本發(fā)明涉及醫(yī)藥領域，特別是一種從北葶藶子中提取北葶新堿a化合物的方法及其應用。

背景技術：

葶藶子始載于《神農本草經》，列為草部下品，為常用中藥材。2015版《中國藥典》收錄的“葶藶子”有南北之分，其中十字花科植物獨行菜lepidiumapetalumwilld.的干燥成熟種子習稱“北葶藶子”，而播娘蒿descurainiasophia(l.)webbexprantl.的干燥成熟種子習稱“南葶藶子”。該藥味辛、苦，性大寒，歸肺與膀胱經，具有宣泄平喘、行水消腫的功效。南葶藶子研究較多，其化學成分主要有黃酮類、硫苷類、異硫氰酸類等，而北葶藶子研究較少。據記載，北葶藶子具有強心作用，其化學成分主要是黃酮類。而從葶藶子的水提物中分離尿苷類衍生物以及研究其應用至今還未見有這方面的相關報道。

植物雌激素是來源于植物，與哺乳動物的類固醇激素—17β-雌二醇有相似結構的多羥基化合物。天然的植物雌激素相比于合成的雌激素，其雌激素樣活性要低，但是所引起的乳腺癌、子宮內膜癌等副作用也更少，使用會更安全。因此對含有植物雌激素的研究逐漸成為熱點。而從北葶藶子中提取北葶新堿a的雌激素樣作用的研究也未見報道。

技術實現(xiàn)要素：

針對上述情況，為解決現(xiàn)有技術之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種從北葶藶子中提取北葶新堿a化合物的方法及其應用，可有效挖掘北葶藶子的新作用。

本發(fā)明解決的技術方案是，從北葶藶子中提取北葶新堿a化合物的方法：北葶藶子采用清炒法，炒至溫度為240℃，炒制5.5min，取炒制(炮制)后的北葶藶子，每次加北葶藶子10倍重量的水煎煮提取三次，每次1.5h，提取液減壓濃縮至浸膏狀(每1g相當于原藥材2～5g)，濃縮的浸膏用北葶藶子2-3倍重量的體積濃度為80％的乙醇醇沉，將上清液離心過濾，濃縮至無醇味，上dianionhp-20柱(高多孔性苯乙烯的吸附/脫附樹脂)，依次用水、體積濃度20％、40％乙醇梯度洗脫，收集40％乙醇洗脫液，得40％乙醇洗脫部位a，40％乙醇洗脫部位a用水離散溶解，離心過濾，濃縮至原體積的28-29分之一，通過toyopearlhw-40柱色譜，用水洗脫，流速6ml/min，用試管(規(guī)格10×180mm)接取流份，每管15ml，茴香醛-濃硫酸噴霧檢識，合并第25-44管的流份，標為組分b3，組分b3用半制備hplc(高效液相色譜)分離，上ymc-packods-aq色譜柱(規(guī)格型號：250×10mm,粒徑5μm,孔徑12nm)，流動相為乙腈：水(v/v)＝7:93，流速5ml/min，收集保留時間tr＝10～16min之間的流份標為組分c1，組分c1再用半制備hplc分離純化，上ymc-packods-aq色譜柱(規(guī)格型號：250×10mm,粒徑5μm,孔徑12nm)，流動相為甲醇：水(v/v)＝10:90，流速5ml/min，收集保留時間tr＝31.3min的流份，濃縮干燥，得到化合物北葶新堿a。

本發(fā)明從北葶藶子中提取北葶新堿a化合物具有雌激素樣作用，為制備雌激素類藥物提供了新的途徑。

附圖說明

圖1為本發(fā)明北葶新堿a的¹h-nmr譜(cd3od)。

圖2為本發(fā)明北葶新堿a的¹³c-nmr譜(incd3od)。

圖3為本發(fā)明北葶新堿a的dept135譜(incd3od)。

圖4為本發(fā)明北葶新堿a的¹h-¹hcosy譜。

圖5為本發(fā)明北葶新堿a的hsqc譜。

圖6為本發(fā)明北葶新堿a的hmbc譜。

圖7為本發(fā)明北葶新堿a的noesy譜。

圖8為本發(fā)明北葶新堿a的hr-esi-ms譜。

圖9為本發(fā)明北葶新堿a的ir譜。

圖10為本發(fā)明北葶新堿a的uv譜。

具體實施方式

以下結合附圖和實施例對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細說明。

實施例1

取北葶藶子10kg，采用清炒法，炒至溫度為240℃，炒制5.5min，取炒制后的北葶藶子，每次加北葶藶子10倍重量的水煎煮提取三次，每次1.5h，提取液減壓濃縮至浸膏狀，濃縮的浸膏用20l體積濃度為80％的乙醇醇沉，將上清液離心過濾，濃縮至無醇味，上dianionhp-20柱，依次用水、體積濃度20％、40％乙醇梯度洗脫，收集40％乙醇洗脫液，得40％乙醇洗脫部位a，40％乙醇洗脫部位a用水離散溶解，離心過濾，濃縮至原體積的28-29分之一，通過toyopearlhw-40柱色譜，用水洗脫，流速6ml/min，用規(guī)格10×180mm的試管接取流份，每管15ml，茴香醛-濃硫酸噴霧檢識，合并第25-44管的流份，標為組分b3，組分b3用半制備hplc分離，上規(guī)格型號為：250×10mm,粒徑5μm,孔徑12nm的ymc-packods-aq色譜柱，流動相為乙腈：水＝7:93，流速5ml/min，收集保留時間tr＝10～16min之間的流份標為組分c1，組分c1再用半制備hplc分離純化，上規(guī)格型號為：250×10mm,粒徑5μm,孔徑12nm的ymc-packods-aq色譜柱，流動相為甲醇：水＝10:90，流速5ml/min，收集保留時間tr＝31.3min的流份，濃縮干燥，得到化合物北葶新堿a。

實施例2

取北葶藶子5kg，采用清炒法，炒至溫度為240℃，炒制5.5min，取炒制后的北葶藶子，每次加北葶藶子10倍重量的水煎煮提取三次，每次1.5h，提取液減壓濃縮至浸膏狀，濃縮的浸膏用14l體積濃度為80％的乙醇醇沉，將上清液離心過濾，濃縮至無醇味，上dianionhp-20柱，依次用水、體積濃度20％、40％乙醇梯度洗脫，收集40％乙醇洗脫液，得40％乙醇洗脫部位a，40％乙醇洗脫部位a用水離散溶解，離心過濾，濃縮至原體積的28-29分之一，通過toyopearlhw-40柱色譜，用水洗脫，流速6ml/min，用規(guī)格10×180mm的試管接取流份，每管15ml，茴香醛-濃硫酸噴霧檢識，合并第25-44管的流份，標為組分b3，組分b3用半制備hplc分離，上規(guī)格型號為：250×10mm,粒徑5μm,孔徑12nm的ymc-packods-aq色譜柱，流動相為乙腈：水＝7:93，流速5ml/min，收集保留時間tr＝10～16min之間的流份標為組分c1，組分c1再用半制備hplc分離純化，上規(guī)格型號為：250×10mm,粒徑5μm,孔徑12nm的ymc-packods-aq色譜柱，流動相為甲醇：水＝10:90，流速5ml/min，收集保留時間tr＝31.3min的流份，濃縮干燥，得到化合物北葶新堿a。

本發(fā)明從北葶藶子水提物中分離得到尿苷類衍生物尿苷-3′-o-β-d-吡喃葡萄糖苷(uridine-3′-o-β-d-glucopyranoside)，命名為北葶新堿a，是一個新的天然產物，含量較高。且北葶新堿a在體內、體外均有一定的雌激素樣作用，且是通過雌激素受體途徑發(fā)揮作用的。并經試驗進行了充分證明，相關試驗資料如下：

1儀器與試藥

核磁共振用brukeravanceⅲ500核磁共振儀(tms內標)(bruker)，紅外光譜用nicoletis10microscopespectrometer(thermoscientific,usa)，高分辨質譜用brukermaxishdmassspectrometer，紫外光譜用shimadzuuv-2401pcapparatus，高效液相色譜用watersalliance系列2695高效液相系統(tǒng)，配備2998型二極管陣列檢測器，empower3色譜數(shù)據工作站，lc50型高壓制備液相色譜儀，uv200型紫外檢測器[賽譜銳思(北京)科技有限公司]，ymc-packods-aq色譜柱(250×10mm.d.s-5mm,12mm)(ymc有限公司)，其余有n-1100型旋轉蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)，a-1000s型水流抽氣機(上海愛朗儀器有限公司)，n-1111型冷凍水循環(huán)裝置(上海愛朗儀器有限公司)，fdu-2110型冷凍干燥機(上海愛朗儀器有限公司)，dfz-60508型真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)，ab204-n萬分之一精密分析天平(mettlertoledo)，imark型酶標儀(美國bio-rad)，二氧化碳培養(yǎng)箱(上海stik)，超凈工作臺(蘇凈集團)，arium611vf超級組合型超純水器(sartorius)，倒置顯微鏡(nikon)，pb-10酸度計(德國賽多利斯集團)。

柱層析填料diaionhp-20、mcigelchp-20(日本三菱化學公司)，toyopearlhw-40(日本tosoh公司)，sephadexlh-20(parmaciabiotech公司)，柱層析所用硅膠h(160-200目)為青島海洋化工廠生產，培養(yǎng)皿、96孔培養(yǎng)板、細胞凍存管(corning公司)，所用色譜純試劑位天津四友精細化學品有限公司生產，所用分析純試劑為北京化工廠和天津第三化學試劑廠生產。

dmem高糖培養(yǎng)液(gibco)，胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，胰蛋白酶(gibco)，dmso(solarbio)；mtt(biosharp)，h2o2溶液(天津市恒興化學試劑制造有限公司)，水為超純水，pbs緩沖液等為自配。

北葶藶子于2014年采自河南南陽，經河南中醫(yī)學院陳隨清教授及董誠明教授鑒定為十字花科植物獨行菜lepidiumapetalumwilld.的干燥成熟種子。

3結構鑒定

北葶新堿a，無色結晶性粉末(meoh)，分子式為c15h22n2o11[m+na]⁺m/z429.1106(計算值為429.1121)。利用核磁共振波譜對其進行結構鑒定，圖譜見附圖1-10。其結構式及核磁數(shù)據如下：

圖1北葶新堿a的結構

表1北葶新堿a的¹hnmr(500mhz)和¹³cnmr(125mhz)數(shù)據(incd3od)

4.1小鼠子宮增重實驗

將小鼠按體重均衡和隨機的原則分組，持續(xù)給藥7天。正常組每日蒸餾水0.02ml/g灌胃；陽性對照組隔日灌胃戊酸雌二醇(0.33mg/kg/d)灌胃；北葶藶子中提取北葶新堿a按1mg/10g/d，配成混懸液，每日按0.02ml/g灌胃。最后一次給藥24h后，摘眼球取血，脫頸椎處死小鼠，立即摘取子宮稱重，計算子宮系數(shù)[子宮濕重×(體重)^-1×100％]。實驗平行重復三次。結果與正常組相比，計算p值，考察有無統(tǒng)計學意義。

4.2mcf--7細胞增殖實驗

mcf-7細胞經含5％去雌激素胎牛血清的無酚紅dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)1周后，選取對數(shù)生長期細胞，pbs洗兩次，用0.05％胰蛋白酶消化后，加入無酚紅dmem培養(yǎng)基吹打均勻，以2×10⁴個/ml的濃度接種于96孔板內，每孔培養(yǎng)總體積為200μl。培養(yǎng)24h待細胞貼壁后，換為含北葶藶子中提取北葶新堿a培養(yǎng)液(10μm)繼續(xù)培養(yǎng)。37℃、5％co2培養(yǎng)48h后，每孔加入mtt溶液(5mg/ml)20μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸凈培養(yǎng)液，每孔加入150μldmso，震蕩5-10min，使紫色結晶完全溶解。用酶標儀在490nm下測定各孔吸光度值(a)，計算平均a值和細胞活力。實驗平行重復三次。

細胞活力＝各組od值/正常組od值

4.3ici182,780拮抗實驗

mcf-7細胞經含5％去雌激素胎牛血清的無酚紅dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)1周后，選取對數(shù)生長期細胞，以2×10⁴個·ml^-1的濃度接種于96孔板內，每孔培養(yǎng)總體積為200μl。細胞貼壁后，加藥干預，其中拮抗組在給藥前2h加雌激素受體阻斷劑ici182,780(1μm)。37℃、5％co2培養(yǎng)48h后，每孔加入mtt溶液(5mg/ml)20μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸凈培養(yǎng)液，每孔加入150μldmso，震蕩5-10min，使紫色結晶完全溶解。用酶標儀在490nm下測定各孔吸光度值(a)，計算平均a值和細胞活力。實驗平行重復三次。

細胞活力＝各組od值/正常組od值

4.4elisa法檢測血清e2、lh、fsh

小鼠摘眼球取血，血液室溫靜置1h后，3000轉離心10min，取上清。按照elisa試劑盒說明書仔細操作。

5統(tǒng)計處理

實驗數(shù)據以表示，用spss20.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據，采用單因素方差分析(one-wayanova)進行組間差異的比較，以p<0.05為差異有顯著性意義，以p<0.01為差異有極顯著性意義。

6實驗結果

6.1北葶藶子中提取北葶新堿a對性未成熟雌性小鼠子宮系數(shù)的影響

與正常組相比，北葶藶子中提取北葶新堿a能顯著誘導性未成熟雌性小鼠子宮系數(shù)的增加(p<0.05)。提示北葶藶子中提取北葶新堿a在體內具有雌激素樣作用。見表1。

表1北葶藶子中提取北葶新堿a對性未成熟雌性小鼠子宮系數(shù)的影響(n＝10)

注:與正常組比較，*表示p<0.05，**表示p<0.01。

6.2北葶藶子中提取北葶新堿a對mcf--7細胞促增殖作用

北葶藶子中提取北葶新堿a在10μm時與正常組比，對mcf-7細胞有顯著的促增殖作用(p<0.05)。提示北葶藶子中提取北葶新堿a在體外具有雌激素樣作用。見表2。

表2北葶藶子中提取北葶新堿a對mcf-7細胞增殖的影響(n＝6)

注:與正常組比較，*表示p<0.05，**表示p<0.01。

6.3ici182,780對北葶藶子北葶新堿a促mcf--7細胞增殖的影響

北葶藶子北葶新堿a能顯著促進mcf-7細胞的增殖(p<0.05)；但當與雌激素受體阻斷劑ici182,780共同干預時，北葶新堿a的促增殖作用消失，與正常組相比無統(tǒng)計學意義。提示北葶藶子北葶新堿a對mcf-7細胞的促增殖作用是通過雌激素受體介導發(fā)揮的，見表3。

表3ici182,780對北葶新堿a促mcf-7細胞增殖的影響(n＝6)

注:與正常組比較，*表示p<0.05，**表示p<0.01。

6.4北葶藶子中提取北葶新堿a對血清e2、lh、fsh的影響

與正常組相比，北葶藶子中提取北葶新堿a能顯著增加小鼠血清e2、fsh的水平，但基本不影響血清lh的水平(p<0.05)。提示北葶藶子中提取北葶新堿a在體內具有雌激素樣作用，可能與其增加體內e2以及fsh的水平有關。見表4。

表4北葶藶子中提取北葶新堿a對血清e2、lh、fsh的影響(n＝10)

注:與正常組比較，*表示p<0.05，**表示p<0.01。

子宮中含有大量的雌激素受體(ers)，雌激素類物質通過與該受體結合，可誘導子宮靶蛋白(ips)含量增加，表現(xiàn)為子宮組織增生等，因此可以通過測定外源雌激素對性未成熟小鼠子宮促增長作用來評價藥物的雌激素樣活性。本實驗采用性未成熟雌性小鼠子宮濕重與體重之比(子宮系數(shù))作為評價雌激素樣活性的指標。實驗結果表明，北葶新堿a可顯著增加性未成熟小鼠子宮系數(shù)，提示其在體內具有雌激素樣作用。

mcf-7細胞是雌激素受體陽性的人乳腺癌細胞株，能特異地受雌激素或雌激素樣活性物質調節(jié)而增殖，是最常用的檢測雌激素樣活性的細胞株。實驗結果發(fā)現(xiàn)，北葶新堿a在濃度為10μm時對mcf-7細胞有顯著的促增殖作用。ici182,780是一類新型的純雌激素受體拮抗劑，可以顯著地減弱或抑制由配體與雌激素受體結合所激發(fā)的、并受雌激素應答元件(ere)調控的雌激素信號轉導途徑。當北葶新堿a與ici182,780共同作用時，其對mcf-7細胞的促增殖作用被顯著抑制。提示北葶新堿a在體內、體外均有一定的雌激素樣作用，且是通過雌激素受體途徑發(fā)揮作用的。

雌二醇是體內主要由卵巢成熟濾泡分泌的一種天然雌激素，能促進和調節(jié)女性性器官及副性征的正常發(fā)育。促黃體生成素由垂體產生的一種激素在在女性中刺激卵巢分泌女性雌激素。卵泡刺激素是垂體前葉嗜堿性細胞分泌的一種激素，主要作用為促進卵泡成熟，促進整個卵巢長大。研究發(fā)現(xiàn)，北葶藶子中北葶新堿a可以顯著性增加未成熟雌性小鼠的血清e2以及fsh的水平，但對lh的影響不大。推測北葶藶子中提取北葶新堿a增加小鼠子宮系數(shù)發(fā)揮雌激素樣活性可能與其增加體內e2以及fsh的水平有關。

綜上，從北葶藶子的水提物中分離并鑒定的北葶新堿a，實驗結果顯示北葶新堿a在體內、體外均有一定的雌激素樣作用，且是通過雌激素受體途徑發(fā)揮作用的，可有效用于制備雌激素類藥物，開發(fā)了北葶藶子的新用途，具有實際的臨床意義和良好的應用推廣價值。