ch(conh2)ch2-co-nhch2ch2co-或任何其他合適的鍵。11.抗菌應用在另一實施方案，本發(fā)明包括用于治療哺乳動物宿主的細菌感染的抗菌反義寡聚物。在一些實施方案中，寡聚物包含至少一個(b)型鍵和/或至少一個末端修飾(例如，至少一個r20)或其組合，具有10-20個堿基和至少10個連續(xù)堿基的靶向序列，所述連續(xù)堿基與用于以下的感染細菌mrna的靶區(qū)域互補：?；d體蛋白(acpp)、回旋酶a亞基(gyra)、ftsz、核糖體蛋白s10(rpsj)、leud、mgtc、pirg、pcaa和cmal基因，其中所述靶區(qū)域包含細菌mrna的翻譯起始密碼子，或翻譯起始密碼子上游(即，5’)或下游(即，3’)方向20個堿基內的序列，并且其中所述寡聚物與所述mrna結合以形成異源雙鏈體從而抑制細菌的復制。還包括寡聚物的結合物，其中結合到寡聚物的是在肽的羧基末端連接于寡核苷酸的富精氨酸載體蛋白，并且優(yōu)選地由肽序列(rxx)n-或(rxr)n表示，其中x為不帶電的氨基酸，其選自：丙氨酸、β-丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和6-氨基己酸，并且n＝2至4。在示例性實施方案中，載體肽具有序列(rff)n、(rff)nr或(rxr)n，其中n＝2至4。載體肽可以通過一個或兩個氨基酸連接基團在其c末端連接到寡聚物的一端，例如3’或5’端，例如連接基團ahxβala，其中ahx為6-氨基己酸并且βala為β-丙氨酸。當與寡核苷酸3’或5’端結合時，載體肽具有以至少為10的系數(shù)，優(yōu)選為102或103的系數(shù)增強寡核苷酸的抗菌活性的能力，如通過在8小時內體外細菌生長的抑制所測量的。在優(yōu)選的實施方案中，載體肽具有序列(rahxr)n-，其中n＝4。12.調節(jié)核激素受體在另一實施方案中，本發(fā)明涉及用于調節(jié)來自核激素受體超家族(nhrsf)的核激素受體(nhr)的表達的組合物和方法，主要通過控制或改變編碼受體的前mrna的剪接。具體nhr的實例包括糖皮質素受體(gr)、黃體酮受體(pr)和雄性激素受體(ar)。在某些實施方案中，本文所述的反義寡核苷酸和制劑導致受體的堿基非依賴形式或其他所選形式的表達增加，并且它們的非活化形式的表達降低。本發(fā)明的實施方案包括寡聚物和寡核苷酸類似物，例如包含至少一個(b)型鍵和/或至少一個末端修飾(例如，至少一個r20)或其組合的寡聚物，其與nhr的所選外顯子或內含子序列互補，包括“配體結合外顯子”和/或nhrsf前mrna的鄰近內含子，以及本文所述的其他nhr結構域。術語“配體結合外顯子”指存在于野生型mrna中，但從初級轉錄本(“前mrna”)中移除以產(chǎn)生配體非依賴形式mrna的外顯子。在某些實施方案中，互補性可以基于跨越剪接位點的前mrna的序列中的序列，其包括但不限于，基于跨越外顯子-內含子接合點的序列的互補性。在其他實施方案中，互補性可以單獨基于內含子序列。在其他實施方案中，互補性可以單獨基于內外顯子序列。(參見，例如，美國申請第13/046,356號，將其并入本文作為參考。)nhr調節(jié)劑可以用于治療nhr相關疾病，包括與基因的表達產(chǎn)物相關的疾病，所述基因的轉錄受nhr刺激或抑制。例如，抑制ap-1和/或nf-κb的nhr調節(jié)劑可以用于治療炎性和免疫性疾病和病癥，例如骨關節(jié)炎、類風濕關節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、哮喘、炎癥性腸疾病、移植排斥和移植物抗宿主病，以及本文所描述的和本領域已知的其他疾病。拮抗反式激活的化合物可以用于治療與糖皮質激素的水平增加有關的代謝性疾病，例如糖尿病、骨質疏松癥和青光眼等。此外，激動反式激活的化合物可以用于治療與糖皮質激素缺乏有關的代謝性疾病，例如阿狄森病等。本發(fā)明的實施方案包括調節(jié)細胞的細胞核nhr活性或表達的方法，包括將所述細胞與由嗎啉代亞基組成的反義寡聚物接觸從而調節(jié)nhr的活性或表達，所述嗎啉代亞基通過使一個亞基的嗎啉氮連接于鄰近亞基的5’環(huán)外碳的含磷的亞基間鍵而連接，其中所述寡核苷酸包含10-40個堿基和與靶序列互補的至少10個連續(xù)堿基的靶向序列，其中所述靶序列為nhr的前mrna轉錄本。在某些實施方案中，寡聚物改變前mrna轉錄本的剪接并增加nhr變體的表達。在一些實施方案中，寡聚物誘導前mrna轉錄本的一個或多個外顯子的全部或部分外顯子跳躍。在某些實施方案中，一個或多個外顯子編碼至少一部分的nhr的配體結合域，并且變體是nhr的配體非依賴形式。在某些實施方案中，一個或多個外顯子編碼至少一部分的nhr的反式激活域，并且變體具有降低的轉錄激活活性。在某些實施方案中，一個或多個外顯子編碼至少一部分的nhr的dna結合域。在某些實施方案中，一個或多個外顯子編碼至少一部分的nhr的n末端激活域。在某些實施方案中，一個或多個外顯子編碼至少一部分的nhr的羧基末端域。在具體實施方案中，變體結合nf-kb、ap-1或以上二者，并降低一個或多個其促炎性靶基因的轉錄。在某些實施方案中，寡聚物激動nhr的反式激活轉錄活性。在其他實施方案中，寡聚物拮抗nhr的反式激活轉錄活性。在某些實施方案中，寡聚物激動nhr的轉錄抑制活性。在其他實施方案中，寡聚物拮抗nhr的轉錄抑制活性。在具體實施方案中，寡聚物拮抗nhr的反式激活轉錄活性并且激動nhr的轉錄抑制活性。(參見，例如美國申請第61/313,652號，將其并入本文作為參考。)實施例除非另有所指，從sigma-aldrich-fluka獲得所有化學品。從carbosynthlimited,uk獲得苯甲酰腺苷、苯甲酰胞苷和苯乙酰鳥苷。利用本領域已知的方法以及未決的美國申請第12/271,036和12/271,040號和pct公開第wo/2009/064471號所述的方法，進行本文所述的pmo、pmo+、ppmo和包含其他鍵修飾的pmo的合成。基本上如pct公開第wo/2009/064471號所述的那樣來合成具有3’三苯甲基修飾的pmo，除了省略脫三苯甲基步驟。實施例14-(2,2,2-三氟乙酰胺基)哌啶-1-羧酸叔丁酯向4-氨基哌啶-l-羧酸叔丁酯(48.7g,0.243mol)和dipea(130ml,0.749mol)的dcm(250ml)懸浮液中逐滴加入三氟乙酸乙酯(35.6ml,0.300mol)，同時攪拌。20小時之后，用檸檬酸溶液(200ml×3,10％w/vaq)和碳酸氫鈉溶液(200ml×3,concaq)洗滌溶液，干燥(mgso4)，并經(jīng)過二氧化硅(24g)過濾。用dcm洗滌二氧化硅，將合并的洗脫液部分地濃縮(100ml)并在下一步驟中直接使用。apci/ms，計算c12h19f3n2o3：296.1,實測：m/z＝294.9(m-l)。實施例22,2,2-三氟-n-(哌啶-4-基)乙酰胺鹽酸鹽向攪拌的實施例1標題化合物的dmc溶液(100ml)滴加氯化氫(250ml,1.0mol)的1,4-二氧六環(huán)(4m)溶液。持續(xù)攪拌6小時，然后過濾懸浮液，用二乙醚(500ml)洗滌固體，從而以白色固體形式提供標題化合物(54.2g,96％的產(chǎn)率)。apci/ms計算c7h11f3n2o：196.1,實測：m/z＝196.9(m+l)。實施例3(4-(2,2,2-三氟乙酰胺基)哌啶-1-基)磷酰二氯向實施例2標題化合物(54.2g,0.233mol)的dcm(250ml)的冷(冰/水浴)懸浮液滴加三氯氧化磷(23.9ml,0.256mol)和dipea(121.7ml,0.699mol)，并攪拌。15分鐘之后，去除浴，并繼續(xù)攪拌混合物以便回暖至室溫。1小時之后，部分濃縮混合物(100ml)，過濾懸浮液，并用二乙醚洗滌固體，從而以白色固體形式提供標題化合物(43.8g,60％的產(chǎn)率)。部分濃縮洗提液(100ml)，過濾所得懸浮液，并用二乙醚洗滌固體，從而提供額外的標題化合物(6.5g,9％的產(chǎn)率)。esi/ms計算l-(4-硝基苯基)哌嗪衍生物c17h22clf3n5o4p：483.1,實測：m/z＝482.1(m-1)。實施例4((2s,6s)-6-((r)-5-甲基-2,6-二氧-1,2,3,6-四氫吡啶-3-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基)甲基(4-(2,2,2-三氟乙酰胺基)哌啶-1-基)氯磷酸酯向實施例3標題化合物(29.2g,93.3mmol)的dcm(100ml)的攪拌的冷(冰/水浴)溶液滴加mo(tr)t#(22.6g,46.7mmol)、2,6-二甲基吡啶(21.7ml,187mmol)和4-(二甲基氨基)吡啶(1.14g,9.33mmol)的dcm(100ml)溶液，持續(xù)10分鐘。使水浴回暖至室溫。15小時之后，用檸檬酸溶液(200ml×3,10％w/vaq)洗滌溶液，干燥(mgso4)，濃縮并將粗油直接裝載在柱上。濃縮色譜分析[sio2柱(120g)，己烷/etoac洗脫液(梯度從1:1至0:1)，重復3次]級分，從而以白色固體形式提供標題化合物(27.2g,77％的產(chǎn)率)。esi/ms計算l-(4-硝基苯基)哌嗪衍生物c46h50f3n8o8p：930.3，實測：m/z＝929.5(m-l)。實施例5((2s,6r)-6-(6-苯甲酰胺基-9h-嘌呤-9-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基)甲基(4-(2,2,2-三氟乙酰胺基)哌啶-1-基)氯磷酸酯以與實施例4所述方式類似的方式合成標題化合物，從而以白色固體形式提供標題化合物(15.4g,66％的產(chǎn)率)。esi/ms計算l-(4-硝基苯基)哌嗪衍生物c53h53f3n11o7p：1043.4，實測：m/z＝1042.5(m-l)。實施例6(r)-甲基(1-苯基乙基)磷酰胺二氯向三氯氧化磷(2.83ml,30.3mmol)的dcm(30ml)的冷(冰/水浴)溶液依次滴加2,6-二甲基吡啶(7.06ml,60.6mmol)，以及(r)-(+)-n,a-二甲基芐胺(3.73g,27.6mmol)的dcm溶液，同時攪拌。5分鐘之后，去除浴，并使反應混合物回暖至室溫。1小時之后，用檸檬酸溶液(50ml×3,10％w/vaq)洗滌反應溶液、干燥(mgso4)、通過sio2過濾并濃縮，從而以白色泡沫形式提供標題化合物(3.80g)。esi/ms計算l-(4-硝基苯基)哌嗪衍生物c19h25n4o4p：404.2，實測：m/z＝403.1(m-l)。實施例7(s)-甲基(1-苯基乙基)磷酰胺二氯以與實施例6所述方式類似的方式合成標題化合物，從而以白色泡沫形式提供標題化合物(3.95g)。esi/ms計算l-(4-硝基苯基)哌嗪衍生物c19h25n4o4p：404.2，實測：m/z＝403.1(m-l)。實施例8((2s,6r)-6-(5-甲基-2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基)甲基甲基((r)-1-苯基乙基)磷酰胺氯以與實施例4所述方式類似的方式合成標題化合物，從而以白色固體形式提供標題氯代磷酰胺酯(4.46g,28％的產(chǎn)率)。esi/ms計算c38h40c1n4o5p：698.2，實測：m/z＝697.3(m-l)。實施例9((2s,6r)-6-(5-甲基-2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基)甲基甲基((s)-1-苯基乙基)磷酰胺氯以與實施例4所述方式類似的方式合成標題化合物，從而以白色固體形式提供標題氯代磷酰胺酯(4.65g,23％的產(chǎn)率)。esi/ms計算c38h40c1n4o5p：698.2，實測：m/z＝697.3(m-l)。實施例10(4-(吡咯烷-1-基)哌啶-1-基)二氯磷酸酯鹽酸鹽向三氯氧化磷(5.70ml,55.6mmol)的dcm(30ml)的冷(冰/水浴)溶液加入2,6-二甲基吡啶(19.4ml,167mmol)，以及4-(l-吡咯烷基)-哌啶(8.58g,55.6mmol)的dcm(30ml)溶液，并攪拌1小時。過濾懸浮液并用過量二乙醚洗滌固體，從而以白色固體形式提供標題吡咯烷(17.7g,91％的產(chǎn)率)。esi/ms計算l-(4-硝基苯基)哌嗪衍生物c19h30n5o4p：423.2，實測：m/z＝422.2(m-l)。實施例11((2s,6r)-6-(5-甲基-2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基)甲基(4-(吡咯烷-1-基)哌啶-1-基)氯磷酸酯鹽酸鹽向二氯代磷酰胺酯8(17.7g,50.6mmol)的dcm(100ml)的攪拌的冷(冰/水浴)溶液滴加mo(tr)t#(24.5g,50.6mmol)、2,6-二甲基吡啶(17.7ml,152mmol)和1-甲基咪唑(0.401ml,5.06mmol)的dcm(100ml)溶液，持續(xù)10分鐘。隨著攪拌懸浮液，使浴回暖至室溫。6小時之后，將懸浮液倒在二乙醚(1l)上，攪拌15分鐘，過濾并用額外的醚洗滌固體，從而提供白色固體(45.4g)。粗產(chǎn)物通過色譜層析[sio2柱(120克),dcm/meoh洗脫液(梯度從1:0至6:4)]純化，并將合并的級分倒在二乙醚(2.5l)上，攪拌15分鐘，過濾并用額外的醚洗滌所得固體，從而以白色固體形式提供標題化合物(23.1g,60％的產(chǎn)率)。esi/ms計算l-(4-硝基苯基)哌嗪衍生物c48h57n8o7p：888.4，實測：m/z＝887.6(m-l)。實施例123-(叔丁基二硫烷基)-2-(異丁氧基羰基氨基)丙酸向s-叔丁基巰基-l-半胱氨酸(10g,47.8mmol)的ch3cn(40ml)溶液加入k2co3(16.5g,119.5mmol)的h2o(20ml)溶液。攪拌15分鐘之后，緩慢注入異丁基氯甲酸酯(9.4ml,72mmol)。使反應進行3小時。通過硅藻土(celite)過濾白色固體，濃縮濾液以去除ch3cn。殘余物溶解于乙酸乙酯(200ml)，用1nhc1(40ml×3)，鹽水(40×1)洗滌，用na2so4干燥。在色譜分析(5％meoh/dcm)之后，獲得所需產(chǎn)物(2)。實施例134-(3-(叔丁基二硫烷基)-2-(異丁氧基羰基氨基)丙酰胺基)哌啶-1-羧酸叔丁酯向酸(來自實施例12的化合物2，6.98g，22.6mmol)的dmf(50ml)溶液加入hatu(8.58g,22.6mmol)。30分鐘之后，向混合物加入hunig堿(4.71ml,27.1mmol)和l-boc-4-氨基哌啶(5.43g,27.1mmol)。反應在室溫下攪拌進行另外的3小時。在高真空下去除dmf，將粗殘余物溶解于etac(300ml)，用h2o(50ml×3)洗滌。在isco純化(5％meoh/dcm)之后，獲得最終產(chǎn)物(3)。實施例143-(叔丁基二硫烷基)-1-氧-1-(哌啶-4-基氨基)丙烷-2-基氨基甲酸異丁酯向實施例13制備的化合物3(7.085g,18.12mmol)加入30ml的4mhcl/二氧六環(huán)。在室溫下2小時之后，完成反應。hcl鹽(4)被用于下一步驟而無需進一步純化。實施例153-(叔丁基二硫烷基)-1-(1-(二氯磷?；?哌啶-4-基氨基)-1-氧代丙烷-2-基氨基甲酸異丁酯在氬氣下，向-78℃的實施例15制備的化合物4(7.746g,18.12mmol)的dcm(200ml)溶液緩慢注入pocl3(1.69ml,18.12mmol)，然后加入et3n(7.58ml,54.36mmol)。在室溫下攪拌反應5小時，濃縮以去除過量的堿和溶劑。在isco純化(50％etac/己烷)之后，以白色固體形式給出產(chǎn)物(5)。實施例163-(叔丁基二硫烷基)-1-(1-(氯(((2s,6r)-6-(5-甲基-2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基)甲氧基)磷?；?哌啶-4-基氨基)-1-氧代丙烷-2-基氨基甲酸異丁酯在0℃，向1-((2r,6s)-6-(羥基甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基)-5-甲基嘧啶-2,4(lh,3h)-二酮(mot(tr))(5.576g,10.98mmol)的dcm(100ml)溶液加入二甲基吡啶(1.92ml,16.47mmol)和dmap(669mg,5.5mmol)，然后加入4(6.13g,12.08mmol)。反應在室溫下保持攪拌18小時。在isco純化(50％etac/己烷)之后，獲得所需產(chǎn)物(6)。實施例17((2s,6r)-6-(5-甲基-2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基)甲基己基(甲基)磷酰胺氯在n2下，將n-羥基l甲胺(4.85ml,32mmol)的dcm(80ml)溶液冷卻至-78℃。緩慢添加磷酰氯(2.98ml,32mmol)的dcm(10ml)溶液，然后添加et3n(4.46ml,32mmol)的dcm(10ml)溶液。過夜繼續(xù)攪拌，同時使反應回暖至室溫。在isco純化(20％etac/己烷)之后，以清澈油狀形式給出所需產(chǎn)物(1)。在0℃下，向mot(tr)(5.10g,10.54mmol)的dcm(100ml)溶液加入二甲基吡啶(3.68ml,31.6mmol)和dmap(642mg,5.27mmol)，然后加入1(4.89g,21.08mmol)。反應在室溫下保持攪拌18小時。在isco純化(50％etoac/己烷)之后，獲得所需產(chǎn)物(2)。實施例18((2s,6r)-6-(5-甲基-2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基)甲基十二烷基(甲基)磷酰胺氯根據(jù)實施例6和8所述的一般程序制備標題化合物。實施例19((2s,6r)-6-(5-甲基-2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基)甲基嗎啉磷酰氯根據(jù)實施例6和8所述的一般程序制備標題化合物。實施例20((2s,6r)-6-(5-甲基-2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基)甲基(s)-2-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基氯磷酸酯根據(jù)實施例6和8所述的一般程序制備標題化合物。實施例21((2s,6r)-6-(5-甲基-2,4-二氧-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基)甲基4-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰胺基)哌啶-1-基氯磷酸酯向l-boc-4-哌啶(1g,5mmol)的dcm(20ml)溶液加入hunig堿(1.74ml,l0mmol)，然后加入3,4,5-三甲氧基苯甲酰氯(1.38g,6mmol)。在室溫下進行反應3小時，濃縮以去除溶劑和過量的堿。殘余物溶解于etac(100ml)，用0.05nhcl(3×15ml)、飽和nahco3(2×15ml)洗滌，用na2so4干燥。在isco純化(5％meoh/dcm)之后，獲得產(chǎn)物(1)。向7加入15ml的4nhcl/二氧六環(huán)，4小時后終止反應。以白色固體形式獲得8。在n2下，將8(1.23g,4.18mmol)的dcm(20ml)溶液冷卻至-78℃。緩慢添加磷酰氯(0.39ml,4.18mmol)的dcm(2ml)溶液，隨后添加et3n(0.58ml,4.18mmol)的dcm(2ml)溶液。過夜繼續(xù)攪拌，同時使反應回暖至室溫。在isco純化(50％etac/己烷)之后，獲得所需產(chǎn)物(9)。在0℃向，向mot(tr)(1.933g,4.0mmol)的dcm(20ml)溶液加入二甲基吡啶(0.93ml,8mmol)和dmap(49mg,0.4mmol)，然后加入9(1.647g,4mmol)。反應在室溫下保持攪拌18小時。在isco純化(50％etac/己烷)之后，獲得所需產(chǎn)物(10)。實施例22包含亞基(cpt)的環(huán)磷酰胺的合成將mot亞基(25g)懸浮在dcm(175ml)中，并加入nmi(n-甲基咪唑，5.94g,1.4eq.)以獲得清澈溶液。向反應混合物加入甲苯磺酰氯，通過tlc監(jiān)測反應進程直至完成(約2小時)。通過用0.5m檸檬酸緩沖液(ph＝5)，然后用鹽水洗滌進行水處理。分離有機層并用na2so4干燥。通過旋轉蒸發(fā)儀去除溶劑以獲得粗產(chǎn)品，其在下一步驟中使用而無需進一步純化。如上制備的mot甲苯磺酸鹽與丙醇胺(1g/10ml)混合。然后將反應混合物置于45℃的爐中過夜，然后用dcm(10ml)稀釋。通過用0.5m檸檬酸緩沖液(ph＝5)，然后用鹽水洗滌進行水處理。分離有機層并用na2so4干燥。用旋轉蒸發(fā)儀去除溶劑以獲得粗產(chǎn)物。通過nmr和hplc分析粗產(chǎn)物，并確定用于下一步驟而不需進一步純化。粗產(chǎn)物溶于dcm(2.5mldcm/g,1eq.)并與diea(3eq.)混合。用干冰-丙酮冷卻該溶液，并滴加pocl3(1.5eq.)。所得混合物在室溫下過夜攪拌。通過用0.5m檸檬酸緩沖液(ph＝5)，然后用鹽水洗滌進行水處理。分離有機層并用na2so4干燥。用旋轉蒸發(fā)儀去除溶劑以獲得淡黃色固體形式的粗產(chǎn)物。通過硅膠色譜分析來純化粗產(chǎn)物(粗產(chǎn)物/硅膠＝l:5的比,梯度為dcm至50％ea/dcm)，根據(jù)tlc分析合并級分。去除溶劑，從而以非對映異構體的混合物形式獲得所需產(chǎn)物。通過hplc(npp淬滅)和nmr(h-l和p-31)分析純化的產(chǎn)物。根據(jù)以下程序分離非對映異構體混合物。混合物(2.6g)溶于dcm中。將該樣品加載在rediseprf柱(80g正常相，由teledyneisco制造)上，并用10％ea/dcm至50％ea/dcm洗脫20分鐘。收集級分并通過tlc分析。根據(jù)tlc分析合并級分，并用旋轉蒸發(fā)儀在室溫去除溶劑。通過p-31nmr和npp-tfa分析確定合并的級分的非對映異構體比例。如果需要，重復以上程序直到非對映異構體比例達到97％。實施例23pmoplus的全膽酸修飾根據(jù)以下程序制備琥珀酰亞胺活化的膽酸衍生物。膽酸(12g,29.4mmol)、n-羥基琥珀酰亞胺(4.0g,34.8mmol)、edci(5.6g,29.3mmol)和dmap(1g,8.2mmol)裝入圓底燒瓶。加入dcm(400ml)和thf(40ml)以溶解。反應混合物在室溫下過夜攪拌。然后向反應混合物加入水(400ml)，分離有機層并用水(2×400ml)洗滌,隨后用飽和nahco3(300ml)和鹽水(300ml)洗滌。然后用na2so4干燥有機層。用旋轉蒸發(fā)儀去除溶劑以獲得白色固體。粗產(chǎn)物溶于氯仿(100ml)并沉淀于庚烷(1000ml)中。通過過濾收集固體，通過hplc和nmr分析，并無需進一步純化即可使用。稱取適量的pmoplus(20mg,2.8μmol)于小瓶(4ml)中，并溶于dmso(500μl)中。根據(jù)每個修飾兩當量的活化酯的比例向反應混合物中加入活化的膽酸酯(13mg,25μmol)，然后在室溫下過夜攪拌。通過maldi和hplc(c-18或sax)確定反應進展。反應完成之后(通過起始pmoplus的消失而確定)，一旦反應完成，則向反應混合物加入1ml濃氨水。然后將反應小瓶置于爐(45℃)中過夜(18小時)，然后冷卻至室溫并用1％的氨水(10ml)稀釋。將該樣品加載于spe柱(2cm)，然后用1％氨水溶液洗滌小瓶(2×2ml)。用1％氨水(3×6ml)洗滌spe柱，并用溶于1％氨水的45％乙腈(6ml)洗脫產(chǎn)物。通過uv光密度測量鑒定包含寡聚物的級分。通過冷凍干燥分離產(chǎn)物。通過maldi和hplc(c-18和/或sax)確定純度和身份。該同一程序適用于脫氧膽酸活化和與pmo+的結合。實施例24pmoplus的全胍基化稱取適量的pmoplus(25mg,2.8μmol)于小瓶(6ml)中，向小瓶加入lh-吡唑-l-甲脒氯化物(15mg,102μmol)和碳酸鉀(20mg,0.15mmol)。加入水(500μl)，并將反應混合物在室溫下過夜攪拌(約18小時)。通過maldi確定反應完成。一旦完成，用1％氨水(10ml)稀釋反應，并加載于spe柱(2cm)上。用1％氨水溶液洗滌小瓶(2×2ml)，并用1％氨水洗滌spe柱(3×6ml)。用溶于1％氨水的45％乙腈(6ml)洗脫產(chǎn)物。通過uv光密度測量確定包含寡聚物的級分。通過冷凍干燥分離產(chǎn)物。通過maldi和hplc(c-18和/或sax)確定純度和身份。實施例25pmoplus的全巰基乙?；揎?m23d)稱取適量的pmoplus(20mg,2.3μmol)于小瓶(4ml)中，并溶于dmso(500μl)。向反應混合物加入n-琥珀酰亞胺基-s-乙?；虼宜狨?sata)(7mg,28μmol)，并使其室溫下過夜攪拌。通過maldi和hplc監(jiān)測反應進程。一旦結束，向反應混合物加入1％氨水，并在室溫下攪拌2小時。將該溶液加載于spe柱(2cm)上，用1％氨水溶液洗滌小瓶(2×2ml)并用1％氨水洗滌spe柱(3×6ml)。用溶于1％氨水的45％乙腈(6ml)洗脫產(chǎn)物。通過uv光密度測量確定包含寡聚物的級分。通過冷凍干燥分離產(chǎn)物。通過maldi和hplc(c-18和/或sax)確定純度和身份。實施例26pmoplus的全琥珀酸修飾稱取適量的pmoplus(32mg,3.7μmol)于小瓶(4ml)中，并溶于dmso(500μl)。向反應混合物加入n-乙基嗎啉(12mg,100μmol)和琥珀酸酐(10mg,100μmol)，并使其室溫下過夜攪拌。通過maldi和hplc監(jiān)測反應進程。一旦結束，向反應混合物加入1％氨水，并在室溫下攪拌2小時。將該溶液加載于spe柱(2cm)上，用1％氨水溶液洗滌小瓶(2×2ml)并用1％氨水洗滌spe柱(3×6ml)。用溶于1％氨水的45％乙腈(6ml)洗脫產(chǎn)物。通過uv光密度測量確定包含寡聚物的級分。通過冷凍干燥分離產(chǎn)物。通過maldi和hplc(c-18和/或sax)確定純度和身份。以上程序還可用于pmoplus的戊二酸(戊二酸酐)和四亞甲基戊二酸(四亞甲基戊二酸酐)修飾。實施例27用本發(fā)明的示例性pmo寡聚物處理mdx小鼠mdx小鼠是可接受的和良好表征的杜興式肌營養(yǎng)不良(dmd)動物模型，其包含肌營養(yǎng)不良蛋白基因的外顯子23的突變。已知m23d反義序列(seqidno:15)誘導外顯子23跳躍并恢復功能性肌營養(yǎng)不良蛋白表達。使用m23dpmo+寡聚物(ng-09-0711,ng-10-0055,ng-10-0056)或兩種pmo化合物，通過尾部靜脈注射向mdx小鼠給藥一次(50mg/kg)，所述兩種pmo化合物包含4-氨基哌啶基鍵(ng-10-0070，其包含上文所述并在圖2中所示的pmoapn鍵)和4-琥珀酰胺基哌嗪基鍵(ng-10-0105，其包含上文所述且在圖2中所示的pmosuc鍵)。肽結合的pmo(ppmo)在試驗中用作陽性對照(avi-5225；seqidno:16)。所有測試的寡聚物具有相同的反義序列，但根據(jù)鍵或肽的類型(對于avi-5225，參見表8)而變化。注射后1周，處死m(xù)dx小鼠并從多個肌肉組織提取rna。終點pcr用于確定包含外顯子23的肌營養(yǎng)不良蛋白mrna和由于反義誘導的外顯子跳躍而缺乏外顯子23的肌營養(yǎng)不良蛋白mrna的相對豐度。外顯子23跳躍的百分比為體內反義活性的測量值。圖5示出來自處理后1周的四頭肌的結果。包含4個陽離子4-氨基哌啶基鍵的ng-10-0070顯示出相對于任何pmo+化合物(ng-10-0055、-0056和-0057)的兩倍增加的活性。包含4個陰離子4-琥珀酰胺基哌嗪基鍵的ng-10-0105化合物與pmo+寡聚物相比活性相當。如所預期地，avi-5225ppmo(肽結合的)化合物由于細胞穿透遞送肽而最有效。媒介物和wtc57(野生型小鼠)處理是陰性對照，并且不表達外顯子23跳躍的肌營養(yǎng)不良蛋白mrna。表8.實施例27的序列使用更廣范圍的m23dpmo內的修飾的亞基間鍵進行支持本發(fā)明的其他實驗，并在上文所述的mdx小鼠模型中使用。具有所述鍵的寡聚物的子集在上文表7中列出。圖6示出來自該擴大的篩選的結果，并顯示具有最高活性的m23d寡聚物為ng-10-0070、ng-10-0104、ng-10-0095和ng-10-0133，其分別包含鍵b10、b54、b10和b10(圖6中，x軸上的標記對應于化合物id#的后三個字母)。mdx小鼠接受50mg/kg劑量的單次靜脈注射。圖6中示出的其他活性化合物是包含末端修飾的m23dpmo，并在上文表6中描述。所有化合物與沒有任何亞基間或末端修飾的pmo(seqidno：15)進行比較。支持本發(fā)明的其他實驗使用具有亞基間鍵和末端鍵的更廣范圍的化合物。亞基間鍵修飾在上文表9中示出。使用這些化合物的結果在下文表9中示出。結果按最有效的化合物在表頂端來排序。表9.來自用本發(fā)明pmo-x化合物處理的mdx小鼠的四頭肌和橫膈膜組織中的外顯子23跳躍實施例28用本發(fā)明的示例性pmo寡聚物處理轉基因egfp小鼠支持本發(fā)明的實驗使用用于體內反義活性的基于egfp的測定，并且用于評估包含本發(fā)明的修飾的亞基間鍵的寡聚物。已經(jīng)描述了其中egfp-654轉基因在整個體內一致地表達的轉基因egfp小鼠模型(sazani,gemignanietal.2002)。該模型使用活性的剪接測定，其中本發(fā)明的修飾的寡聚物阻斷異常剪接并恢復修飾的增強的綠色熒光蛋白(egfp)前mrna的正確剪接。在該方法中，每個寡聚物的反義活性直接與egfp報告蛋白的上調成比例。因此，可以在幾乎每個組織中監(jiān)測同一寡聚物的功能效果。這與靶向那些表達僅限于某些組織或僅在某些組織中為顯性相關的基因的寡聚物不同。在egfp-654小鼠中，前mrna可在所有組織中容易地檢測到，盡管在骨髓、皮膚和腦中發(fā)現(xiàn)較小的量。翻譯的egfp的水平與反義寡聚物的效能和它們在作用位點的濃度成比例。從多個組織分離的總rna的rt-pcr顯示egfp-654轉錄本在所有受調查的組織中表達。在給藥后8天收集來自用5-150mg/kg化合物處理的egfp-654小鼠(n＝6)的組織，并在-80℃冷凍。在即將在getyphoontrio成像之前，解凍組織，用pbs蒙霧(misted)并直接排列在掃描器的玻璃板上。使用488nm激發(fā)激光和在板表面具有焦面的520nmbp40發(fā)射濾波器進行50微米掃描以收集egfp熒光。利用imagequant分析組織掃描以確定每個組織的平均熒光。來自僅用媒介物處理的3-5只小鼠的組織熒光被平均，以產(chǎn)生每個組織類型的內源性背景熒光測量值。來自化合物處理的小鼠的相應組織的倍數(shù)熒光值計算為媒介物組織熒光的分數(shù)。圖7b-c示出兩種pmo在egfp-654小鼠模型中的組織特異性活性，所述兩種pmo包含分別含有鍵b54和b11的本發(fā)明的示例性亞基間鍵ng-10-0110和ng-10-0323。所有測試的寡聚物來源于egfp654序列(seqidno：17)。為了比較，使用具有相同序列但缺乏任何亞基間修飾的pmo的結果在圖7a中示出。ng-10-0110(seqidno：17)在四頭肌中具有高活性且在肝中具有低活性(圖7b)；而ng-10-0323具有改善的肝活性和肌肉遞送(圖7c)。支持本發(fā)明的其他實例包括使用利用本發(fā)明的鍵和端基修飾的egfp(seqidno：17)寡聚物的實驗。如圖11和12所示，相對于pmo和pmoplus寡聚物，在來自如上文所述處理的小鼠的多個組織中，多種修飾的寡聚物表現(xiàn)出改善的egfp剪接修正活性。該實例中所述的化合物的具體pmo-x修飾在下文表10中示出。表10.顯示鍵類型的實施例28中使用的序列ng-10-0110gcguantatguantacctguantaacccagng-10-0323gcpyrtatpyrtacctpyrtaacccagpmoplus；ng-10-0301gc+tat+tacc+ttaacccagng-10-0248gcataatataccatataacccagng-10-0600*gcatatatacctataacccagng-10-0602**gcptatptacctptaacccagng-10-0389gcxatxacctxaacccagng-10-0247gcptaptptacctptaacccagng-10-0299gcatatatacctataacccagng-10-0355***gcatatatacctataacccag*來自ng-10-0299的三甲基甘氨酸?；漠a(chǎn)物；**pt＝pmopyr對來自ng-10-0323的四胺進行甲基化；x＝pmoapn；***3’三苯甲基實施例29用本發(fā)明的示例性pmo寡聚物治療甲型流感病毒感染的細胞制備一系列包含多種修飾的亞基間鍵的pmo，并用于治療培養(yǎng)物中的甲型流感病毒感染的細胞。pmo和包含本發(fā)明的修飾的亞基間鍵的pmo都被設計為在aug起始密碼子靶向病毒m1/m2片段，并具有兩個堿基序列(seqidnos：3和4)中的一個。具有本發(fā)明的修飾的亞基間鍵的pmo在表4中列出，并由下文序列表表格中的ng數(shù)指示來確定。通過反義靶向m1/m2片段中的多個位點來對甲型流感病毒復制的抑制描述于共有的未決美國申請第12/945,081號，將其以整體形式并入本文作為參考。除了通過靶向于通常的m1/m2aug起始位點來抑制翻譯以外，也可利用本發(fā)明化合物，靶向于剪接供體和剪接受體位點。肺泡的小鼠巨噬細胞系(atcc；amj2-c11)在0.1moi用h1n1(pr8病毒株)感染，并且在感染后1小時添加ppmo。35攝氏度下孵育細胞過夜。然后采集病毒的上清液并用vnar蛋白酶孵育以釋放病毒的rna。通過定量實時pcr(qrt-pcr)定量harna。洗滌細胞、固定并透化。然后37攝氏度下用單克隆抗體對m1與m2蛋白進行探針探測30分鐘。洗滌細胞并且在室溫下添加與alexa646結合的抗鼠的igg15分鐘。然后通過流式細胞術測定m1與m2。為檢測m1與m2蛋白水平，m1或m2陽性細胞的百分比與m1或m2的平均熒光強度相乘。然后，每一樣品除以未處理的對照，從而產(chǎn)生m1或m2與未處理的混雜對照相比的百分比。圖8示出來自用本公開的多種化合物處理的細胞中的病毒m2蛋白水平的降低。上文所述的流式細胞計數(shù)法被用于確定60微摩爾處理之后的相對m2蛋白表達。寡聚物不同程度地抑制m2蛋白的產(chǎn)生，而包含鍵b1的ng-10-180(seqidno：3)為最有效的。使用沒有任何亞基間修飾的pmo的結果在圖8中示出為ng-10-0015(seqidno：3)，以用于比較。實施例30用本發(fā)明的示例性pmo寡聚物體內治療甲型流感病毒感染的小鼠使用被甲型流感pr8病毒株感染的balb/c小鼠進行支持本發(fā)明的其他實驗。在之前用本發(fā)明的pmo-x化合物處理后4小時，通過鼻內接種用3.5tcid50感染小鼠。在一些試驗中，在感染后96小時給予額外劑量的pmo-x。所有劑量由溶于50微升pbs的100微克測試化合物組成，并通過鼻內吹入法給藥。每天監(jiān)測動物的體重，并用作抗病毒藥物活性的臨床終點。感染后第7天，處死動物并收集肺，以用于利用上文實施例29所述的qrt-pcr方法進行病毒載量測定。利用半對數(shù)梯度稀釋的肺勻漿，并涂于amj-c12巨噬細胞上，從而進行tcid50測定。在35攝氏度24小時后，更換培養(yǎng)基，并在35攝氏度再孵育72h。加入50ml的0.5％雞rbc的pbs溶液，并在4攝氏度孵育1h。讀取紅血球凝聚模式并使用reedandmuench方法計算tcid50。然后將tcid50值標準化以輸入組織重量。如圖9所示，h1n1感染之后，pmo-x化合物相對于pmoplus化合物表現(xiàn)出增強的抗病毒活性和降低的體重損失。用h1n1感染balb/c小鼠(n＝4)，并在感染前4小時給予單份100微克劑量的pmo。每天稱重小鼠，并從感染前體重確定體重喪失百分比。感染后7天收集肺，并通過tcid50測定病毒載量。結果以病毒活性相對于裸pmo的增加倍數(shù)來表示。該實驗顯示了兩種pmo-x化合物(ng-10-0097和ng-11-0173；seqidno：3)相對于未修飾的pmo(ng-10-0015；seqidno：3)的約50倍增加的抗病毒活性，以及相對于pmoplus化合物(ng-11-0170；seqidno：3)的約10倍更高的活性。利用體重作為抗病毒活性的臨床測量值，圖10示出與圖9中所述的實驗類似的實驗。相對于pmoplus化合物(ng-11-0170)，數(shù)種pmo-x化合物顯示出優(yōu)越的結果，包括包含琥珀酰鍵的化合物(ng-10-0108)、包含異丙基哌嗪鍵的化合物(ng-11-0148)和包含吡咯酮鍵的化合物(ng-11-0173)，以及用3’末端二苯甲基修飾的pmoplus化合物(ng-11-0145)。實施例31包含修飾的端基的寡核苷酸類似物的制備向包含游離3’端的25-merpmo(27.7mg,3.226μmol)的dms(300μl)溶液加入法呢基溴(1.75μl,6.425μmol)和二異丙基乙胺(2.24μl,12.9μmol)。反應混合物在室溫下攪拌5小時。用10ml的1％nh4oh水溶液稀釋粗反應混合物，然后加載在2ml的amberchromecg300m柱上。然后用3倍柱體積的水洗滌柱，并用6ml的1:1乙腈和水(v/v)洗脫產(chǎn)物。然后冷凍干燥溶液從而以白色固體形式獲得標題化合物。實施例32嗎啉代寡聚物的制備三苯甲基哌嗪苯基氨基甲酸酯35的制備(參加圖3)：向化合物11的二氯甲烷(6ml/g11)的冷懸浮液加入碳酸鉀(3.2eq)的水(4ml/g碳酸鉀)溶液。向該兩相混合物緩慢加入氯甲酸苯酯(1.03eq)的二氯甲烷(2g/g氯甲酸苯酯)溶液。反應混合物回暖至20℃。一旦反應完成(1-2hr)，分離層。將有機層用水洗滌，并用無水碳酸鉀干燥。通過從乙腈結晶來分離產(chǎn)物35。產(chǎn)率＝80％。氨基甲酸酯醇36的制備：將氫化鈉(1.2eq)懸浮在1-甲基-2-吡咯烷酮(32ml/g的氫化鈉)中。向該懸浮液加入三甘醇(10.0eq)和化合物35(1.0eq)。將所得到漿液加熱至95℃。一旦反應完成(1-2hr)，將該混合物冷卻至20℃。向該混合物加入30％二氯甲烷/甲基叔丁醚(v:v)和水。將含有產(chǎn)物的有機層先后用naoh水溶液、琥珀酸水溶液和飽和氯化鈉水溶液洗滌。通過從二氯甲烷/甲基叔丁醚/庚烷中結晶來分離產(chǎn)物36。產(chǎn)率＝90％。尾酸(tailacid)37的制備：向化合物36的四氫呋喃(7ml/g36)溶液加入琥珀酸酐(2.0eq)和dmap(0.5eq)。將混合物加熱至50℃。一旦反應完成(5hr)，將混合物冷卻至20℃并用nahco3水溶液調節(jié)至ph值為8.5。加入甲基叔丁醚，并將產(chǎn)物萃取入水層。加入二氯甲烷，并用檸檬酸水溶液將混合物調節(jié)至ph值為3。用ph＝3的檸檬酸鹽緩沖液與飽和氯化鈉水溶液的混合物來洗滌含有產(chǎn)物的有機層。將該37的二氯甲烷溶液在沒有分離的情況下用于制備化合物38。38的制備：向化合物37的溶液加入n-羥基-5-降冰片烯-2,3-二羧酸酰亞胺(honb)(1.02eq)、4-二甲基氨基吡啶(dmap)(0.34eq)，然后加入l-(3-二甲基氨基丙基)-n’-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)(1.1eq)。將混合物加熱至55℃。一旦反應完成(4-5hr)，將混合物冷卻至20℃并先后用1:10.2m檸檬酸/鹽水和鹽水洗滌。二氯甲烷溶液經(jīng)過將溶劑調換成丙酮然后調換成n,n-二甲基甲酰胺，并且通過從丙酮/n,n-二甲基甲酰胺沉淀而進入飽和氯化鈉水溶液，從而分離產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物在水中重新打漿數(shù)次以除去殘余的n,n-二甲基甲酰胺和鹽。源于化合物36的38的產(chǎn)率＝70％。通過用于固相合成過程中加入亞基的步驟，在nmp中將活化的“尾部”引入到二硫化物錨-樹脂上。用于合成嗎啉代低聚物的固體載體的制備：在具有粗孔隙率(40-60μm)玻璃粉、頂置式攪拌器和三通teflon旋塞閥的硅烷化夾套式肽管(jacketedpeptidevessel)(定制于chemglass,nj,usa)中進行該步驟，通過玻璃粉或真空萃取使n2冒出。通過循環(huán)水浴實現(xiàn)反應容器中的溫度控制。以下步驟中的樹脂處理/洗滌步驟由兩個基本操作組成：樹脂流化和溶劑/溶液萃取。對于樹脂流化，調整旋塞閥位置使n2向上流動通過玻璃粉，并將規(guī)定的樹脂處理/洗滌液添加至反應器，并使樹脂浸透和完全潤濕。然后開始混合，并將樹脂漿液混合，持續(xù)規(guī)定的時間。對于溶劑/溶液萃取，停止混合和n2流，并啟動真空泵，然后調整旋塞閥位置以進行樹脂處理/洗滌液到廢料的排除。除非另有說明，樹脂處理/洗滌液的體積為15ml/g樹脂。向硅烷化夾套式肽管中的氨基甲基聚苯乙烯樹脂(100-200目；約1.0mmol/gn2取代；75g,1eq,polymerlabs,uk,part#1464-x799)加入1-甲基-2-吡咯烷酮(nmp；20ml/g樹脂)，并使樹脂膨脹同時混合1-2hr。在排除膨脹的溶劑之后，用二氯甲烷(2×1-2min)、5％二異丙基乙胺的25％異丙醇/二氯甲烷(2×3-4min)和二氯甲烷(2×1-2min)洗滌樹脂。在排除最后的洗滌液之后，用二硫化物錨34的1-甲基-2-吡咯烷酮(0.17m；15ml/g樹脂，約2.5eq)溶液流化樹脂，并在45℃下將樹脂/試劑混合物加熱60hr。反應一完成，終止加熱并排除錨溶液，并且用1-甲基-2-吡咯烷酮(4×3-4min)和二氯甲烷(6×1-2min)洗滌樹脂。用10％(v/v)的焦碳酸二乙酯的二氯甲烷(16ml/g；2×5-6min)溶液處理樹脂，然后用二氯甲烷(6×1-2min)洗滌。將樹脂39(參見圖4)在n2流下干燥1-3hr，然后在真空下干燥至恒定重量(±2％)。產(chǎn)率：初始樹脂重量的110％-150％。氨基甲基聚苯乙烯-二硫化物樹脂的載量的確定：通過光譜檢測每克樹脂的三苯基甲基(三苯甲基)數(shù)目，來確定樹脂的載量(潛在可用的反應位點的數(shù)目)。將已知重量的干燥樹脂(25±3mg)轉移至硅烷化25ml容量瓶中，并加入約5ml的2％(v/v)三氟乙酸的二氯甲烷溶液。通過輕輕地渦旋將所含物混合，然后靜置30min。使用額外的2％(v/v)三氟乙酸的二氯甲烷溶液使體積達到25ml，并且將所含物徹底混合。使用正壓分注滴管，將一份等分的含有三苯甲基的溶液(500μl)轉移至10ml容量瓶中，并用甲磺酸使體積達到10ml。通過在431.7nm的uv吸收來測量最終溶液中的三苯甲基陽離子含量，并用合適的體積、稀釋液、消光系數(shù)(ε:41μmol-1cm-1)和樹脂重量，以每克樹脂的三苯甲基(μmol/g)來計算樹脂載量。將該檢測進行三次并計算平均載量。本實施例中的樹脂裝載過程會提供具有約500μmol/g的載量的樹脂。如果在室溫下將二硫化物錨并入步驟進行24hr，則獲得300-400μmol/g的載量。尾部加載：使用與用于制備氨基甲基聚苯乙烯-二硫化物樹脂相同的方案和體積，能夠將尾部(tail)引入分子。對于結合步驟，使用38(0.2m)的nmp溶液來代替二硫化物錨溶液，該nmp含有4-乙基嗎啉(nem,0.4m)。在45℃下進行2hr后，將樹脂39用5％二異丙基乙胺的25％異丙醇/二氯甲烷溶液洗滌兩次，并用dcm洗滌一次。向樹脂加入苯甲酸酐(0.4m)和nem(0.4m)的溶液。在25min之后，將反應器夾套冷卻至室溫，并將樹脂用5％二異丙基乙胺的25％異丙醇/二氯甲烷溶液洗滌兩次，并且用dcm洗滌八次。將樹脂40過濾并在高真空下干燥。將樹脂40的載量定義為在尾部加載中所用的初始氨基甲基聚苯乙烯-二硫化物樹脂39的載量。固相合成：嗎啉代寡聚物在gilsonams-422自動化肽合成儀上在2mlgilson聚丙烯反應柱(部件號3980270)中制備。隨著柱坐落在合成儀上，柱周圍放置了具有水流通道的鋁塊。ams-422將二選一地添加試劑/洗滌溶液，保持特定的時間并利用真空排空所述柱。對于長度為高達約25個亞基的寡聚物，優(yōu)選的是填充有近500μmol/g樹脂的氨基甲基聚苯乙烯-二硫化物樹脂。對于更大的寡聚物，優(yōu)選的是填充有300-400μmol/g樹脂的氨基甲基聚苯乙烯-二硫化物樹脂。如果需要具有5’尾部的分子，則選擇具有相同加載方針的已加載有尾部的樹脂。制備以下反應溶液：脫三苯甲基化溶液：10％的氰基乙酸(w/v)的4:1二氯甲烷/乙腈；中和溶液：5％的二異丙基乙胺的3:1二氯甲烷/異丙醇；互補溶液：0.18m(或對于已生長長于20個亞基的寡聚物為0.24m)所需堿基和鍵類型的活化的嗎啉代亞基以及0.4mn乙基嗎啉的1,3-二甲基咪唑烷酮溶液。二氯甲烷(dcm)被用作分離不同試劑溶液洗滌的過渡洗滌液。在塊(block)設定為42℃的合成儀上，向每個包含30mg氨基甲基聚苯乙烯-二硫化物樹脂(或尾樹脂)的柱加入2ml的l-甲基-2-吡咯烷酮，并允許位于室溫下30分鐘。用2ml二氯甲烷洗滌2次之后，利用以下合成循環(huán)：單個寡聚物的序列被編程進合成儀，使得每個柱按適當?shù)捻樞蚪邮苓m當?shù)幕パa溶液(a、c、g、t、i)。當柱中的寡聚物已經(jīng)完成其最終亞基的并入時，從塊中移除柱并用互補溶液手動地進行最終循環(huán)，所述互補溶液由包含0.89m4-乙基嗎啉的4-甲氧基三苯基甲基氯(0.32m的dmi溶液)組成。從樹脂裂解并移除堿基和主鏈保護基團：在甲氧基三苯甲基化之后，用2mll-甲基-2-吡咯烷酮洗滌樹脂8次。加入1ml的由0.1m1,4-二硫蘇糖醇(dtt)和0.73m三乙胺的1-甲基-2-吡咯烷酮溶液組成的裂解溶液，將柱加蓋，并允許處于室溫30分鐘。該時間之后，將溶液排入12mlwheaton小瓶。用300μl裂解溶液洗滌顯著皺縮的樹脂兩次。向該溶液中加入4.0ml濃氨水(儲存于-20℃)，將小瓶緊密加蓋(用teflon內襯的螺冒)，并渦旋混合物以混合溶液。將小瓶放置在45℃爐中保持16-24hr以有效裂解堿基和主鏈保護基團。原始寡聚物分離：從爐中去除裝入瓶中的氨解作用溶液并允許冷卻至室溫。用20ml的0.28％氨水稀釋溶液并通過含有macroprephq樹脂(biorad)的2.5×10cm柱。使用鹽梯度(a：0.28％氨水和b：1m的氯化鈉的0.28％氨水溶液；60分鐘中b從0至100％)以洗脫包含峰值的甲氧基三苯甲基。合并混合級分并根據(jù)所需產(chǎn)物進一步處理。嗎啉代寡聚物的脫甲氧基三苯甲基化：用1m的h3po4處理來自macroprep純化過程的合并的級分，以將ph值降低到2.5。在最初的混合之后，樣品處于室溫4分鐘，這時，用2.8％氨水/水將它們中和至ph值為10-11。通過固相萃取(spe)純化產(chǎn)物。amberchromecg-300m(rohmandhaas；philadelphia,pa)(3ml)封裝入20ml燒結的柱(frittedcolumns)(bioradecono-pacchromatographycolumns(732-1011))，并用3ml下列物質沖洗樹脂：0.28％nh4oh/80％乙腈；0.5mnaoh/20％乙醇；水；50mmh3po4/80％乙腈；水；0.5naoh/20％乙醇；水；0.28％nh4oh。將來自脫甲氧基三苯甲基化的溶液加載在柱上，并用3-6ml的0.28％氨水沖洗樹脂3次。將wheaton小瓶(12ml)置于柱下，并通過2ml的45％乙腈的0.28％氨水溶液進行兩次洗滌來洗脫產(chǎn)物。在干冰上冷凍溶液，并將小瓶置于冷凍干燥器以產(chǎn)生蓬松的白色粉末。將樣品溶于水中，使用注射器通過0.22微米過濾器(palllifesciences,acrodisc25mm注射過濾器，具有0.2微米的httuffryn膜)過濾，并在uv分光光度計上測量光密度(od)以確定當前寡聚物的od單位，并分裝樣品用于分析。然后將溶液放置回wheaton小瓶以用于冷凍干燥。嗎啉代寡聚物的分析：maldi-tof質譜被用于確定純化中的級分組分，并且提供用于鑒定寡聚物的證據(jù)(分子量)。用3,5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸(芥子酸)、3,4,5-三羥基苯乙酮(thap)或α-氰基-4-羥基肉桂酸(hcca)的溶液作為基質，對樣品進行以下稀釋。使用dionexpropacscx-10,4×250mm柱(dionexcorporation；sunnyvale,ca)，利用25mmph＝5乙酸鈉25％乙腈(緩沖液a)和25mmph＝5乙酸鈉25％乙腈1.5m氯化鉀(緩沖液b)(15分鐘中梯度為10％至100％的b)或ph＝3.5的25mmkh2po425％乙腈(緩沖液a)和ph＝3.5的具有1.5m氯化鉀的25mmkh2po425％乙腈(緩沖液b)(15分鐘中，梯度為0％至35％的b)進行陽離子交換(scx)hplc。前一體系用于不具有連接的肽的帶正電的寡聚物，而后一體系用于肽結合物。通過陽離子交換色譜純化嗎啉代寡聚物：樣品溶于20mm乙酸鈉，ph＝4.5(緩沖液a)并應用于source30陽離子交換樹脂(gehealthcare)的柱，并用ph＝4.5的0.5m氯化鈉的20mm乙酸鈉和40％乙腈的溶液(緩沖液b)梯度洗脫。用濃氨水中和含有產(chǎn)物的合并的級分，并應用于amberehromespe柱。如上所述的那樣，洗脫、冷凍和冷凍干燥產(chǎn)物。表11.序列表能將上述各種實施方案進行組合以提供其它實施方案。將本說明書涉及的和/或申請數(shù)據(jù)單中列出的所有美國專利、美國專利申請公開、美國專利申請、國外專利、國外專利申請和非專利公開以其整體并入本文作為參考。若必要，則實施方案的方面可以修改以采用各種專利、申請和公開的概念從而提供其它實施方案。根據(jù)上述詳細描述，能對實施方案進行這些和其它的改變。一般而言，在下述權利要求中，使用的術語不應解釋為將權利要求限制在本說明書和權利要求中公開的具體實施方案，但應解釋為包括所有可能的實施方案連同這類權利要求所授權的等同物的所有范圍。因此，權利要求不受本公開的限制。序列表<110>avi生物制藥公司貢納·j·漢森；亞歷山大·查爾斯·魯?shù)婪颍徊虒氈?；周明；德懷特·d·懷勒<120>具有修飾的亞基間鍵和/或端基的寡核苷酸類似物<130>120178.487pc<140>pct<141>2011-05-27<150>us61/349,783<151>2010-05-28<150>us61/361,878<151>2010-07-06<150>us61/386,428<151>2010-09-24<160>88<170>fastseqforwindowsversion4.0<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>反義寡聚物<400>1cggtccacgtagactaacaact22<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>反義寡聚物<400>2gaagttcacacagataaacttct23<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>反義寡聚物<400>3cggtt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