本發(fā)明涉及病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種與禽白血病病毒p27蛋白結(jié)合的多肽及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

禽白血病病毒（avianleukosisvirus,alv）是一種主要通過(guò)種雞的種蛋垂直傳播的致腫瘤性病毒。它主要造成感染雞群生長(zhǎng)遲緩、產(chǎn)蛋率和受精率等生產(chǎn)性能降低、腫瘤發(fā)生；同時(shí)會(huì)引起感染雞的免疫抑制。該病在世界各地均有發(fā)生，在我國(guó)地方品種雞呈蔓延趨勢(shì)，可直接導(dǎo)致種雞場(chǎng)經(jīng)營(yíng)困難。alv是一種基因組為單股rna的反轉(zhuǎn)錄病毒，被分為a～j等10個(gè)亞群。p27基因是禽白血病病毒不同亞群之間的一段高度保守的基因。p27蛋白是病毒核心外殼的主要成分，其含量高，占病毒總蛋白成分的30%以上，有許多易于檢測(cè)的病毒抗原位點(diǎn)，是制備群特異性抗體的首選抗原。

然而，禽白血病病毒的培養(yǎng)要求較高，純化難度極大，因此制備該病毒的抗體非常不易，以其為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法也難以得到普及應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種能與禽白血病病毒p27蛋白特異性結(jié)合的多肽，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，與p27蛋白的親和力好，特異性高，人工合成制備容易，可用于對(duì)禽白血病病毒抗原進(jìn)行定量和定性檢測(cè)，檢測(cè)成本低廉。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明研究利用噬菌體肽庫(kù)展示技術(shù)，以原核表達(dá)純化的禽白血病病毒p27蛋白為目的蛋白，經(jīng)過(guò)多輪篩選，最終得到一種可特異結(jié)合禽白血病病毒p27蛋白的噬菌體，經(jīng)擴(kuò)增培養(yǎng)后進(jìn)行序列測(cè)定，其多肽序列為nnsvsmn；人工合成此多肽進(jìn)行elisa結(jié)合實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，人工合成的多肽可與禽白血病病毒p27蛋白有良好的結(jié)合能力。

所述多肽序列為線性結(jié)合多肽。

所述的多肽序列，包括以所述的多肽序列為核心，任何對(duì)此多肽序列的延長(zhǎng)和修飾，修飾材料包括但不限于熒光材料、生物素、酶類、納米材料及特定蛋白。

編碼所述多肽的多核苷酸，其核苷酸序列為：

（a）如seqidno.2所示；或?yàn)?/p>

（b）與核苷酸序列（a）互補(bǔ)的序列。

構(gòu)建一種噬菌體，含有上述多肽或上述多核苷酸。

構(gòu)建一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，包含有上述篩選出的噬菌體。

將所述多肽序列用于禽白血病病毒的p27蛋白，其中包括但不局限于酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測(cè)。

所述多肽序列在用于對(duì)禽白血病病毒抗原進(jìn)行定量和定性檢測(cè)中的應(yīng)用。也可以上述多肽為基礎(chǔ)，制成用于檢測(cè)禽白血病病毒的試劑盒。

本發(fā)明積極有益的技術(shù)效果在于：

（1）本發(fā)明利用噬菌體肽庫(kù)篩選技術(shù)，通過(guò)與原核表達(dá)純化的禽白血病p27蛋白的多輪結(jié)合篩選，最終得到可特異結(jié)合禽白血病病毒p27蛋白的多肽噬菌體；經(jīng)擴(kuò)增培養(yǎng)后進(jìn)行序列測(cè)定，其多肽的核心序列為nnsvsmn；人工合成此多肽進(jìn)行elisa結(jié)合實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，此人工合成的多肽可與禽白血病病毒p27蛋白很好結(jié)合；本發(fā)明多肽與p27蛋白的親和常數(shù)可達(dá)到2.91×10⁹l/mol，親和力較好。

（2）禽白血病病毒的培養(yǎng)要求較高，純化難度極大，因此制備該病毒的抗體非常不易，本發(fā)明設(shè)計(jì)合成的多肽很好地規(guī)避了這一難題，可用人工合成方法快速取得，檢測(cè)成本也非常低廉。

（3）本發(fā)明的人工合成多肽與細(xì)胞培養(yǎng)alv、組織分離alv、人工合成p27蛋白均可以結(jié)合，而且與其它病毒均不反應(yīng)，特異性較高。

（4）以本發(fā)明多肽為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法比以目標(biāo)蛋白進(jìn)行免疫獲得蛋白抗體的過(guò)程簡(jiǎn)便，更易操作；通過(guò)對(duì)多肽進(jìn)行標(biāo)記，可快速地對(duì)禽白血病病毒p27蛋白進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1為利用多肽測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)禽白血病病毒、原核表達(dá)p27蛋白的結(jié)果對(duì)比圖。

圖中橫坐標(biāo)上，1為禽白血病病毒接種df-1細(xì)胞，2為原核表達(dá)禽白血病p27蛋白，3為df-1細(xì)胞對(duì)照；縱坐標(biāo)為od值。

圖2為利用本發(fā)明的多肽與其它病毒交叉反應(yīng)的結(jié)果對(duì)比圖。

圖中橫坐標(biāo)為各種病毒細(xì)胞培養(yǎng)物包被elisa板的不同待檢病毒；縱坐標(biāo)為od值。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但以下實(shí)施例只是用來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，并不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

在以下實(shí)施例中所涉及的儀器設(shè)備如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)儀器設(shè)備；所涉及的生化試劑或原料如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)市售產(chǎn)品；所涉及的檢測(cè)或試驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

實(shí)施例1：噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)的篩選

噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)是是噬菌體展示技術(shù)的一個(gè)重要分支。肽庫(kù)是由大量帶有不同肽段的單個(gè)噬菌體組成的重組噬菌體庫(kù)。重組噬菌體在進(jìn)行子代重新組裝時(shí)，其多肽序列將展示在噬菌體的表面，該展示多肽具備一定的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，可以與相應(yīng)的目標(biāo)蛋白進(jìn)行結(jié)合。通過(guò)目標(biāo)蛋白與展示肽庫(kù)結(jié)合后，洗脫未結(jié)合的噬菌體，然后將與目標(biāo)蛋白結(jié)合的噬菌體洗脫下來(lái)感染宿主菌擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)3到6輪的“吸附-洗脫-擴(kuò)增”，可富集到與目標(biāo)蛋白相結(jié)合的特異性重組噬菌體；經(jīng)過(guò)測(cè)序分析，可得到與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合的多肽結(jié)構(gòu)和序列（如seqidno.1所示）。

在本例中，于無(wú)菌條件下，用純化表達(dá)的alvp27蛋白包被聚乙烯板，每孔100μl（100μg/ml），置于4℃條件下，溫和振蕩過(guò)夜，去除包被液，再用5%的bsa液封阻，4℃作用至少8小時(shí)。

去除封阻液，用將100μl（約1×10¹¹體量）的噬菌體肽庫(kù)（ph.d.-7噬菌體展示肽庫(kù)試劑盒為neb公司產(chǎn)品）加入到相應(yīng)的孔中，室溫條件下，溫和搖動(dòng)60min，每孔加入tbst洗滌液250μl，洗滌5-8次；孔中加入洗脫液200μl，室溫溫和搖動(dòng)10min，吸出洗脫液，加入15μl1mtris-hcl（ph9.1）中和至中性。

中和后的洗脫液用于滴度測(cè)定和擴(kuò)增培養(yǎng)；將llb培養(yǎng)后的噬菌體進(jìn)行沉淀、離心收集，用于下一輪的篩選。

不同篩選輪次的噬菌體富集鑒定見(jiàn)表1，洗脫液的滴度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

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實(shí)例2篩選多肽的鑒定

（1）將接種的禽白血病病毒的df-1細(xì)胞（購(gòu)自上海紀(jì)寧生物科技有限公司）進(jìn)行超聲波破碎，然后以2μg/ml（蛋白量）進(jìn)行elisa包被；以同樣方式將原核表達(dá)的禽白血病病毒p27蛋白和未接種病毒的df-1做對(duì)照進(jìn)行包被。在進(jìn)行特異性試驗(yàn)時(shí)，將不同病毒蛋白進(jìn)行包被。

（2）將人工合成的多肽nnsvsmn偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶，以100ng/ml的量，加入到上述elisa板中，每孔50μl，振蕩器上混勻，37℃避光孵育30min；

（3）用酶標(biāo)板洗板機(jī)洗滌3次，用稀釋后的緩沖液加滿各孔，再甩干，如此重復(fù)洗滌3次；

（4）根據(jù)所需用量將tmb液加入到相應(yīng)的孔中，每孔100μl，在振蕩器上振蕩30s，室溫條件充分顯色10min；

（5）每孔加入50μl3m的氫氧化鈉終止反應(yīng)，在振蕩器上振蕩30s，然后用酶標(biāo)儀讀取各孔在450nm處的吸光值，判定結(jié)果。

結(jié)果表明，人工合成多肽與細(xì)胞接種alv、原核表達(dá)alvp27蛋白均可以結(jié)合（見(jiàn)圖1），與其它病毒均不反應(yīng)，其特異性較高（見(jiàn)圖2）。

實(shí)例3篩選多肽親和力鑒定

（1）將接種的禽白血病病毒的df-1細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行超聲破碎，然后以2μg/ml（蛋白量）進(jìn)行elisa包被；以同樣方式將原核表達(dá)的禽白血病病毒p27蛋白和未接種病毒的df-1做對(duì)照進(jìn)行包被。在進(jìn)行特異性試驗(yàn)時(shí)，將不同病毒蛋白進(jìn)行包被。

（2）將人工合成的多肽nnsvsmn偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶（采用商品化偶聯(lián)試劑盒偶聯(lián)），以100ng/ml的量，加入到上述elisa板中，每孔50μl，振蕩器上混勻，37℃避光孵育30min；

（3）用酶標(biāo)板洗板機(jī)洗滌5次，用稀釋后的緩沖液加滿各孔，再甩干，如此重復(fù)洗滌5次；

（4）根據(jù)所需用量將tmb液加入到相應(yīng)的孔中，每孔100μl，在振蕩器上振蕩30s，室溫條件充分顯色10min；

（5）每孔加入50μl2m的硫酸終止反應(yīng)，在振蕩器上振蕩30s，然后用酶標(biāo)儀讀取各孔在450nm處的吸光值，判定結(jié)果。

最終利用scatchard方程分析，不同加入酶標(biāo)多肽的濃度來(lái)計(jì)算多肽與病毒的親和力常數(shù)，其中ka=p1/ap2（其中p1是指多肽與抗原相結(jié)合的濃度，a是指抗原濃度，p2是指未結(jié)合多肽濃度）。通過(guò)計(jì)算可知本發(fā)明所得多肽與p27蛋白的親和力常數(shù)可達(dá)3.26×10⁹l/mol，說(shuō)明其親和力比較好。

sequencelisting

<110>河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院

<120>與禽白血病病毒p27蛋白相結(jié)合的多肽及其應(yīng)用

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