一種診斷骨性關(guān)節(jié)炎致病風(fēng)險(xiǎn)的甲基化檢測(cè)試劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種診斷骨性關(guān)節(jié)炎致病風(fēng)險(xiǎn)的甲基化 檢測(cè)試劑，更具體的設(shè)及MED1化基因、MED1化基因的甲基化檢測(cè)及其在診治骨性關(guān)節(jié)炎中 的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨性關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis,OA)是一種W關(guān)節(jié)軟骨退行性病變和關(guān)節(jié)周圍骨 質(zhì)增生為主要病理特征的慢性進(jìn)行性骨關(guān)節(jié)病，是多因素導(dǎo)致的疾病，除了生活習(xí)慣、自身 體質(zhì)外，它還受很多基因及環(huán)境因子的影響。骨性關(guān)節(jié)炎的病理變化主要是關(guān)節(jié)軟骨的退 變及軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的改變。軟骨細(xì)胞正常基因調(diào)控模式越來越受到人們關(guān)注，它的改變 促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展。近年來，表觀遺傳學(xué)在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中的作用越來越 受到人們的關(guān)注。
[0003] DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分，在維持正常細(xì)胞功能、遺傳印記、胚胎 發(fā)育W及腫瘤發(fā)生中起著重要作用，是目前研究熱點(diǎn)之一。DNA甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶 催化作用下，利用S-腺巧甲硫氨酸提供甲基，在CpG二核巧酸中胞喀晚的喀晚環(huán)的五號(hào)碳 原子上加上甲基的共價(jià)修飾過程。DNA甲基化能關(guān)閉某些基因的活性，去甲基化則可誘導(dǎo)基 因的重新活化和表達(dá)。甲基化位點(diǎn)可隨DNA的復(fù)制而遺傳，因?yàn)镈NA復(fù)制后，甲基化酶可將 新合成的未甲基化的位點(diǎn)進(jìn)行甲基化。
[0004] 本發(fā)明通過對(duì)5例骨性關(guān)節(jié)炎病人及2例對(duì)照的膝關(guān)節(jié)軟骨組織進(jìn)行高通量甲基 化測(cè)序分析及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，篩選出幾個(gè)在病例組中呈高甲基化且基因表達(dá)下調(diào)的候選 基因及其甲基化位點(diǎn)。大樣本檢測(cè)時(shí)候選基因MEDl化在骨性關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)軟骨組織 中低表達(dá)，同時(shí)該基因在患者膝關(guān)節(jié)軟骨組織中甲基化程度明顯高于正常組。本發(fā)明提供 了一種新的骨性關(guān)節(jié)炎診治祀點(diǎn)，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種骨性關(guān)節(jié)炎診療試劑，所述診療試劑組分中的一種或 幾種用于檢測(cè)或降低序列表中SEQ ID NO. 3的CpG島甲基化程度。
[0006] 進(jìn)一步，所述診療試劑組分中的一種或幾種用于檢測(cè)或降低序列表中SEQ ID NO. 3的第SObp處CpG島甲基化程度。
[0007] 優(yōu)選的，采用BSP測(cè)序法對(duì)SEQ ID NO. 3的甲基化程度進(jìn)行檢測(cè)，更優(yōu)選的，采用 引物序列為序列表SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5進(jìn)行BSP測(cè)序檢測(cè)。
[0008] 優(yōu)選的，采用甲基化特異性PCR法對(duì)甲基化程度進(jìn)行檢測(cè)，甲基化特異性PCR法包 括一對(duì)甲基化檢測(cè)引物和一對(duì)非甲基化檢測(cè)引物。
[0009] 進(jìn)一步，采用下列方法中任意一種或幾種的組合對(duì)甲基化程度進(jìn)行檢測(cè)：甲基化 敏感的限制性內(nèi)切酶方法、NaHS〇3法、忍片技術(shù)方法；所述NaHSO3法包括BSP測(cè)序法、聯(lián)合 NaHS〇3限制性分析法、甲基化特異性PCR、巧光定量法；所述忍片技術(shù)方法包括甲基化高密 度忍片、差異甲基化雜交、甲基化特異性寡核巧酸忍片。
[0010] 本發(fā)明的目的在于提供上述診療試劑在制備骨性關(guān)節(jié)炎診療工具中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)MEDl化基因的試劑在制備診斷骨性關(guān)節(jié)炎診斷 制劑中的應(yīng)用。
[0012] 進(jìn)一步，所述診斷制劑中含有檢測(cè)MEDl化基因表達(dá)量和/或檢測(cè)MEDl化基因甲 基化程度的試劑。
[0013] 優(yōu)選的，采用下列方式中的一種或幾種檢測(cè)MEDl化基因表達(dá)量：巧光定量PCR試 劑盒、基因忍片、ELISA法和/或膠體金法，更優(yōu)選的，采用引物序列為序列表SEQIDNO. 1 和SEQIDNO. 2進(jìn)行MEDl化基因表達(dá)量檢測(cè)。
[0014] 本發(fā)明的目的在于提供一種治療骨性關(guān)節(jié)炎的制劑，所述制劑中含有促進(jìn)MEDl化 基因的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的試劑或化合物。
[0015] 本領(lǐng)域人員熟知促進(jìn)基因及其表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)通?？蒞采用下述方法中的一種 和/或幾種：激活MEDl化基因的啟動(dòng)子、激活MEDl化基因表達(dá)的蛋白或因子、導(dǎo)入促進(jìn) MEDl化基因轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的載體。
[0016] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)骨性關(guān)節(jié)炎的基因檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒檢測(cè) 基因MED1：3L。
[0017] 本發(fā)明目的是提供了一種骨性關(guān)節(jié)炎蛋白檢測(cè)試劑盒，所述的檢測(cè)試劑盒檢測(cè) MEDl化蛋白。進(jìn)一步的，所述的試劑盒還包括其他檢測(cè)試劑。
[0018] 本發(fā)明目的是提供了一種檢測(cè)骨性關(guān)節(jié)炎的基因忍片，所述的基因忍片包括與 MEDl化基因的核酸序列雜交的探針。
[0019] 甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶方法是經(jīng)典的甲基化分析方法，主要根據(jù)一些限制性 內(nèi)切酶不能切開甲基化的DNA序列。由于在真核DNA或者哺乳動(dòng)物DNA中，只有CG相連的 胞喀晚能夠被甲基化，因此，在酶切位點(diǎn)內(nèi)包含CG序列的限制性內(nèi)切酶就會(huì)遇到問題。運(yùn) 種方法所使用的兩個(gè)經(jīng)典酶對(duì)是HPaII-MspI(CCGG)和SmaI-XmaI(CCCGGG)。由于第二 對(duì)限制酶識(shí)別序列非常罕見，所W-般都用HPaII-MspI(CCGG)。兩個(gè)酶都識(shí)別CCGG序 列，而當(dāng)其中的胞喀晚甲基化時(shí)，HPaII不能夠?qū)⑵淝虚_，利用化aII-Msp工的運(yùn)種屬性處 理DNA，運(yùn)就使得HPaII-MspI能夠作為快速甲基化分析的工具，隨后進(jìn)行Southern或PCR 擴(kuò)增分離立物，明確甲基化狀態(tài)。
[0020] NaHS〇3可將非甲基化的C轉(zhuǎn)化為U，后者經(jīng)PCR擴(kuò)增變成T而產(chǎn)生T:A配對(duì)，但甲 基化的C則能抵抗Na服〇3的修飾，運(yùn)樣DNA包含的甲基化信息就可轉(zhuǎn)化為DNA序列的差異。 由此發(fā)展了多種CpG島甲基化檢測(cè)方法，如BSP測(cè)序、PCR(C0BRA，MSP，Metheli曲t等）、忍 片雜交技術(shù)（microarray)，此類方法適應(yīng)于檢測(cè)己知基因中一個(gè)或多個(gè)CpG島的幾個(gè)CpG 位點(diǎn)的甲基化，屬位點(diǎn)特異性DNA甲基化檢測(cè)技術(shù)。
[0021] 忍片技術(shù)的發(fā)展為高通量研究DNA甲基化提供了新的方法。它的方法原理大致可 分為3種：（1)基于亞硫酸氨鹽處理后C/T轉(zhuǎn)變的原理，（2)基于甲基化敏感性內(nèi)切酶或者 甲基化依賴性內(nèi)切酶的方法，（3)基于5-甲基胞喀晚抗體或者M(jìn)BD的免疫撲獲方法富集甲 基化的DNA片段。
[0022] 基因忍片又稱為DNA微陣列值NAmicroarray)，可分為S種主要類型：1)固定在 聚合物基片（尼龍膜，硝酸纖維膜等）表面上的核酸探針或CDNA片段，通常用同位素標(biāo)記 的祀基因與其雜交，通過放射顯影技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。2)用點(diǎn)樣法固定在玻璃板上的DM探針 陣列，通過與巧光標(biāo)記的祀基因雜交進(jìn)行檢測(cè)。3)在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成的寡核巧 酸探針陣列，與巧光標(biāo)記的祀基因雜交進(jìn)行檢測(cè)。基因忍片作為一種先進(jìn)的、大規(guī)模、高通 量檢測(cè)技術(shù)，應(yīng)用于疾病的診斷，其優(yōu)點(diǎn)有W下幾個(gè)方面：一是高度的靈敏性和準(zhǔn)確性；二 是快速簡(jiǎn)便；=是可同時(shí)檢測(cè)多種疾病。
[0023] 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)巧LISA)即將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標(biāo) 記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行的技術(shù)。該技術(shù)可用于檢測(cè)大分子抗原和特異性抗體 等，具有快速、靈敏、簡(jiǎn)便、載體易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)。ELISA檢測(cè)試劑盒根據(jù)檢測(cè)目的和操作 步驟可分為間接法、雙抗夾屯、法、競(jìng)爭(zhēng)法、雙位點(diǎn)一步法、捕獲法測(cè)IgM抗體、應(yīng)用親和素和 生物素的化ISA。ELISA檢測(cè)試劑盒中生色底物可選擇辣根過氧化物酶（HR巧或者堿性憐 酸酶（AF0。
[0024] 常用的免疫膠體金檢測(cè)技術(shù)：（1)免疫膠體金光鏡染色法細(xì)胞懸液涂片或組織切 片，可用膠體金標(biāo)記的抗體進(jìn)行染色，也可在膠體金標(biāo)記的基礎(chǔ)上，W銀顯影液增強(qiáng)標(biāo)記， 使被還原的銀原子沉積于已標(biāo)記的金顆粒表面，可明顯增強(qiáng)膠體金標(biāo)記的敏感性。（2)免疫 膠體金電鏡染色法可用膠體金標(biāo)記的抗體或抗抗體與負(fù)染病毒樣本或組織超薄切片結(jié)合， 然后進(jìn)行負(fù)染?？捎糜诓《拘螒B(tài)的觀察和病毒檢測(cè)。（3)斑點(diǎn)免疫金滲濾法應(yīng)用微孔濾膜 作載體，先將抗原或抗體點(diǎn)于膜上，封閉后加待檢樣本，洗涂后用膠體金標(biāo)記的抗體檢測(cè)相 應(yīng)的抗原或抗體。（4)膠體金免疫層析法將特異性的抗原或抗體W條帶狀固定在膜上，膠 體金標(biāo)記試劑（抗體或單克隆抗體）吸附在結(jié)合墊上，當(dāng)待檢樣本加到試紙條一端的樣本 墊上后，通過毛細(xì)作用向前移動(dòng)，溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記試劑后相互反應(yīng)，當(dāng)移動(dòng)至固 定的抗原或抗體的區(qū)域時(shí)，待檢物與金標(biāo)試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留， 聚集在檢測(cè)帶上，可通過肉眼觀察到顯色結(jié)果。該法現(xiàn)已發(fā)展成為診斷試紙條，使用十分方 便。
【附圖說明】
[00巧]圖1骨性關(guān)節(jié)炎組和對(duì)照組中MEDl化基因甲基化情況
[0026] 圖2骨性關(guān)節(jié)炎患者組內(nèi)MEDl化蛋白表達(dá)和基因甲基化相關(guān)性
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本 發(fā)明的限制。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可W理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可 W對(duì)運(yùn)些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限 定。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常