檢測植物花器官特異性dna甲基化修飾位點的方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測植物花器官特異性DNA甲基化修飾位點的方法及試劑盒。其中，包括以下步驟：S1，提取植物花器官基因組DNA；S2，對植物花器官基因組DNA進行酶切；S3，分別對酶切產(chǎn)物連接上限制性內(nèi)切酶的接頭；S4，以接頭為模板設計的預擴增引物進行PCR預擴增，得PCR預擴增產(chǎn)物；S5，將PCR預擴增產(chǎn)物稀釋后，加入帶有選擇性堿基的篩選引物進行PCR擴增；S6，電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，統(tǒng)計并分析DNA條帶，S7，回收、克隆S6中得到的DNA甲基化差異條帶并進行測序。采用本發(fā)明提供的接頭、預擴增引物和篩選引物，能夠穩(wěn)定、高效地檢測植物花器官特異性DNA甲基化修飾位點。
【專利說明】檢測植物花器官特異性DNA甲基化修飾位點的方法及試劑 合 Sl

【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學【技術(shù)領域】，具體而言，涉及一種檢測植物花器官特異性DNA 甲基化修飾位點的方法及試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] DNA甲基化在植物發(fā)育過程以及基因組防御環(huán)境因子脅迫等方面扮演重要的作用 (Leijak-Levanic et al. 2004; Ruiz-Garcia et al. 2005; Teyssier et al. 2008; Verhoeven et al. 2010)。在植物中，DNA甲基化通常發(fā)生在CpG或者CpNpG序列上，并且在DNA修復 的循環(huán)中可以維持不變(Wassenegger2000)。所有的植物發(fā)育過程都建立在精準的時空特 異表達和基因表達調(diào)控的基礎之上。越來越多的證據(jù)表明基因表達的時空特異性不僅由特 異的DNA序列(順式以及反式作用元件控制)調(diào)控，還由一些表觀修飾因子，其中最主要的就 是DNA甲基化（Chan et al. 2005)進行調(diào)控。
[0003] 目前，對基因組甲基化進行研究最常用的技術(shù)是甲基敏感擴增多態(tài)性技術(shù) (Methylation sensitive amplified polymorphism，MSAP)，該方法是利用識別 CpG 或者 CpNpG的兩種DNA甲基化敏感酶（Hpa II和Msp I )，對全基因組的DNA甲基化修飾位點進 行識別，再利用PCR對酶切片段進行擴增，結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示DNA甲基化修飾差 異片段。MSAP技術(shù)可以對全基因組DNA甲基化修飾位點進行檢測，具有高效、省時、準確以 及不依賴基因組已知信息的優(yōu)點。因此，該方法得到廣泛應用并迅速發(fā)展，在生命科學領域 具有廣泛的應用價值。
[0004] 由于MSAP技術(shù)需要利用兩種DNA甲基化敏感酶進行酶切反應，因此為得到在植物 不同組織通用的反應體系，需要針對酶、DNA模板、反應時間以及溫度進行優(yōu)化。但是傳統(tǒng) 的MSAP方法只能獲得DNA甲基化差異位點，無法獲得該位點的核苷酸序列，不利于后續(xù)研 究的開展。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在提供一種檢測植物花器官特異性DNA甲基化修飾位點的方法及試劑 盒，以解決傳統(tǒng)的MSAP方法在植物花器官中應用效果差以及無法獲得差異位點的核苷酸 序列的技術(shù)問題。
[0006] 為了實現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種檢測植物花器官特異性 DNA甲基化修飾位點的方法。該方法采用MSAP技術(shù)檢測DNA甲基化，包括以下步驟：S1，提 取植物花器官基因組DNA ;S2,分別用Msp I/EcoRI和Hpa II/EcoRI兩組酶對植物花器官基 因組DNA進行酶切；S3,分別對酶切產(chǎn)物連接上限制性內(nèi)切酶的接頭；S4,以接頭為模板設 計的預擴增引物進行PCR預擴增，得PCR預擴增產(chǎn)物；S5,將PCR預擴增產(chǎn)物稀釋后，加入 帶有選擇性堿基的篩選引物進行PCR擴增；S6,電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，統(tǒng)計并分析DNA條 帶，S7,回收、克隆S6中得到的DNA甲基化差異條帶并進行測序，其中，接頭包括EcoRI接頭 和 Hpall/MspI 接頭，EcoRI 接頭的序列為 SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2, Hpall/MspI 接頭 的序列為SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4 ;預擴增引物包括EcoRI預擴增引物和Hpall/MspI 預擴增引物，EcoRI預擴增引物的序列為SEQ ID NO :5, Hpall/MspI預擴增引物的序列為 SEQ ID NO :6 ;篩選引物包括EcoRI篩選引物和Hpall/MspI篩選引物，EcoRI篩選引物序列 為 SEQ ID NO :7 ?16, Hpall/MspI 篩選引物序列為 SEQ ID NO :17 ?27。
[0007] 進一步地，S2中的酶切體系為20 μ 1酶切體系，包括IOX擴增緩沖液2. O μ 1， DNA4. 0 μ 1，EcoRI/HpaII3U/3. 2U 或 EcoRI/MspI3U/4U，EcoRI 接頭 0· 5 μ 1，Hpall/MspI 接 頭 0· 5 μ 1，T4 連接酶 0· 5 μ 1，(IdH2OlL 85 μ 1。
[0008] 進一步地，S4中的預擴增體系為25 μ 1體系，包括稀釋100倍的酶切產(chǎn)物2. 5 μ 1， 濃度為10 μ mol/L的預擴增引物19. 5 μ 1，IOX擴增緩沖液2. 5 μ 1。
[0009] 進一步地，S4中的預擴增程序為94°C變性2min，94°C變性30s，56°C退火30s，72°C 延伸80s，30個循環(huán)，最后72°C延伸5min。
[0010] 進一步地，S5中的選擇擴增體系為20 μ 1擴增體系，包括PCR擴增混合液10 μ 1， 稀釋 100 倍的 PCR 預擴增產(chǎn)物 3 μ 1，Hpall/MspI 引物 1 μ 1，EcoRI 引物 1 μ 1，ddH205 μ 1， 其中，PCR擴增混合液包括ddH20155. 0 μ 1，IOX擴增緩沖液40. 0 μ 1，5U Taq DNA聚合酶 5 μ 1 〇
[0011] 進一步地，S5中的選擇擴增程序為94°C變性5min，94°C變性30s，65°C且每個循環(huán) 退火溫度降〇. 7°C退火30s，72°C延伸lmin，13個循環(huán)后；94°C變性30s，55°C退火30s，72°C 延伸80s，23個循環(huán)，72°C延伸5min。
[0012] 進一步地，篩選引物的組合分別為：SEQ ID NO :9+SEQ ID NO :21、SEQ ID NO : 9+SEQ ID N0：22,SEQ ID NO ：9+SEQ ID NO ： 24, SEQ ID N0：12+SEQ ID N0：17,SEQ ID NO： 12+SEQ ID NO ：18, SEQ ID NO ：12+SEQ ID NO ：23, SEQ ID NO ：12+SEQ ID NO ：26, SEQ ID N0：14+SEQ ID NO ：2USEQ ID NO ：14+SEQ ID NO ：23,SEQ ID NO ：9+SEQ ID NO ：24,SEQ ID N0：14+SEQ ID NO ：26,SEQ ID NO ：15+SEQ ID N0：17,SEQ ID N0：15+SEQ ID NO ： 19,SEQ ID NO ：15+SEQ ID NO ：2U SEQ ID NO ：15+SEQ ID NO ：23, SEQ ID NO ：15+SEQ ID NO ：26, SEQ ID N0：16+SEQ ID NO ： 17,SEQ ID NO ：16+SEQ ID N0：19,SEQ ID N0：16+SEQ ID NO ：2USEQ ID N0：16+SEQ ID N0：23,SEQ ID NO ：16+SEQ ID N0：24,SEQ ID N0：16+SEQ ID NO ：26〇
[0013] 進一步地，S6包括：利用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種檢測植物花器官特異性DNA甲基化修飾位點 的試劑盒。該試劑盒包括MSAP技術(shù)所用的接頭、預擴增引物和篩選引物序列，其中，接頭 包括EcoRI接頭和Hpall/MspI接頭，EcoRI接頭的序列為SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2， Hpall/MspI接頭的序列為SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4 ;預擴增引物包括EcoRI預擴增引 物和Hpall/MspI預擴增引物，EcoRI預擴增引物的序列為SEQ ID NO :5，HpaII/MspI預擴增 引物的序列為SEQ ID NO :6 ;篩選引物包括EcoRI篩選引物和Hpall/MspI篩選引物，EcoRI 篩選引物序列為SEQ ID NO :7?16, Hpall/MspI篩選引物序列為SEQ ID NO :17?27。
[0015] 進一步地，篩選引物的組合分別為：SEQ ID NO :9+SEQ ID NO :21、SEQ ID NO : 9+SEQ ID N0：22,SEQ ID NO ： 9+SEQ ID NO ： 24, SEQ ID N0：12+SEQ ID N0：17,SEQ ID NO： 12+SEQ ID NO ：18, SEQ ID NO ： 12+SEQ ID NO ：23, SEQ ID NO ： 12+SEQ ID NO ：26, SEQ ID N0：14+SEQ ID NO ：2USEQ ID NO ：14+SEQ ID NO ：23,SEQ ID NO ：9+SEQ ID NO ：24,SEQ ID N0：14+SEQ ID NO ：26,SEQ ID NO：15+SEQ ID NO ：17,SEQ ID NO ：15+SEQ ID NO：19,SEQ ID NO ：15+SEQ ID NO ：2U SEQ ID NO ：15+SEQ ID NO ：23, SEQ ID NO ：15+SEQ ID NO ：26, SEQ ID NO：16+SEQ ID NO：17,SEQ ID NO ：16+SEQ ID NO ： 19,SEQ ID NO ：16+SEQ ID NO ：2USEQ ID NO：16+SEQ ID NO：23,SEQ ID NO ：16+SEQ ID NO：24,SEQ ID NO ：16+SEQ ID NO ：26〇
[0016] 采用本發(fā)明提供的接頭、預擴增引物和篩選引物，能夠穩(wěn)定、高效地檢測植物花器 官特異性DNA甲基化修飾位點；另外，采用本發(fā)明的技術(shù)方案，還實現(xiàn)了植物花器官特異性 的DNA甲基化位點篩選以及候選基因獲得，為后續(xù)的基因表達調(diào)控分析以及表觀遺傳標記 開發(fā)提供了技術(shù)支持。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 構(gòu)成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，本發(fā)明的示 意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當限定。在附圖中：
[0018] 圖1示出了本發(fā)明實施例1中利用聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示DNA差異部分修飾 位點的示意圖，其中，H、M分別代表Η/E以及Μ/E引物組合的引物對，箭頭指示DNA甲基化 差異位點，A-G表示不同引物組合依次為（A:H/M-3+EcoR I-5、B:H/M-3+Eco R I-6、C:H/ M-3+EcoR I-8、D:H/M-6+EcoR I-l、E:H/M-6+EcoR I-2、F:H/M-6+EcoR I-7、G:H/M-6+EcoR 1-10)，f表示雌性花器官，4表示雄性花器官；以及在附圖E引物組合的黑色方框顯示該位 點雌花相對雄花具有全甲基化修飾，而G引物組合的黑色方框中的數(shù)據(jù)代表雄花相對雌花 具有全甲基化修飾。
[0019] 圖2示出了通過H/M-6+EcoR 1-2引物組合篩選出的差異DNA甲基化位點，經(jīng)回收 克隆得到的DNA差異位點核甘酸序列，在楊樹JGI數(shù)據(jù)庫比對后顯示出其在基因中的位置， 紅色代表通過雙酶切得到的差異條帶，黃色代表甲基化修飾的CCGG位點，綠色代表5'UTR， 粉色代表3' UTR，藍色代表基因的外顯子，無色部分代表內(nèi)含子。該圖顯示一個CCGG位點 上的甲基化修飾位于該基因的第一外顯子上。

【具體實施方式】
[0020] 需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相 互組合。下面將參考附圖并結(jié)合實施例來詳細說明本發(fā)明。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明一種典型的實施方式，提供一種檢測植物花器官特異性DNA甲基化修 飾位點的方法。該方法是采用MSAP技術(shù)檢測DNA甲基化，包括以下步驟：S1，提取植物花器 官基因組DNA ;S2,分別用Msp I/EcoRI和Hpa II/EcoRI兩組酶對植物花器官基因組DNA進 行酶切；S3,分別對酶切產(chǎn)物連接上限制性內(nèi)切酶的接頭；S4,以接頭為模板設計的預擴增 引物進行PCR預擴增，得PCR預擴增產(chǎn)物；S5，將PCR預擴增產(chǎn)物稀釋后，加入帶有選擇性堿 基的篩選引物進行PCR擴增；S6,電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，統(tǒng)計并分析DNA條帶，S7,回收、 克隆S6中得到的DNA甲基化差異條帶并進行測序，其中，其中，EcoRI接頭的序列為SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2, Hpall/MspI 接頭的序列為 SEQ ID NO :3 和 SEQ ID NO :4, EcoRI 預 擴增引物的序列為SEQ ID NO :5, Hpall/MspI預擴增引物的序列為SEQ ID NO :6, HpaII/ MspI篩選引物序列為SEQ ID NO :7?16, EcoRI篩選引物序列為SEQ ID NO : 17?27,如 表1中所示。
[0022] 表 I
[0023]

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測植物花器官特異性DNA甲基化修飾位點的方法，其特征在于，采用MSAP技 術(shù)檢測DNA甲基化，包括以下步驟： S1，提取植物花器官基因組DNA ; 52, 分別用Msp I/EcoRI和Hpa II/EcoRI兩組酶對所述植物花器官基因組DNA進行酶 切； 53, 分別對酶切產(chǎn)物連接上限制性內(nèi)切酶的接頭； 54, 以所述接頭為模板設計的預擴增引物進行PCR預擴增，得PCR預擴增產(chǎn)物； 55, 將所述PCR預擴增產(chǎn)物稀釋后，加入帶有選擇性堿基的篩選引物進行PCR擴增； 56, 電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，統(tǒng)計并分析DNA條帶， 57, 回收、克隆所述S6中得到的DNA甲基化差異條帶并進行測序， 所述接頭包括EcoRI接頭和Hpall/MspI接頭，所述EcoRI接頭的序列為SEQ ID NO : 1 和 SEQ ID N0:2,所述 Hpall/MspI 接頭的序列為 SEQ ID N0:3 和 SEQ ID N0:4;所述預 擴增引物包括EcoRI預擴增引物和Hpall/MspI預擴增引物，所述EcoRI預擴增引物的序列 為SEQ ID N0:5,所述Hpall/MspI預擴增引物的序列為SEQ ID N0:6;所述篩選引物包括 EcoRI篩選引物和Hpall/MspI篩選引物，所述EcoRI篩選引物序列為SEQ IDN0 :7?16,所 述Hpall/MspI篩選引物序列為SEQ ID NO :17?27。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述S2中采用的酶切體系為20 μ 1酶切 體系，包括 10Χ 擴增緩沖液2· 0μ 1，DNA4. 0μ l，EcoRI/HpaII3U/3. 2U或EcoRI/MspI3U/4U， EcoRI 接頭 0· 5 μ 1，Hpall/MspI 接頭 0· 5 μ 1，T4 連接酶 0· 5 μ 1，ddH2011· 85 μ 1。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述S4中的預擴增體系為25 μ 1體系，包 括稀釋100倍的所述酶切產(chǎn)物2. 5 μ 1，濃度為10 μ mol/L的所述預擴增引物19. 5 μ 1，10Χ 擴增緩沖液2. 5 μ 1。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述S4中的預擴增程序為94°C變性 211^11，941：變性3〇8,561：退火3〇8,721：延伸8〇8,30個循環(huán)，最后721：延伸51^11。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述S5中的選擇擴增體系為20 μ 1擴增 體系，包括PCR擴增混合液10 μ 1，稀釋100倍的所述PCR預擴增產(chǎn)物3 μ l，HpaII/MspI引 物1μ l，EcoRI引物1μ 1，(ΜΗ205 μ 1，其中，所述PCR擴增混合液包括ddH20155. 0 μ 1，10X 擴增緩沖液40. 0 μ 1，5U Taq DNA聚合酶5 μ 1。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述S5中的選擇擴增程序為94°C變性 5min，94°C變性30s，65°C且每個循環(huán)退火溫度降0. 7°C退火30s，72°C延伸lmin，13個循環(huán) 后；94°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 80s，23 個循環(huán)，72°C延伸 5min。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述篩選引物的組合分別為：SEQ ID NO: 9+SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :9+SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :9+SEQ ID NO :24、SEQ ID NO : 12+SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :12+SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :12+SEQ ID NO :23、SEQ ID N0：12+SEQ ID NO ：26,SEQ ID NO ：14+SEQ ID NO ：2USEQ ID NO ：14+SEQ ID NO ：23,SEQ ID NO ：9+SEQ ID NO ：24,SEQ ID NO ：14+SEQ ID NO ：26,SEQ ID N0：15+SEQ ID N0：17,SEQ ID NO ：15+SEQ ID NO ：19, SEQ ID NO ：15+SEQ ID NO ：2U SEQ ID NO ：15+SEQ ID NO ：23, SEQ ID NO ：15+SEQ ID NO ：26, SEQ ID NO ：16+SEQ ID NO ：17, SEQ ID NO ：16+SEQ ID NO ：19, SEQ ID NO ：16+SEQ ID NO ：2U SEQ ID NO ：16+SEQ ID NO ：23, SEQ ID NO ：16+SEQ ID NO ： 24.SEQ ID N0：16+SEQ ID NO ：26〇
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述S6包括：利用聚丙烯酰胺凝膠電泳 檢測所述PCR擴增產(chǎn)物。
9. 一種檢測植物花器官特異性DNA甲基化修飾位點的試劑盒，其特征在于，包括MSAP 技術(shù)所用的接頭、預擴增引物和篩選引物序列，其中，所述接頭包括EcoRI接頭和Hpall/ MspI接頭，所述EcoRI接頭的序列為SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2,所述Hpall/MspI接頭 的序列為SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4 ;所述預擴增引物包括EcoRI預擴增引物和Hpall/ MspI預擴增引物，所述EcoRI預擴增引物的序列為SEQ ID NO :5,所述Hpall/MspI預擴增 引物的序列為SEQ ID NO :6 ;所述篩選引物包括EcoRI篩選引物和Hpall/MspI篩選引物， 所述EcoRI篩選引物序列為SEQ ID NO :7?16,所述Hpall/MspI篩選引物序列為SEQ ID NO :17 ?27。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述篩選引物的組合分別為：SEQ ID NO :9+SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :9+SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :9+SEQ ID NO :24、SEQ ID N0：12+SEQ ID NO ： 17,SEQ ID N0：12+SEQ ID N0：18,SEQ ID NO ：12+SEQ ID NO ：23,SEQ ID NO ：12+SEQ ID NO ：26, SEQ ID NO ：14+SEQ ID NO ：2U SEQ ID NO ：14+SEQ ID NO ：23, SEQ ID N0：9+SEQ ID NO ：24,SEQ ID NO ：14+SEQ ID NO ：26,SEQ ID N0：15+SEQ ID NO ：17,SEQ ID N0：15+SEQ ID N0：19,SEQ ID N0：15+SEQ ID NO ：2USEQ ID NO ：15+SEQ ID NO ：23,SEQ ID N0：15+SEQ ID NO ：26, SEQ ID NO ：16+SEQ ID N0：17, SEQ ID NO ：16+SEQ ID NO ：19, SEQ ID NO ：16+SEQ ID NO ：2U SEQ ID NO ：16+SEQ ID NO ：23, SEQ ID NO ：16+SEQ ID NO ： 24,SEQ ID N0：16+SEQ ID NO ：26〇
【文檔編號】C12Q1/68GK104293890SQ201310298633
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月16日
【發(fā)明者】張德強, 宋躍朋, 馬開峰 申請人:北京林業(yè)大學