本發(fā)明涉及材料分析化學(xué)和有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種磷酸化肽富集材料及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)的磷酸化是生物體內(nèi)最常見、最重要的蛋白翻譯后修飾方式之一，因此磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究引起了眾多世界科學(xué)家的廣泛關(guān)注。但是由于磷酸化蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)絕對含量很低，目前，進(jìn)行磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)策略主要是在蛋白質(zhì)或肽段水平上富集之后進(jìn)行。已有的磷酸肽富集方法主要有：固定金屬離子親和色譜法，金屬氧化物法，離子交換色譜法，以及上述幾種技術(shù)的聯(lián)用。但是這些方法存在多磷酸化肽難以洗脫、非特異性吸附酸性肽鏈或者帶堿性殘基磷酸化肽難以保留的問題，因此無法實(shí)現(xiàn)復(fù)雜生物樣品大規(guī)模富集磷酸化肽的目的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了解決上述技術(shù)問題提供一種對磷酸化肽具有顯著識別能力的磷酸化肽富集材料及其制備方法與應(yīng)用。該材料提供了一種具有高選擇性、高吸附量、操作簡單和重復(fù)性好的磷酸化肽的分離富集方法，能對生物樣品中相對低含量的單磷酸化肽和多磷酸化肽進(jìn)行選擇性富集和分離。

本發(fā)明采用如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

一種雙組分共聚物，所述雙組份共聚物具有如下所示的分子結(jié)構(gòu)：

其中R為羧基、硝基、甲基、甲酸乙酯基或氫；X＝0.01-0.5。

上述方案中，包括基底及形成于基底表面的雙組分共聚物層，所述雙組分共聚物的分子結(jié)構(gòu)如權(quán)利要求1所述，所述雙組分共聚物層的厚度為10-80nm。

上述方案中，所述基底的材料為Si、Cu、Ag、Au、Pt、CuO、Fe₃O₄、多孔SiO₂、多孔Al₂O₃、多孔TiO₂或多孔ZrO₂中的任意一種或者兩種以上任意比例的混合。

所述的磷酸化肽富集材料的制備方法，該制備方法是利用表面引發(fā)-原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)機(jī)制，將雙組分共聚物接枝到基底表面，具體制備方法如下：

1)在反應(yīng)容器中依次加入異丙基丙烯酰胺和硫脲功能單體，同時加入超純水及二甲基甲酰胺的混合溶液作溶劑，其中，異丙基丙烯酰胺和硫脲功能單體的摩爾比1-20:1，超純水與二甲基甲酰胺的體積比為1:1-10；

2)在無氧條件下加入催化劑和配體，將基底浸入前述溶液中，保持氮?dú)鈿夥?，在恒?0-80℃條件下進(jìn)行原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)4-24小時；

3)反應(yīng)結(jié)束后，洗滌基底表面并在30-80℃下真空干燥，得到所述磷酸化肽富集材料。

所述的磷酸化肽富集材料在磷酸化肽富集分離中的應(yīng)用方法，采用柱固相萃取模式，具體步驟如下：

1)將磷酸化肽富集材料裝入移液槍槍頭或者凝膠上樣吸頭中，形成微固相萃取柱，采用活化液和平衡液活化及平衡微固相萃取柱，將蛋白酶解物溶解于平衡液中，并上到微固相萃取柱上，磷酸化肽富集材料與蛋白酶解物的質(zhì)量比為100:1-1000:1；

2)采用5-200倍柱體積pH 0-7的有機(jī)溶液沖洗萃取柱；

3)采用5-100倍柱體積pH 3-7的有機(jī)溶液洗脫得單磷酸化肽；

4)采用5-100倍柱體積pH 0-3的有機(jī)溶液洗脫得多磷酸化肽，上述整個過程在10-60℃進(jìn)行。

所述的磷酸化肽富集材料在磷酸化肽富集分離中的應(yīng)用方法，采用分散固相萃取模式，具體步驟如下：

1)先采用活化液活化磷酸化肽富集材料，將該磷酸化肽富集材料與蛋白酶解物以質(zhì)量比為100:1-1000:1混合，孵化0.5分鐘-12小時，過濾或者分散固相萃取分離，棄上層清液，收集沉淀；

2)采用pH＝0-7的有機(jī)溶液對沉淀清洗；

3)將清洗后的沉淀采用pH 3-7有機(jī)溶液洗滌，過濾或者分散固相萃取分離，收集上層清液；濃縮得到單磷酸化肽；

4)將清洗后的沉淀采用體積pH 0-3有機(jī)溶液洗滌，過濾或者分散固相萃取分離，收集上層清液，得多磷酸化肽，上述整個過程在10-60℃進(jìn)行。

上述方案中，所述有機(jī)溶液、活化液和平衡液均為有機(jī)溶劑、有機(jī)酸和水的混合液，有機(jī)溶劑為乙腈、甲醇或乙醇，有機(jī)酸為甲酸、乙酸或三氟乙酸，有機(jī)溶劑的體積濃度為10％-95％，有機(jī)酸的體積濃度為0.1-5％。

上述方案中，所述有機(jī)溶液、活化液和平衡液均為有機(jī)溶劑、有機(jī)酸和水的混合液，有機(jī)溶劑為乙腈、甲醇或乙醇，有機(jī)酸為甲酸、乙酸或三氟乙酸，有機(jī)溶劑的體積濃度為10％-95％，有機(jī)酸的體積濃度為0.1-5％。

上述方案中，所述活化液中有機(jī)溶劑體積濃度為10-50％，pH＝0-7。

上述方案中，所述平衡液中有機(jī)溶劑體積濃度為50-95％，pH＝0-7。

本發(fā)明的有益效果為：

1、本發(fā)明制備的磷酸化肽富集材料在分離富集磷酸化肽時表現(xiàn)出了高選擇性和高通量等特點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)多磷酸化肽和單磷酸化肽的有效分離和富集；

2、本發(fā)明制備的磷酸化肽富集材料既可以方便的裝填成不同長度，不同內(nèi)徑的柱子，又可以直接添加于離心管，操作簡單，易于重復(fù)。特別適合微量生物樣品中磷酸化肽段的分離富集；

3、本發(fā)明富集得到的磷酸化肽可直接用于電噴霧-質(zhì)譜分析(ESI-MS)或者基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)，提高了質(zhì)譜的檢測限和靈敏度。

本發(fā)明開發(fā)了一系列基于硫脲的多氫鍵受體，并通過表面引發(fā)-原子轉(zhuǎn)移自由基聚合的方法分別將它們與溫敏性功能單體接枝到各種材料上，得到了厚度十到幾十納米不等的智能響應(yīng)性聚合物表面。將聚合物修飾的多孔材料與柱固相萃取模式或分散固相萃取模式有機(jī)的結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜混合物中磷酸化肽高選擇性、高重復(fù)性和高通量地富集，從而實(shí)現(xiàn)多磷酸化肽和單磷酸化肽的選擇性富集，可顯著提高磷酸化蛋白鑒定數(shù)目。因此，其有望在磷酸化肽富集，進(jìn)而大規(guī)模分離磷酸化蛋白等方面獲得廣泛的應(yīng)用。

附圖說明

圖1為雙組分共聚物分子結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為雙組分共聚物接枝到硅膠樣品的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖3為硫脲單體合成步驟示意圖。

圖4為雙組分共聚物表面(以硫脲單體末端R為羧基為例)對不同肽鏈的石英微天平(QCM)吸附曲線。

圖5為富集應(yīng)用實(shí)例中使用的固定相結(jié)構(gòu)示意圖。

圖6為采用SPE模式經(jīng)磷酸化肽富集材料富集后，α-酪蛋白酶解產(chǎn)物中的單磷酸化肽質(zhì)譜信號示意圖。

圖7為采用SPE模式經(jīng)磷酸化肽富集材料富集后，α-酪蛋白酶解產(chǎn)物中的多磷酸化肽質(zhì)譜信號示意圖。

圖8為采用SPE模式經(jīng)氧化鈦材料富集后，α-酪蛋白酶解產(chǎn)物中磷酸化肽質(zhì)譜信號示意圖。

圖9為采用離心模式，經(jīng)磷酸化肽富集材料富集后α-酪蛋白酶解產(chǎn)物中的非磷酸化肽質(zhì)譜信號示意圖。

圖10為采用離心模式，經(jīng)磷酸化肽富集材料富集后α-酪蛋白酶解產(chǎn)物中的單磷酸化肽質(zhì)譜信號示意圖。

圖11為采用離心模式，經(jīng)磷酸化肽富集材料富集后α-酪蛋白酶解產(chǎn)物中的多磷酸化肽質(zhì)譜信號示意圖。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的內(nèi)容、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合具體實(shí)施例和附圖進(jìn)一步闡述本發(fā)明，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而本發(fā)明不僅限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例中所用原料及設(shè)備:

HPLC柱色譜填料硅膠(氨基修飾)由上海月旭公司購得。溴化亞銅(CuBr，99.999％)，聯(lián)吡啶類配體，有機(jī)堿，異丙基丙烯酰胺，丙烯酰氯，對氨基苯甲酸乙酯由Sigma-Aldrich公司購得。丙酮，甲醇，二甲基甲酰胺(DMF)，氫氧化鈉由阿爾法公司購得。各種測試用的肽鏈由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司購得。異丙基丙烯酰胺在使用前用正己烷重結(jié)晶三次，放置在真空干燥器中備用。其他試劑均使用市售分析純。¹H spectra在Bruker ARX300spectrometer檢測獲得。石英微天平(QCM)吸附數(shù)據(jù)由Q-Sense E4system檢測獲得。質(zhì)譜分析結(jié)果由MALD-TOF MS獲得。

實(shí)施例1

磷酸化肽富集材料的制備

雙組份聚合物結(jié)構(gòu)如圖1所示，其中X＝0.01-0.5。以X＝0.2為例，在25ml三口燒瓶中依次加入0.4mmol異丙基丙烯酰胺，0.1mmol的硫脲功能單體，物質(zhì)摩爾比為4:1，同時加入6mL超純水以及6mL DMF作溶劑；在攪拌下通入氮?dú)?，待單體充分溶解之后，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入催化劑CuBr 0.032g以及聯(lián)吡啶類配體0.16mL，隨后反應(yīng)體系抽真空—充氮?dú)?，除去反?yīng)體系中殘余的氧氣；將溴化處理過的基底浸入配置好的反應(yīng)溶液；將燒瓶的溫度控制在60-80℃靜置反應(yīng)4-24小時；反應(yīng)結(jié)束后用N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)和去離子水(H₂O)依次洗滌聚合物接枝表面，得到磷酸化肽富集材料，此磷酸化肽富集材料表面雙組分共聚物膜的厚度為10-80nm，氮?dú)獯蹈杀砻婧笾糜谡婵崭稍锲髦袀溆谩?/p>

本發(fā)明中，基底材料為Si、Cu、Ag、Au、Pt、CuO、Fe₃O₄、多孔SiO₂、多孔Al₂O₃、多孔TiO₂或多孔ZrO₂中的任意一種或者兩種以上任意比例的混合。在本實(shí)施例中，選用的基底材料為硅膠。圖2為雙組分共聚物接枝的硅膠樣品的結(jié)構(gòu)示意圖。

實(shí)施例2

功能單體的結(jié)構(gòu)與合成方法

為制備上述的雙組分共聚物，需要合成一系列硫脲功能單體，它們具體實(shí)施的合成方法類似，合成步驟如圖3所示。

以合成末端基R為羧基的硫脲單體為例，在室溫環(huán)境中，將0.582g(6mmol)溶解在30～50mL無水丙酮中,攪拌條件下，將0.453g(5mmol)丙烯酰氯逐滴滴加至上述溶液中，繼續(xù)反應(yīng)12小時。反應(yīng)結(jié)束后離心(4500r/min,5min)，取上清液備用。在室溫條件下，將0.685g(6mmol)對氨基苯甲酸溶解在30mL無水丙酮中，加2～4mL超純水，攪拌條件下將備用清液逐滴滴加至上述溶液中，繼續(xù)反應(yīng)12小時。反應(yīng)結(jié)束后旋蒸除去溶劑，得黃色油狀物。該粗產(chǎn)物用30mL無水丙酮清洗-過濾，重復(fù)三遍得到1.02g淡黃色固體目標(biāo)產(chǎn)物，產(chǎn)率約為80％。產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)通過核磁氫譜、核磁碳譜和質(zhì)譜進(jìn)行了表征鑒定。產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)通過核磁氫譜、核磁碳譜和質(zhì)譜進(jìn)行了表征鑒定。其余含不同末端R端基的硫脲單體參照此方法合成。

R端基為羧基的硫脲單體表征數(shù)據(jù)：¹H NMR(300MHz,DMSO):5.99-6.03(d,1H,＝CH),6.42-6.66(m,2H,＝CH),7.82-7.96(m,4H,Ph-H),11.73(s,1H,CNHCS),12.77(s,1H,CNHCS),12.91(br,1H,COOH)；¹³C NMR(300MHz,d6-DMSO):δ(ppm):126.5,128.7,131.4,135.4,136.0,147.0,157.6,167.2,172.4,176.0；MADLI-MS:m/z calcd for C₁₁H₁₀N₂O₃S:250.04；found:250.68；FT-IR:σ(cm^-1):875,978,1165,1252,1410,1570,1599,1673,2851,2972,3183；T_m:161.5℃。

R端基為硝基的硫脲單體表征數(shù)據(jù)：¹H NMR(300MHz,DMSO):5.70-5.78(m,1H,＝CH),6.22-6.43(m,2H,＝CH),7.62-7.86(m,4H,Ph-H),11.52(s,1H,CNHCS),12.43(s,1H,CNHCS)；¹³C NMR(300MHz,d6-DMSO):δ(ppm):126.7,128.5,135.3,136.2,138.1,147.6,159.9,170.5；MADLI-MS:m/z calcd for C₁₀H₉N₃O₃S:251.26；found:252.05；FT-IR:σ(cm^-1):878,984,1300,1437,1570,1589,1601,1672,2977,3151；T_m:168.4℃。

R端基為甲基的硫脲單體表征數(shù)據(jù)：¹H NMR(300MHz,DMSO):5.99-6.03(d,1H,＝CH),6.42-6.66(m,2H,＝CH),7.82-7.96(m,4H,Ph-H),11.73(s,1H,CNHCS),12.77(s,1H,CNHCS),12.91(br,1H,COOH)；¹³C NMR(300MHz,d6-DMSO):δ(ppm):23.4,126.9,129.5,131.2,135.4,137.1,147.8,158.9,171.5；MADLI-MS:m/z calcd for C₁₁H₁₂N₂OS:220.29；found:220.08；FT-IR:σ(cm^-1):877,968,1108,1485,1571,1602,1667,1826,2962,3203；T_m:143.6℃。

R端基為酯基的硫脲單體表征數(shù)據(jù)：¹H NMR(300MHz,DMSO):1.30-1.33(m,3H,CH₃),4.33(s,2H,CH₂-),5.74-6.85(d,1H,＝CH),6.32-6.44(m,2H,＝CH),7.81-7.91(m,4H,Ph-H),11.15(s,1H,CNHCS),12.51(s,1H,CNHCS)；¹³C NMR(300MHz,d6-DMSO):δ(ppm):15.3,62.1,127.5,128.9,132.7,137.4,138.3,149.0,158.9,169.5,174.4；MADLI-MS:m/z calcd for C₁₃H₁₄N₂O₃S:278.33；found:278.98；FT-IR:σ(cm^-1):865,988,1367,1406,1571,1601,1668,2981,3173；T_m:184.6℃。

R端基為氫的硫脲單體表征數(shù)據(jù)：¹H NMR(300MHz,DMSO):5.89-5.93(d,1H,＝CH),6.40-6.64(m,2H,＝CH),7.84-7.96(m,4H,Ph-H),11.83(s,1H,CNHCS),12.67(s,1H,CNHCS)；¹³C NMR(300MHz,d6-DMSO):δ(ppm):126.4,127.6,130.4,136.4,137.0,147.5,157.7,167.6,171.4,；MADLI-MS:m/z calcd for C₁₁H₁₀N₂O₃S:205.04；found:206.08；FT-IR:σ(cm^-1):870,968,1155,1256,1390,1556,1663,2854,2962；T_m:148.5℃。

實(shí)施例3

通過QCM-D吸附量測定的方法，以R端基為羧基的硫脲單體為例評價了雙組分共聚物表面對磷酸化肽的特異性吸附。按實(shí)施例1所述將該雙組分共聚物接枝到QCM-D芯片表面，在控溫20℃條件下，以體積濃度80％乙腈/水+20mM甲酸銨為載液，對非磷酸化肽及單、雙和三磷酸化肽分別進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)。圖4顯示了該雙組分共聚物表面對不同肽鏈的吸附曲線，充分展現(xiàn)出了此類聚合物出色的特異性吸附磷酸化肽，并且有效區(qū)分磷酸化位點(diǎn)個數(shù)的能力，在磷酸化肽的富集和分離領(lǐng)域具有非常廣闊的應(yīng)用前景。000000

富集應(yīng)用實(shí)例

實(shí)施例4

按實(shí)施例1所述方法將上述雙組分共聚物接枝到多孔硅膠表面，然后以其為柱填料制成SPE柱備用。以硫脲單元末端基R為羧基為例，固定相結(jié)構(gòu)見圖5。

樣品溶液的制備：1.0mg的α-酪蛋白溶解在1mL碳酸氫銨溶液中(50mM,pH＝8.0)，按照胰蛋白酶與α-酪蛋白的質(zhì)量比1:40(w/w)的比例加入胰蛋白酶進(jìn)行酶解，37℃反應(yīng)12小時，所得蛋白酶解液進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)操作。

將1mg聚合物修飾硅膠材料裝入凝膠吸頭中，1μL蛋白酶解液(其中含多肽1μg)上樣后，分別用30μL的體積濃度為85％乙腈/0.1％甲酸(pH＝3)的水溶液洗脫兩次；然后用30μL含有70％乙腈/0.1％甲酸(pH 3)的水溶液洗脫兩次；最后用20μL50％乙腈/3％三氟乙酸(pH 2)的水溶液洗脫。洗脫液直接在質(zhì)譜上進(jìn)行分析。上述整個過程在20℃條件下進(jìn)行。

由圖6和圖7可見，α-酪蛋白酶解產(chǎn)物中的單磷酸化肽和多磷酸化肽可以依次從磷酸化肽富集材料上洗脫下來，并通過ESI-MS直接進(jìn)行檢測。相比于氧化鈦富集得到的磷酸化肽(圖8)，采用磷酸化肽富集材料得到的磷酸化肽選擇性更好，多磷酸化肽的個數(shù)更多，說明磷酸化肽富集材料能特異性的富集和純化磷酸化肽。

實(shí)施例5-8

調(diào)整磷酸化肽富集材料的重量為2mg、3mg、4mg、5mg，其他條件同實(shí)施例4，富集后得到的磷酸化肽進(jìn)行質(zhì)譜分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在萃取模式操作模式下1mg的材料即可以有效地保留和富集1μg的α-酪蛋白中的磷酸化肽。

實(shí)施例9-11

調(diào)整α-酪蛋白酶解液的上樣量為2μg、4μg和8μg，其他條件同實(shí)施例4，富集后得到的磷酸化肽進(jìn)行質(zhì)譜分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在固相萃取模式操作模式下1mg的材料最多可以有效地保留和富集2μg的α-酪蛋白中的磷酸化肽。

實(shí)施例12-14

調(diào)整最后一步洗脫多磷酸化肽時的洗脫溶液的pH為3、4和5，其他條件同實(shí)施例4，進(jìn)行選擇性富集和質(zhì)譜分析。結(jié)果表明洗脫溶液pH為2時能將更多的多磷酸化肽從富集材料上洗脫下來，是為最佳pH值條件。

實(shí)施例15

調(diào)整富集的操作模式為離心，將1mg磷酸化肽富集材料裝入離心管中，2μL(其中含多肽2μg)α-酪蛋白酶解液溶于30μL的30％CH₃CN/0.1％甲酸的水溶液(pH＝3)并與材料混合，孵化5min，離心后收集上清液，沉淀再用30％乙腈/0.1％甲酸的水溶液(pH 2)孵化5min，離心后合并上清液。沉淀與30μL含有5mM的甲酸銨的50％CH₃CN/0.1％甲酸的水溶液(pH 2)孵化5min，離心后收集上清液，重復(fù)此孵化和離心步驟，離心后合并上清液；最后沉淀與30μL含有20mM的甲酸銨的80％CH₃CN/0.1％甲酸的水溶液(pH 2)孵化5min，離心后收集上清液。各上清液直接在MALDI-TOF分析。

由圖9至11可見，α-酪蛋白酶解產(chǎn)物中的非磷酸化肽沒有被磷酸化肽富集材料保留，直接被洗脫出來(圖9)；單磷酸化肽可以被磷酸化肽富集材料保留，在較低濃度的鹽可以洗脫出(圖10)；而多磷酸化肽與材料的作用最強(qiáng)最后被洗脫出來(圖11)，說明磷酸化肽富集材料能特異性的富集和純化磷酸化肽。

實(shí)施例16-19

調(diào)整富集材料的重量為2mg、3mg、4mg、5mg,其他條件同實(shí)施例15，富集后得到的磷酸化肽進(jìn)行質(zhì)譜分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在離心操作模式下1mg的材料即可以有效地保留和富集2μg的α-酪蛋白中的磷酸化肽。

實(shí)施例20-22

調(diào)整α-酪蛋白酶解液的上樣量為4μg、6μg和8μg，其他條件同實(shí)施例15，富集后得到的磷酸化肽進(jìn)行質(zhì)譜分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在離心操作模式下1mg的材料最多可以有效地保留和富集4μg的α-酪蛋白中的磷酸化肽。

實(shí)施例23-25

調(diào)整最后一步洗脫多磷酸化肽時的洗脫溶液的pH為3、4和5,其他條件同實(shí)施例15，進(jìn)行選擇性富集和質(zhì)譜分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在離心操作模式下，后一步洗脫溶液pH為2時可以洗脫出更多的多磷酸化肽，是為最佳pH條件。

通過以上實(shí)例所述方法，采用本發(fā)明的磷酸化肽富集材料對胰蛋白酶酶解后的α-酪蛋白溶液進(jìn)行選擇性富集，所得磷酸化肽經(jīng)ESI-MS和MALDI-TOF檢測后可得其多肽序列結(jié)構(gòu)以及磷酸化位點(diǎn)數(shù)目，如下表所示：

表1 ESI-MS和MALDI-TOF檢測到的α-酪蛋白酶解液中富集所得磷酸化肽信息

綜上所述，本發(fā)明的磷酸化肽富集材料對于多磷酸化肽和單磷酸化肽具有很好的選擇性富集性能，和常規(guī)的金屬氧化物相比，聚合物修飾硅膠材料富集磷酸化肽具有更高選擇性，更高多磷酸化肽回收率和更好的重復(fù)性。利用聚合物修飾硅膠材料對于磷酸化肽的高效的特異性吸附能力，可以將其應(yīng)用于復(fù)雜體系中磷酸化肽的選擇性分離富集，結(jié)合質(zhì)譜，該材料在翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學(xué)研究等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。