本發(fā)明屬于DNA錯配修復(fù)系統(tǒng)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測DNA錯配修復(fù)系統(tǒng)的試劑盒及其用途。

背景技術(shù)：

人類基因組含有短串聯(lián)DNA重復(fù)序列，又稱作微衛(wèi)星序列(microsatellite)，這些序列由于其重復(fù)性質(zhì)，易發(fā)生復(fù)制錯誤，正常情況下，這些錯誤可以通過DNA的錯配修復(fù)(MMR)系統(tǒng)來進(jìn)行修復(fù)校正，DNA的MMR系統(tǒng)功能缺陷會引起微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability,MSI)，MSI是林奇綜合癥(Lynch syndrome)的一個標(biāo)志，在90％的林奇綜合癥中均有發(fā)生。

微衛(wèi)星不穩(wěn)定表現(xiàn)為同一微衛(wèi)星位點在不同個體之間以及同一個體的正常組織與某些異常組織之間，微衛(wèi)星位點的重復(fù)單位的數(shù)目不同。近年來的大量研究表明：MSI與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，如結(jié)直腸癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌等，MSI是癌癥發(fā)生的一個生物標(biāo)記。美國國立癌癥協(xié)會建議50歲以下的結(jié)直腸癌患者應(yīng)該做MMR檢測，在國外一些醫(yī)學(xué)中心對所有的結(jié)直腸腫瘤組織進(jìn)行MMR蛋白免疫組化檢測或者M(jìn)SI檢測，以決定哪些患者需要進(jìn)行Lynch綜合征相關(guān)基因檢測。

根據(jù)文獻(xiàn)報道，大約15％的結(jié)直腸癌中存在MSI現(xiàn)象，與無MSI的結(jié)直腸癌相比，攜帶有MSI的結(jié)直腸癌其預(yù)后較好，已有大量證據(jù)表明，MMR蛋白表達(dá)缺失或者M(jìn)SI-H是二期結(jié)直腸癌預(yù)后良好的一個標(biāo)志物，而且存在MSI和無MSI的患者二者藥物反應(yīng)也不一樣。此外，對于二期結(jié)直腸癌是否需要輔助化療，臨床上考量的一個重要信息就是微衛(wèi)星不穩(wěn)定性。

因此，MSI檢測對結(jié)直腸癌患者的意義重大。在2011年，關(guān)于結(jié)直腸癌篩查的美國國家綜合癌癥網(wǎng)指南(NCCN Guidelines)中，MSI已成為首要檢測項目，推薦了5個檢測位點用于MSI穩(wěn)定性的確認(rèn)，兩個及兩個以上位點發(fā)生變化為MSI-H，一個位點發(fā)生變化為MSI-L，沒有位點發(fā)生變化為MSI-S。

研究表明，二期/三期結(jié)腸癌患者發(fā)現(xiàn)MSI-L或者M(jìn)SS通過輔助化療確實會改善預(yù)后，但是MSI-H卻不能從5-氟尿嘧啶(5-FU)輔助化療中顯著獲益，5年生存率反而更低。結(jié)腸直腸癌是常見消化道惡性腫瘤，中國每年有13-16萬人罹患結(jié)直腸癌，其中發(fā)病率占腫瘤發(fā)病率的第三位。具有MSI的散發(fā)性結(jié)直腸癌，具有不同的臨床病理、分子生物學(xué)特征，表現(xiàn)為：發(fā)病年齡小；對某些化療藥物如5-FU、順鉑等有耐藥性，MSI-H是二期結(jié)腸癌預(yù)后良好的一個標(biāo)志物，也是患者不能從氟尿嘧啶單藥輔助化療獲益的療效預(yù)測指標(biāo)。

此外，檢測MSI還可以輔助PD-1抗體用藥。2015年的ASCO中報道，結(jié)腸癌MMR基因表達(dá)情況可以作為PD-1抗體治療的療效預(yù)測指標(biāo)。根據(jù)大會臨床數(shù)據(jù)報告，MMR表達(dá)缺陷(dMMR)患者PD-1治療的有效率達(dá)到62％，相關(guān)的實驗結(jié)果在2015年底發(fā)表在全球最頂尖的醫(yī)學(xué)雜志NEJM上，引起了醫(yī)學(xué)界的轟動。MMR基因的情況對PD-1結(jié)直腸癌療效的預(yù)測精準(zhǔn)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于了之前通用的療效預(yù)測指標(biāo)B7-H1(PD-L1)。

在美國和歐盟，NCCN已經(jīng)將MSI檢測納入常規(guī)檢測，但是在中國應(yīng)用MSI檢測的醫(yī)院還非常少，用于結(jié)直腸癌篩查最常用的還是腸鏡檢查，糞便潛隱血檢測，鋇灌腸檢測等。

目前國內(nèi)外用于檢測MSI的方法主要有：(1)免疫組化方法(IHC)，主要檢測MLH1，MSH2，MSH6，PMS2，這種方法不能檢測MMR蛋白的生物學(xué)活性，所以有可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果，而且IHC實驗結(jié)果受抗體來源以及操作者的技能水平的影響，這會導(dǎo)致不同醫(yī)院間結(jié)果的差異性，造成診斷不準(zhǔn)確甚至是醫(yī)療糾紛；(2)直接測序法，對MMR基因各區(qū)域直接測序，這種方法耗時長，價格比較昂貴。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測DNA錯配修復(fù)系統(tǒng)的試劑盒及其用途，該試劑盒的微衛(wèi)星位點能夠用于檢測癌癥DNA錯配修復(fù)系統(tǒng)，其靈敏度比免疫組化方法(IHC)方法更高，本發(fā)明的試劑盒重復(fù)性更好，能夠同時檢測多個MSI位點，提高了檢測效率。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種用于檢測DNA錯配修復(fù)系統(tǒng)的試劑盒，該試劑盒包含一擴(kuò)增體系，該擴(kuò)增體系包含PCR引物混合液和PCR反應(yīng)液；所述的PCR引物混合液包含微衛(wèi)星位點，該微衛(wèi)星位點包含：NR-21、NR-24、BAT-25、BAT-26、MONO-27、BAT-48、BAT-49a、BAT-49b、BAT-50a、BAT-50b、BAT-51a、BAT-51b、BAT-51c、BAT-51d、BAT-51e、BAT-51f、BAT-52a、BAT-52b、BAT-53a、BAT-53b、BAT-53c、BAT-54、BAT-55、BAT-56a、BAT-56b、BAT-57、BAT-59、BAT-59b、BAT-60a、BAT-60b、BAT-60c、BAT-62、BAT-63a、BAT-63b、BAT-68a、BAT-68b、BAT-69、BAT-72、BAT-73、BAT-79、BAT-83、BAT-90、BGT-60、Penta C、Penta D、Penta E中的任意一種或兩種以上串聯(lián)重復(fù)位點單核苷酸A或者G大于40個重復(fù)。

所述的微衛(wèi)星位點具體如下表所示：(Accession Number是Genebank的基因登錄號)

；上表中核苷酸重復(fù)表示有多少個重復(fù)的核苷酸；微衛(wèi)星位點為1-6個堿基的串聯(lián)重復(fù)序列，這些位點為單核苷酸A或者G串聯(lián)重復(fù)位點，或者五個核苷酸串聯(lián)重復(fù)位點，(A)21中A代表腺嘌呤核糖核苷酸，數(shù)字21代表重復(fù)21個A。

所述的PCR引物混合液包含核苷酸序列SEQ ID NO：1-92中的任意一種或兩種以上。

所述的核苷酸序列SEQ ID NO：1-92的5’末端用熒光標(biāo)記物標(biāo)記，該熒光標(biāo)記物包含F(xiàn)L(Fluorescein)、JOE(6-carboxy-4′,5′-dichloro-2′,7′-dimethoxyfluorescein)、TMR(carboxy-tetramethylrhodamine)、ROX(Carboxyl-X-Rhodamine)、ET-CXR(Energy Transfer-carboxy-X-rhodamine)、ET-TMR(Energy Transfer-carboxy-tetramethylrhodamine)或FAM(Fluorescein amidite)中的任意一種或兩種以上。

所述的擴(kuò)增體系還包含DNA模板，該擴(kuò)增體系的組分的體積比為PCR反應(yīng)液：PCR引物混合液：DNA模板：水＝1～2：1～2：1～4：2～7。

所述的PCR反應(yīng)液包括：10-100mM Tris-HCl，10-250mM KCl，1-10mM MgCl₂，0.1-10mM dNTP，0.1-10U/μL Taq DNA聚合酶。

該檢測方法采用熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳法確定微衛(wèi)星位點突變的存在。

所述的突變包含：插入突變或缺失突變。

本發(fā)明還提供了一種根據(jù)所述的用于檢測DNA錯配修復(fù)系統(tǒng)的試劑盒的用途，所述的微衛(wèi)星位點能夠用于檢測DNA錯配修復(fù)系統(tǒng)，該DNA錯配修復(fù)系統(tǒng)包括癌癥組織中的DNA錯配修復(fù)系統(tǒng)。

所述的癌癥包括：結(jié)腸直腸癌，子宮內(nèi)膜癌，胃癌，胰腺癌，肺癌，以及乳腺癌中的任意一種。

所述的微衛(wèi)星位點用于檢測癌癥的微衛(wèi)星的不穩(wěn)定性，使該試劑盒能作為檢測癌癥DNA錯配修復(fù)系統(tǒng)的試劑盒。

本發(fā)明提供的用于檢測DNA錯配修復(fù)系統(tǒng)的試劑盒及其用途，具有以下優(yōu)點：

1、使用本發(fā)明的微衛(wèi)星位點檢測，其靈敏度比IHC方法更高。

2、本發(fā)明的長串聯(lián)重復(fù)位點具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確度。

3、本發(fā)明的試劑盒采用熒光標(biāo)記和毛細(xì)管電泳片段大小來區(qū)分不同的微衛(wèi)星位點，實現(xiàn)了在一個PCR體系內(nèi)同時檢測多個MSI位點，提高了檢測效率。

4、本發(fā)明的試劑盒檢測能夠從同一切片提取的DNA做多次重復(fù)實驗，而傳統(tǒng)的免疫組化同一切片無法做重復(fù)實驗，比傳統(tǒng)方法更具有可重復(fù)性，而且本發(fā)明的檢測實驗結(jié)果采用軟件分析，減少了了人為主觀判斷和標(biāo)準(zhǔn)化。

5、美國國立癌癥研究院提出的微衛(wèi)星檢測體系中并沒有內(nèi)對照，本發(fā)明使用Penta位點作為內(nèi)對照，是本領(lǐng)域中是首次使用，其可以對整個檢測體系進(jìn)行內(nèi)控制。

6、本發(fā)明的檢測采用毛細(xì)管電泳檢測方法，使結(jié)果更準(zhǔn)確、直觀。

7、本發(fā)明采用數(shù)據(jù)分析軟件，使結(jié)果更好地被闡釋。

8、本發(fā)明選擇不同的微衛(wèi)星位點可以適用于檢測不同的癌癥，包括結(jié)腸直腸癌，子宮內(nèi)膜癌，胃癌，胰腺癌，肺癌以及乳腺癌。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實驗例2的短單核苷酸串聯(lián)重復(fù)位點的DNA分型圖譜。

圖2為本發(fā)明實驗例2的正常組織和結(jié)腸直腸癌組織的短單核苷酸串聯(lián)重復(fù)位點的對比的DNA分型圖譜。

圖3為本發(fā)明實驗例2的長單核苷酸串聯(lián)重復(fù)位點的DNA分型圖譜。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明。

采用本發(fā)明的試劑盒對2例結(jié)腸直腸癌患者檢測的具體實施情況具體如下：

實驗例1PCR擴(kuò)增反應(yīng)

1、PCR反應(yīng)體系

表1：反應(yīng)具體組份

上述表1中的dNTP包括dATP、dGTP、dTTP和dCTP，dATP、dGTP、dTTP和dCTP的使用濃度為1mM。

使用的引物對的混合物指選用包含本發(fā)明的微衛(wèi)星位點及其上游引物和下游引物的混合物，各引物對(上游引物和下游引物)的終濃度為0.1-1μM。如表2所示，為兩個混合物的具體組份。

表2：兩個混合液的具體組份

上述表2中，5’端熒光標(biāo)記物JOE為6-carboxy-4′,5′-dichloro-2′,7′-dimethoxyfluorescein，F(xiàn)L為Fluorescein，ET-TMR為Energy Transfer-carboxy-tetramethylrhodamine，“/”表示不用熒光標(biāo)記，5’端為羥基。其中，微衛(wèi)星位點Penta C和Penta D作為內(nèi)對照。

2、實驗條件

PCR儀器選用ABI veriti PCR儀

表3：PCR反應(yīng)的具體條件

將2μL PCR反應(yīng)液和2μL PCR引物混合液混合，加入1-2μL DNA模板，并補(bǔ)加水4-6μL至PCR反應(yīng)體系總體積為10μL。參照上述表3的具體反應(yīng)條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。

實驗例2毛細(xì)管電泳實驗

取擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物，加入內(nèi)標(biāo)(Promega公司，分子內(nèi)標(biāo)ILS500)和甲酰胺，在95℃下干浴3min，冰水浴3min。ABI 3500Dx儀器上樣，打開3500Dx數(shù)據(jù)收集軟件，編輯上樣板，導(dǎo)入片段分析程序，點擊運行。具體步驟如下：

(1)準(zhǔn)備上樣樣品：所得PCR產(chǎn)物1μL，加入甲酰胺10μL，DNA分子標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)ILS500 1μL；

(2)毛細(xì)管電泳：按照ABI3500Dx儀器使用說明書進(jìn)行毛細(xì)管電泳程序設(shè)置，具體如下：

A、準(zhǔn)備儀器；B、預(yù)熱加熱爐至60℃；C、準(zhǔn)備樣本反應(yīng)板并加載至儀器；D、檢查儀器狀態(tài)；E、創(chuàng)建或?qū)胍粋€反應(yīng)板；F、分配反應(yīng)板內(nèi)容；G、鏈接反應(yīng)板；H、加載反應(yīng)板以便運行，創(chuàng)建進(jìn)樣列表；I、開始運行。

片段分析運行完畢后，將原始數(shù)據(jù)，后綴名為.fsa的文件導(dǎo)入數(shù)據(jù)分析軟件GeneMapper4.0，對熒光信號進(jìn)行分析，導(dǎo)入Panel和Bin，點擊Analyze，分析完畢得到毛細(xì)管電泳圖譜及相關(guān)片段大小信息。

實驗結(jié)果：

如圖1所示，使用微衛(wèi)星位點為：NR-21、NR-24、BAT-25、BAT-26、Mono-27、Penta C和Penta D的試劑盒對結(jié)腸直腸癌患者1的腫瘤組織及正常組織進(jìn)行微衛(wèi)星位點檢測，凡是在癌癥組織或者息肉組織中發(fā)現(xiàn)有一個位點的片段大小與正常組織不同，則說明該位點為微衛(wèi)星不穩(wěn)定，如圖2所示，結(jié)腸直腸癌組織與正常組織5個微衛(wèi)星位點相比，其核苷酸片段的大小有不同程度的減小，如BAT-26位點減小了10bp，NR-21位點減小了6bp，BAT-25位點減小了7bp，Mono-27位點減小了6bp，NR-24位點減小了5bp，表明結(jié)腸直腸癌組織在5個位點均出現(xiàn)MSI現(xiàn)象，說明該患者腫瘤組織為MSI-H。

如圖3所示，使用微衛(wèi)星位點為：BAT-52a、BAT-55、BAT-56a、BAT-57、BAT-59、Penta C和Penta D的試劑盒對結(jié)腸直腸癌患者2的腫瘤組織及正常組織進(jìn)行微衛(wèi)星位點檢測，凡是在癌癥組織或者息肉組織中發(fā)現(xiàn)有一個位點的片段大小與正常組織不同，則說明該位點為微衛(wèi)星不穩(wěn)定。結(jié)果顯示癌癥組織的微衛(wèi)星位點的核苷酸片段的大小有不同程度的減小，如BAT-59位點減小了13bp，BAT-52位點減小了23bp，BAT-56位點減小了10bp，BAT-55位點減小了5bp，BAT-57位點減小了11bp，表明結(jié)腸直腸癌組織在上述位點均出現(xiàn)MSI現(xiàn)象，說明該患者腫瘤組織為MSI-H。

綜上所述，本發(fā)明的用于檢測DNA錯配修復(fù)系統(tǒng)的試劑盒及其用途，該試劑盒包含微衛(wèi)星位點，該微衛(wèi)星位點能夠用于檢測癌癥DNA錯配修復(fù)系統(tǒng)，其靈敏度比免疫組化方法(IHC)方法更高，試劑盒重復(fù)性更好，能夠同時檢測多個MSI位點，提高了檢測效率，而且還能判斷腫瘤治療預(yù)后以及指導(dǎo)5-氟尿嘧啶(5-FU)和程序性死亡受體-1(PD-1)抗體的用藥。

盡管本發(fā)明的內(nèi)容已經(jīng)通過上述優(yōu)選實施例作了詳細(xì)介紹，但應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到上述的描述不應(yīng)被認(rèn)為是對本發(fā)明的限制。在本領(lǐng)域技術(shù)人員閱讀了上述內(nèi)容后，對于本發(fā)明的多種修改和替代都將是顯而易見的。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)由所附的權(quán)利要求來限定。

<110> 上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司

<120> 一種用于檢測DNA錯配修復(fù)系統(tǒng)的試劑盒及其用途

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<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 38

ggcgacagcg agactccgtc tca 23

<210> 39

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 39

ctgaggcagg agaatggcgt gaac 24

<210> 40

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 40

atgatgctgg cctcataaaa agagttag 28

<210> 41

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 41

tatcctagct tggcctgttt aagacc 26

<210> 42

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 42

tgaggcagga gaatggcgtg aa 22

<210> 43

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 43

tttaatatac ctgctgatca atgata 26

<210> 44

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 44

gacacatggg atcatagcaa a 21

<210> 45

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 45

ttgggcgaca gagcaagacg actc 24

<210> 46

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 46

atttggtcag tgggggctct gttaag 26

<210> 47

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 47

tcagcagctg aaagaaatct gagtac 26

<210> 48

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 48

gcgataccca aagtcaatag tc 22

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 49

gaagctgcag taagccgaga ttgt 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 50

gccctcttaa ctcccatgac attc 24

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 51

agcctgggcg acagagcgag tc 22

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 52

ctcggggctc gggagatgag tga 23

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<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 53

cagcctaggt aacagagcaa gacctttg 28

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 54

gtttgcgtga tttgcgtgga ctt 23

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 55

ctcctgcctc atcctcccga gta 23

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 56

ccgagatcac gccactgcac tcta 24

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<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 57

tctcatttga gtggtggaag tgactggt 28

<210> 58

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 58

tattctttcg ggatgtaatc tct 23

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<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 59

cccgtctcta ctaaaaatac taaaac 26

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<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 60

aaaccaacaa taaggcaacc tcttagtc 28

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<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

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tgccagagta gggtggtcca tggtactt 28

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<212> DNA

<213> 人工合成

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gcccaaaatg tgtttagtta gcttc 25

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<212> DNA

<213> 人工合成

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aggctgaagc aggagaatca cttaaaac 28

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<212> DNA

<213> 人工合成

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gccaagtgtc gcttgtaatt ctatt 25

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<212> DNA

<213> 人工合成

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gaatcttgtt tcggcctttg acctta 26

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<212> DNA

<213> 人工合成

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cgagatcacg ccaccgcact ctagc 25

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<213> 人工合成

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<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

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aagctctgtt tggcaagtgt taattgta 28

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<213> 人工合成

<400> 69

ttggaatgta ttctctgggt ttggcagt 28

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<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

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<210> 71

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<212> DNA

<213> 人工合成

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acctaggcaa taccatctaa ga 22

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

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gttgcctgtt cactctgata gtct 24

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

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agcctgggtg acagagcgag act 23

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<212> DNA

<213> 人工合成

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ttagagttat ttgttgggat gagaatct 28

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<212> DNA

<213> 人工合成

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ctgggcgaca gagcgagact cc 22

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<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 76

tctcctgcct tagcctcccg agtagc 26

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<212> DNA

<213> 人工合成

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tcctctccct aaaaagctcc ccctaag 27

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<212> DNA

<213> 人工合成

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aggtcaaggc tgcggtaagc tgtgatcg 28

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<213> 人工合成

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tccccacttt gtcctgcaca ctcctacc 28

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<213> 人工合成

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gggcgacaga gcgagactcc gtc 23

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<212> DNA

<213> 人工合成

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aagatttaat agacatgcgc agaacact 28

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

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ccagcctggg caaaagagca agt 23

<210> 83

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<213> 人工合成

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<213> 人工合成

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<211> 23

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 87

catggcattg gggacatgaa caca 24

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<212> DNA

<213> 人工合成

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cactgagcgc ttctagggac ttct 24

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<211> 24

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<213> 人工合成

<400> 89

cagcctaggt gacagagcaa gaca 24

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<211> 24

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 92

attaccaaca tgaaagggta ccaata 26