本發(fā)明屬于生命科學(xué)與生物
技術(shù)領(lǐng)域：
：，涉及一種聯(lián)合檢測(cè)H5亞型禽流感病毒與新城疫強(qiáng)毒的一步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR的試劑盒。適用于H5亞型禽流感病毒和新城疫強(qiáng)毒的定量檢測(cè)和流行病學(xué)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。
背景技術(shù)：
：：流感病毒屬于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)，分節(jié)段基因組的單股負(fù)鏈RNA病毒。流感病毒分為A、B、C三型。A型流感病毒抗原變異性最強(qiáng)，感染人和動(dòng)物，常引起世界性大流行，多種禽類均可感染(YoonSW,WebbyRJ,WebsterRG:EvolutionandEcologyofInfluenzaAViruses.MicrobiologicalReviews1992,56(1):152-179.)。根據(jù)其包膜表面血凝素(Hemagglutinin)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase)的抗原性分為若干亞型。其中H5N1亞型禽流感病毒自1996年分離以來(lái)，呈世界流行并給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，給人類公共衛(wèi)生構(gòu)成了巨大威脅。2014年以來(lái)我國(guó)H5N1亞型禽流感病毒以clade2.3.2.1c、clade2.3.4.4和clade7.2為流行分支(GuM,LiuW,CaoY,PengD,WangX,WanH,ZhaoG,XuQ,ZhangW,SongQ:Novelreassortanthighlypathogenicavianinfluenza(H5N5)virusesindomesticducks,China.EmergingInfectiousDiseases2011,17(6):1060-1063.)。截至2016年5月，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)的人感染H5N1病毒的病例已達(dá)到850例，其中449例死亡(WHO,CumulativenumberofconfirmedhumancasesforavianinfluenzaA(H5N1)reportedtoWHO,http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/H5N1_cumulative_table_archives/en/.)。因此防控H5亞型禽流感病毒有重要的公共衛(wèi)生意義。同H5亞型禽流感一樣，新城疫(NewcastleDisease,ND)強(qiáng)毒也是嚴(yán)重危害禽類的病毒性疾病，常以單獨(dú)或混合感染的方式感染家禽，發(fā)病率和死亡率都很高。新城疫是由新城疫病毒(NewcastleDiseasevirus,NDV)引起的一種烈性傳染病，被OIE列為必須通報(bào)的重要疫病，在至少六個(gè)大洲都有分布(RajmaniRS,SinghPK,RaviKumarG,SaxenaS,SinghLV,KumarR,SahooAP,GuptaSK,ChaturvediU,TiwariAK:In-vitrocharacterizationandevaluationofapoptoticpotentialofbicistronicplasmidencodingHNgeneofNewcastlediseasevirusandhumanTNF-alpha.Animalbiotechnology2015,26(2):112-119.)。新城疫對(duì)200多種禽類和其他動(dòng)物都有感染能力，是危害世界禽類養(yǎng)殖業(yè)的重要疾病之一。NDVClassII病毒宿主范圍廣，臨床樣品來(lái)源多元化，ClassII分支中III-X亞型均為強(qiáng)毒。H5亞型與新城疫強(qiáng)毒的發(fā)生均可導(dǎo)致禽類出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)疾病癥狀，在臨床癥狀和病理變化等方面有許多相似處，給臨床鑒別診斷帶來(lái)較大的困難。當(dāng)這兩種病毒混合感染禽類時(shí)，使用傳統(tǒng)的病原分離及血清學(xué)方法時(shí)診斷操作繁瑣，往往需要數(shù)天完成，且無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)兩病的同步檢測(cè)?，F(xiàn)在雖有學(xué)者建立多重PCR方法同時(shí)檢測(cè)H5禽流感病毒和新城疫強(qiáng)毒，但僅依賴普通凝膠電泳還達(dá)不到高通量集成化診斷的層次，因而需要研究一種能夠?qū)煞N病毒進(jìn)行高通量快速排查、準(zhǔn)確鑒別的集成化診斷技術(shù)。有效防控H5禽流感和新城疫強(qiáng)毒，關(guān)鍵在于早期快速、敏感和特異的鑒別診斷，本發(fā)明根據(jù)兩種病毒特有的保守基因序列，設(shè)計(jì)引物然后利用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，一次可以同時(shí)分析數(shù)十個(gè)樣本，從而達(dá)到快速高通量檢測(cè)H5禽流感和新城疫強(qiáng)毒的目的。多數(shù)現(xiàn)有的檢測(cè)流感病毒和新城疫病毒的分子診斷技術(shù)采用二步法，包括隨機(jī)引物介導(dǎo)的反轉(zhuǎn)錄(第一步)和隨后特異性引物的PCR(第二步)。二步法使用隨機(jī)引物，會(huì)產(chǎn)生大量的背景核酸，降低反轉(zhuǎn)錄的效率，而且產(chǎn)生的背景核酸也會(huì)降低PCR的效率。一步法是基于特異引物的反轉(zhuǎn)錄體系，效率高，易操作，減低污染，從而大大提高了PCR的擴(kuò)增效率。BHQ1、MGB基團(tuán)是新一代猝滅基團(tuán)，本身不產(chǎn)生熒光，與TAMARA等傳統(tǒng)猝滅基團(tuán)相比，背景低，靈敏度高。Taqman-MGB探針是在TaqMan探針的3’端偶聯(lián)結(jié)了小溝結(jié)合物(Minorgroovebinding,MGB)，它可以縮短探針長(zhǎng)度，降低熒光本底，增強(qiáng)探針與模板的結(jié)合，并實(shí)現(xiàn)分辨一個(gè)堿基的差異(SahaR,DonofrioRS,BagleyST:Quantitativereal-timePCRdetectionofPseudomonasoleovoranssubsp.lubricantisusingTaqMan-MGBassayincontaminatedmetalworkingfluids.InternationalBiodeterioration&Biodegradation2011,65(3):460-464)，在檢測(cè)多種病原方面都有應(yīng)用。MGB小溝結(jié)合物能提高探針Tm值，使探針更短，信號(hào)本底更低，還能幫助引物與目標(biāo)基因結(jié)合(MaM,LiuJ,SongY,LiL,LiY:TaqManMGBProbeFluorescenceReal-TimeQuantitativePCRforRapidDetectionofChineseSacbroodVirus.PlosOne2013,8(2):e52670-e52670.)。MGB與BHQ1探針3′端的猝滅基團(tuán)取代傳統(tǒng)的TAMRA后自身不發(fā)光，熒光本底降低，改善了熒光光譜分辨率(MingxiaoM,JinhuaL,YingjinS,LiL,YongfeiL:TaqManMGBprobefluorescencereal-timequantitativePCRforrapiddetectionofChineseSacbroodvirus.PlosOne2013,8(2):e52670-e52670.)。因此本方法有較高的靈敏性、特異性和重復(fù)性，在早期快速檢測(cè)H5亞型禽流感與新城疫強(qiáng)毒方面具有很好的應(yīng)用價(jià)值。我國(guó)于2004年頒布H5亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)方法的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，于2011年頒布對(duì)所有亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)方法的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。其中H5檢測(cè)方法可能不能與近年禽流感H5亞型的流行分支的變化情況相適應(yīng)。本發(fā)明針對(duì)近5年來(lái)實(shí)驗(yàn)室分離到的H5亞型禽流感病毒的變化情況設(shè)計(jì)針對(duì)HA基因的引物和探針，能夠檢測(cè)clade2.3.4.4,clade2.3.2.1c以及早期clade0等分支的H5禽流感病毒。臨床實(shí)驗(yàn)表明本方法能夠檢測(cè)泄殖腔棉拭子、組織病料、尿囊液中的多種clade的H5亞型禽流感病毒與新城疫強(qiáng)毒，敏感性高，無(wú)漏檢現(xiàn)象。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種一步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，用于同時(shí)檢測(cè)H5亞型禽流感病毒RNA與新城疫強(qiáng)毒RNA。由于是直接檢測(cè)病原體核酸，因此具有高敏感、高特異和短檢測(cè)窗口期等優(yōu)點(diǎn)，能為疫病早診斷、早治療、降低病死率以及控制疫情爭(zhēng)取時(shí)間，為H5亞型禽流感病毒與新城疫強(qiáng)毒的監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支撐。本發(fā)明聯(lián)合檢測(cè)H5亞型禽流感病毒與新城疫強(qiáng)毒的一步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物組和探針如下：a.針對(duì)禽流感HA基因的引物及探針：HA-FP：CTTGCGACTGGGCTCAGAAAT(SEQIDNO：1)HA-RP:TTTGGGTGGATTCTYTGTCTGC(SEQIDNO：2)HA-probe:VIC-CATTCCYTGCCATCC-MGB(SEQIDNO：3)b.針對(duì)新城疫強(qiáng)毒F基因的引物及探針：F-FP:GGTCAATCATAGTCAAGTTGCTCC(SEQIDNO：4)F-RP:AACCCCAAGAGCTACACTGCC(SEQIDNO：5)F-probe:FAM-AAGCGTTTYTGTCTCCTTCCTCC-BHQ1(SEQIDNO：6)探針HA-probe的5’端標(biāo)記有報(bào)告熒光染料VIC，3’端標(biāo)記有猝滅熒光染料MGB；所述探針F-probe的5’端標(biāo)記有報(bào)告熒光染料FAM，3’端標(biāo)記有猝滅熒光染料BHQ1。本發(fā)明還提供了包括上述引物組和探針的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒。所述試劑盒的具體組成為：(1)A液：12.5x酶Mix：包括1U/uL的熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶、7.5U/uL的RNase抑制劑、95U/uL的反轉(zhuǎn)錄酶；(2)50xROXI/ROXIIreferencedye；(3)B液：2.5xPCR緩沖液：包括2.5mMdNTP、6.25mMMgCl2、TaqBuffer等；(4)C液：10x引物Mix：包括3.5uMHA-FP、3.5uMHA-RP、3.5uMF-FP、3uMF-RP、3.5uMHA-Probe、3uMF-Probe；(5)陽(yáng)性對(duì)照：H5-HA與NDV-F模板質(zhì)?；旌弦鹤鳛榉磻?yīng)的陽(yáng)性對(duì)照；(6)陰性對(duì)照：RNase-freeH2O作為反應(yīng)的陰性對(duì)照。本發(fā)明中另一個(gè)目的是提供一種聯(lián)合檢測(cè)H5亞型禽流感與新城疫強(qiáng)毒的一步法熒光定量PCR的方法，適用于H5亞型禽流感病毒和新城疫強(qiáng)毒的定量檢測(cè)和流行病學(xué)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，通過(guò)用于聯(lián)合檢測(cè)H5亞型禽流感與新城疫強(qiáng)毒的一步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，該試劑盒包括20uL的PCR擴(kuò)增檢測(cè)體系：A液：12.5x酶Mix1.6uL；50xROXI/ROXIIreferencedye：0.4uL；B液：2.5xPCR緩沖液8uL；C液：10x引物Mix2uL；模板樣品：5-8uL或?qū)φ掌?uL；加RNase-freeH2O補(bǔ)至20uL體系。用一步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增：在孔板中加入試劑，加樣完畢后，將孔板放入ABI7500或ABI7300儀器中，設(shè)置反應(yīng)條件為：55℃15min反轉(zhuǎn)錄；95℃5min預(yù)變性；95℃10sec，60℃31sec40個(gè)循環(huán)。本發(fā)明中引物和探針的特異性：本發(fā)明選擇病毒的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物和探針組，可以特異性檢測(cè)H5亞型AIV與NDV強(qiáng)毒，對(duì)其他亞型禽流感病毒、新城疫弱毒、其他禽類病毒均無(wú)明顯擴(kuò)增曲線。用于聯(lián)合檢測(cè)H5亞型禽流感與新城疫強(qiáng)毒的一步法熒光定量PCR試劑盒的敏感性：本方法單個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)可以同時(shí)檢測(cè)出最低5拷貝含NDV基因片段的質(zhì)粒與5拷貝含H5基因片段的質(zhì)粒，比常規(guī)PCR靈敏度高至少100倍。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系、反應(yīng)效率均較佳，且重復(fù)性試驗(yàn)中批內(nèi)與批間重復(fù)性均良好。附圖說(shuō)明圖1是本發(fā)明的HA-FP上游引物的示意圖；圖2是本發(fā)明的HA-RP下游引物的示意圖；圖3是本發(fā)明的HA-probe探針的示意圖；圖4是本發(fā)明的F-FP上游引物的示意圖；圖5是本發(fā)明的F-RP下游引物的示意圖；圖6是本發(fā)明的F-probe探針的示意圖；圖7是棉拭子樣品RNA擴(kuò)增曲線示意圖；圖8是尿囊液樣品RNA擴(kuò)增曲線示意圖。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。所用材料、試劑若無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。所用的材料和試劑如下：ABI7500熒光定量PCR儀、96孔熒光定量反應(yīng)板、8聯(lián)排管均購(gòu)自ABI公司。反轉(zhuǎn)錄酶HiScriptIIReverseTranscriptase、熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶ChampagneTaqDNAPolymerase及Taqbuffer均購(gòu)自諾唯贊生物科技有限公司，RNase抑制劑RecombinantRNaseInhibitor購(gòu)自大連寶生物公司。病毒DNA/RNA提取試劑購(gòu)自Roche公司。1.引物與探針的設(shè)計(jì)：聯(lián)合檢測(cè)用引物與Taqman探針的設(shè)計(jì)均根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室及GenBank中H5-Ha以及強(qiáng)毒NDV-F的保守序列。本發(fā)明采用PrimerExpress3.0以及Oligo7軟件設(shè)計(jì)多套引物與探針，通過(guò)分析其引物之間的二聚體，選定如圖1—圖6所示的兩組特異性引物對(duì)應(yīng)的兩條Taqman探針(序列在GenBank中下載)，并通過(guò)棋盤法探究反應(yīng)體系中引物與探針的最佳濃度組合。結(jié)果顯示，不同引物和探針終濃度組合對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較大，在終濃度如下時(shí)靈敏度最佳：引物HA-FP0.35uM、引物HA-RP0.35uM、引物F-FP0.3uM、引物F-RP0.3uM；探針HA-Probe0.35uM、探針F-Probe0.3uM。2.一步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)方法的建立：(1)核酸抽提按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，具體步驟如下：a.PolyACarrierRNA與BindingBuffer1:50混勻，稱為MIXA；b.每個(gè)樣品取100-200ul上清，加入200uLMIXA與50uL蛋白酶K，混勻；c.72℃孵育15min；d.裝好吸附柱，將混合液轉(zhuǎn)移至柱內(nèi)，12000rpm離心1min，棄去下層液體，更換下層收集管；e.加入500ulInhibitorRemovalBuffer，12000rpm離心1min，棄去下層液體，更換下層收集管；f.加入450uLWashBuffer，12000rpm離心1min，棄去下層液體，更換下層收集管，并重復(fù)此步驟一次；g.12000rpm離心1min，棄去下層收集管，換1.5mL離心管；h.在柱內(nèi)加入30uLElutionBuffer，室溫放置1min，12000rpm離心1min洗脫RNA后棄柱。(2)一步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)體系：通過(guò)不同熒光標(biāo)記的兩條探針，完成一例樣本在一管反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)AIV及其H5亞型。具體操作步驟如下：a.使用2對(duì)引物和對(duì)應(yīng)探針在單管PCR反應(yīng)體系中對(duì)步驟(1)得到的RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，一個(gè)樣品做兩個(gè)重復(fù)。b.RRT-PCR檢測(cè)體系為20uL，包括：A液：12.5x酶Mix1.6uL；50xROXI/ROXIIreferencedye：0.4uL；B液：2.5xPCR緩沖液8uL；C液：10x引物Mix2uL；模板樣品：5-8uL或?qū)φ掌?uL；加RNase-freeH2O補(bǔ)至20uL體系。c.RRT-PCR反應(yīng)程序：(ABI7500等60℃34s，ABI7300等60℃31s)55℃15min反轉(zhuǎn)錄；95℃5min預(yù)變性；95℃10sec，60℃34sec，40個(gè)循環(huán)結(jié)束反應(yīng)，耗時(shí)共約80分鐘。(3)判斷結(jié)果的方法：根據(jù)一步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果，可以對(duì)檢測(cè)樣本是否感染AIV或其H5亞型進(jìn)行鑒定。其中FAM在521nm激發(fā)光下發(fā)出熒光，檢測(cè)新城疫強(qiáng)毒；VIC在554nm激發(fā)光下發(fā)出熒光，檢測(cè)H5亞型禽流感病毒。具體方法為：a.每次檢測(cè)，H5陽(yáng)性質(zhì)粒及F的陽(yáng)性質(zhì)粒均應(yīng)有擴(kuò)增曲線且Ct值≤38，陰性對(duì)照Ct>38，否則本次結(jié)果無(wú)效。b.在a的前提下，如果FAM標(biāo)記的F探針在一個(gè)樣品的兩個(gè)孔內(nèi)均有擴(kuò)增，且Ct≤38，則判定為新城疫強(qiáng)毒陽(yáng)性，否則判為新城疫強(qiáng)毒陰性。c.在a的前提下，如果VIC標(biāo)記的HA探針在一個(gè)樣品的兩個(gè)孔內(nèi)均有擴(kuò)增，且Ct≤38，則判定為H5亞型AIV陽(yáng)性，否則判定樣品為H5亞型禽流感陰性。d.如果F、HA同時(shí)為陽(yáng)性，則樣品是H5亞型禽流感病毒、新城疫強(qiáng)毒共感染；如果F為陽(yáng)性，HA為陰性，則樣品含新城疫強(qiáng)毒不含H5亞型禽流感病毒；如果F、HA均為陰性，則樣品無(wú)禽流感病毒也無(wú)新城疫病毒；如果如果F為陰性，HA為陽(yáng)性，則樣品含H5亞型禽流感病毒。最后應(yīng)說(shuō)明的是，以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明。盡管參照前述優(yōu)選實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可以對(duì)前述記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或?qū)ζ渲胁糠旨夹g(shù)特征進(jìn)行同等替換。凡在本發(fā)明的精神和原則以內(nèi)所做的修改、等同替換等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。3.實(shí)例(1)特異性實(shí)驗(yàn)：利用優(yōu)化好的一步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系，對(duì)各亞型AIV、常見(jiàn)禽病毒、新城疫弱毒提取RNA/DNA后進(jìn)行擴(kuò)增，以RNase-freeH2O為模板作為陰性對(duì)照，每個(gè)樣品做兩個(gè)重復(fù)，各孔收集FAM、VIC兩種熒光信號(hào)。其中，使用的H5亞型禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株如表1：表1.H5亞型禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株*:董梅,顧敏,曹軍平,等.1株對(duì)小鼠呈高致病性H5N1亞型禽流感病毒的遴選[J].免疫學(xué)雜志,2010(2):132-135.使用的新城疫標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株如表2：表2.新城疫標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株使用的新城疫弱毒、其他亞型禽流感病毒以及其他常見(jiàn)禽病毒如表3：表3其他其他亞型禽流感病毒以及其他常見(jiàn)禽病毒1.疫苗株購(gòu)自乾元浩生物股份有限公司2.疫苗株購(gòu)自青島易邦生物工程有限公司如表1至表3的數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，H5亞型禽流感病毒在VIC通道中均有擴(kuò)增曲線，新城疫強(qiáng)毒在FAM通道中均有擴(kuò)增曲線。而新城疫弱毒、其他亞型的禽流感病毒、其他常見(jiàn)禽病毒在VIC、FAM通道中均無(wú)擴(kuò)增，因此本方法有較強(qiáng)的特異性。(2)棉拭子臨床樣品檢測(cè)：采雞喉拭、肛拭后每支棉拭浸入1ml4抗PBS，擠棉拭樣品后8000rpm離心5min，取200uL上清提取RNA后做一步法熒光定量PCR。檢測(cè)結(jié)果曲線如圖7所示。2015-2016年活禽市場(chǎng)臨床棉拭樣品中，檢出感染H5亞型禽流感樣品6份(陽(yáng)性率7.69％)，與雞胚分離法比較，無(wú)漏檢且符合率為90％。檢出感染新城疫強(qiáng)毒樣品0份，用新城疫強(qiáng)毒ZJ1攻毒制作臨床樣品結(jié)果與雞胚分離法比較，符合率為89％。(3)尿囊液臨床樣品檢測(cè)：裝尿囊液樣品用1.5mLEppendorftube收集后，8000rpm離心5min，取200uL上清提取RNA后做一步法熒光定量PCR。檢測(cè)結(jié)果曲線如圖8所示。2013-2016年送檢本實(shí)驗(yàn)室的尿囊液樣品中，共分離到新城疫強(qiáng)毒6株，H5亞型AIV共11株，與雞胚分離法比較并無(wú)漏檢。SEQUENCELISTING<110>揚(yáng)州大學(xué)<120>一種聯(lián)合檢測(cè)H5亞型禽流感病毒與新城疫強(qiáng)毒的一步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒<130><160>6<170>PatentInversion3.3<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1cttgcgactgggctcagaaat21<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2tttgggtggattctytgtctgc22<210>3<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>3cattccytgccatcc15<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>4ggtcaatcatagtcaagttgctcc24<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>5aaccccaagagctacactgcc21<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>6aagcgtttytgtctccttcctcc23當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3 當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3