本發(fā)明屬于分子檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種聯(lián)合檢測禽流感H7N9和H9N2的四通道熒光定量PCR檢測方法及試劑盒。

背景技術(shù)：

在我國新發(fā)的人感染H7N9亞型病毒引起了廣泛的關(guān)注，病毒的常監(jiān)測、早診斷、預警成為極其重要工作。研究表明，禽源H9N2亞型禽流感病毒為H7N9亞型流感這一新型重組病毒提供了內(nèi)部基因。然而，雞源H9N2亞型禽流感病毒的流行和進化是如何促進新型禽流感H7N9出現(xiàn)的機制尚不清楚，中國農(nóng)業(yè)大學劉金華教授團隊對該機制進行了研究，研究表明在過去長達10多年中，多種H9N2基因型共同存在，G57基因型出現(xiàn)并隨著抗體特性變化更加適應(yīng)雞宿主。在2010～2013年期間，也就是新型禽流感病毒H7N9出現(xiàn)前期，H9N2亞型禽流感病毒G57基因型成為免疫雞農(nóng)場的主要基因型，并引起了雞場禽流感的廣泛爆發(fā)，最終為新型禽流感H7N9提供了內(nèi)部基因。禽農(nóng)場中H9N2病毒的流行和變化監(jiān)測可以為可能造成流感大流行的新型禽流感病毒出現(xiàn)提供重要的監(jiān)測和早期診斷預警。

隨著分子生物學的快速發(fā)展，多重PCR已廣泛應(yīng)用于禽病混合感染的鑒別診斷，其原理是設(shè)計能夠同時擴增出多種待測病原特定片段大小的多對引物，在PCR反應(yīng)體系中加入多對引物，能夠?qū)Χ喾N病原進行鑒別診斷。多重RT-PCR因其靈敏性、特異性和操作的簡單性被廣泛應(yīng)用于禽病的多重檢測，但結(jié)果判定需要電泳，費時費力，且反應(yīng)產(chǎn)物容易產(chǎn)生污染而導致假陽性，而多重PCR是靠片段的大小來區(qū)別的，一般到了三重以上，片段大小差別大，其每種病毒的擴增效率不一樣，造成結(jié)果存在偏差。熒光定量PCR技術(shù)融合了PCR的多種優(yōu)點，通過直接檢測PCR反應(yīng)過程中熒光信號的變化實現(xiàn)對目的分子的定量，不需要電泳檢測，并且整個過程完全閉管式操作，污染機率降低，避免了常規(guī)PCR容易造成的假陽性問題。相對常規(guī)PCR，熒光定量PCR在敏感性、特異性與速度等方面具有優(yōu)勢，但實時熒光PCR技術(shù)受到熒光種類及儀器自身的限制，最多只能對5個靶標進行檢測，且實驗成功的難度極大。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的在于提供一種用于聯(lián)合檢測禽流感H7N9和H9N2的熒光定量PCR引物組。

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種用于聯(lián)合檢測禽流感H7N9和H9N2的熒光定量PCR試劑盒。

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種用于聯(lián)合檢測禽流感H7N9和H9N2的熒光定量PCR檢測方法。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種用于聯(lián)合檢測禽流感H7N9和H9N2的熒光定量PCR引物組，其包括用于檢測禽流感H7N9亞型的H7基因的引物對及熒光探針、用于檢測禽流感H7N9亞型的N9基因的引物對及熒光探針、用于檢測禽流感H9N2亞型的H9基因的引物對及熒光探針、用于檢測禽流感H9N2亞型的N2基因的引物對及熒光探針，用于檢測H7、N9、H9、N2基因的熒光探針報告基團不相同。

作為優(yōu)選的，所述用于檢測禽流感H7N9亞型的H7基因的引物對及熒光探針的核苷酸序列如下所示：

H7-F：5’-TGCACTGCATGTTTCCATTCTT-3’(SEQ ID NO.1)；

H7-R：5’-GGCTACAAAGATGTGATACTTTGGTTTAG-3’(SEQ ID NO.2)；

H7-P：5’FAM-ATGAAAACAAGGCCCATTGCAATGGC-BHQ13’(SEQ ID NO.3)。

作為優(yōu)選的，所述用于檢測禽流感H7N9亞型的N9基因的引物對及熒光探針的核苷酸序列如下所示：

N9-F：5’-TCGCGCCCTGATAAGCT-3’(SEQ ID NO.4)；

N9-R：5’-GCATTCCACCCTGCTGTTG-3’(SEQ ID NO.5)；

N9-P：5’VIC-CCACTATCATCACCGCCCACAGTGT-BHQ13”(SEQ ID NO.6)。

作為優(yōu)選的，所述用于檢測禽流感H9N2亞型的H9基因的引物對及熒光探針的核苷酸序列如下所示：

H9-F：5’-CAATGGGGTTTGCTGCCT-3’(SEQ ID NO.7)；

H9-R：5’-TTATATACAAATGTTGCATCTGC-3’(SEQ ID NO.8)；

H9-P：5’TexasRed-TTCTGGGCCATGTCCAATGGTTCT-BHQ23’(SEQ ID NO.9)。

作為優(yōu)選的，所述用于檢測禽流感H9N2亞型的N2基因的引物對及熒光探針的核苷酸序列如下所示：

N2-F：5’-TGACACTGCACTTCAAGCAA-3’(SEQ ID NO.10)；

N2-R：5’-TTGGTTCACATGTCACTACTTGAT-3’(SEQ ID NO.11)；

N2-P：5’CY5-ATGAATGCAGCATCCCCTCGAAC-BHQ23’(SEQ ID NO.12)。

一種用于聯(lián)合檢測禽流感H7N9和H9N2的熒光定量PCR試劑盒，其包含上述的熒光定量PCR引物組。

所述試劑盒還包含病毒RNA提取液、Tth DNA聚合酶、四通道熒光定量PCR Mix、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品，所述四通道熒光定量PCR Mix中含有2×四通道熒光定量PCR buffer、dNTPs。

所述2×四通道熒光定量PCR buffer中含有以下成分：Tricine pH8.7、Mg(OAc)₂、KOAc、甘油、DMSO、N,N,N-三甲基甘氨酸。

一種聯(lián)合檢測禽流感H7N9和H9N2的四通道熒光定量PCR檢測方法，包括如下步驟：

1)提取待測樣品中的病毒RNA；

2)以得到的總RNA為模板，使用上述的熒光定量PCR引物組進行四通道熒光定量PCR

檢測；

3)反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)待測樣品的熒光Ct值判斷，待測樣品是否為禽流感病毒H7基因、

N9基因、H9基因、N2基因陽性。

四通道熒光定量PCR反應(yīng)條件為：

95℃1分鐘；58℃20分鐘；95℃1分鐘；

95℃10秒，58℃70秒，68℃10s，采集熒光信號，40個循環(huán)。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明方法能夠同時檢測出待測標本中禽流感病毒H7N9的H7基因和N9基因，以及禽流感病毒H9N2的H9基因和N2基因。由于該方法引入了特異性擴增引物和熒光探針，使得檢測的靈敏度和特異性得到很大程度的增強，從而避免了其他檢測方法特異性不高容易漏診和誤診的問題。同時，該試劑盒根據(jù)本方法原理制得的試劑盒，可方便地同時檢測出禽流感病毒H7N9的H7基因和N9基因，以及禽流感病毒H9N2的H9基因和N2基因，準確率高。

該方法使用Tth DNA聚合酶，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的Taq酶和MMLV酶的組合，在更高的溫度下進行逆轉(zhuǎn)錄，提升了四通道擴增這種復雜模版的擴增效果。因此該試劑盒具有廣泛的應(yīng)用前景，適合在各級動物衛(wèi)生監(jiān)督機構(gòu)、疾病控制單位等大規(guī)模篩查的推廣應(yīng)用。

附圖說明

圖1為四通道熒光PCR體系中禽流感病毒H7基因檢測的靈敏度實驗，從左到右依次為1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹cp/μl的標準品的擴增結(jié)果。由圖可知，H7基因檢測的靈敏度為1×10²cp/μl。

圖2為四通道熒光PCR體系中禽流感病毒N9基因檢測的靈敏度實驗，從左到右依次為1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹cp/μl的標準品的擴增結(jié)果。由圖可知，N9基因檢測的靈敏度為1×10²cp/μl。

圖3為四通道熒光PCR體系中禽流感病毒H9基因檢測的靈敏度實驗，從左到右依次為1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹cp/μl的標準品的擴增結(jié)果。由圖可知，H9基因檢測的靈敏度為1×10²cp/μl。

圖4為四通道熒光PCR體系中禽流感病毒N2基因檢測的靈敏度實驗，從左到右依次為1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹cp/μl的標準品的擴增結(jié)果。由圖可知，N2基因檢測的靈敏度為1×10²cp/μl。

圖5為四通道熒光PCR體系中禽流感病毒H7基因檢測的特異性實驗結(jié)果，檢測哈獸研H7抗原、H7N9棉拭子標本、H7N7棉拭子標本為陽性，檢測哈獸研H5N1抗原、H5N1疫苗、H9N2棉拭子標本、廣州永順NDV疫苗及陰性質(zhì)控品均為陰性。

圖6為四通道熒光PCR體系中禽流感病毒N9基因檢測的特異性實驗結(jié)果，檢測H7N9棉拭子標本為陽性，檢測H7N7棉拭子標本、哈獸研H5N1抗原、華農(nóng)H5N1疫苗、H9N2棉拭子標本、廣州永順NDV疫苗及陰性質(zhì)控品均為陰性。

圖7為四通道熒光PCR體系中禽流感病毒H9基因檢測的特異性實驗結(jié)果，檢測H9N2棉拭子標本為陽性，檢測H7N7棉拭子標本、哈獸研H5N1抗原、華農(nóng)H5N1疫苗、H7N9棉拭子標本、廣州永順NDV疫苗及陰性質(zhì)控品均為陰性。

圖8為四通道熒光PCR體系中禽流感病毒N2基因檢測的特異性實驗結(jié)果，檢測H9N2棉拭子標本為陽性，檢測H7N7棉拭子標本、哈獸研H5N1抗原、華農(nóng)H5N1疫苗、H7N9棉拭子標本、廣州永順NDV疫苗及陰性質(zhì)控品均為陰性。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的說明，但并不局限于此。

實施例1

1、特異性引物及探針的設(shè)計

根據(jù)禽流感病毒(Avian influenza virus)H1～H16的核酸序列，以及N1～N9的核酸序列，設(shè)計用于檢測禽流感病毒H7N9、H9N2基因的引物和探針(在life technology公司合成)。其序列如下：

2、標本采集和預處理

本方法及試劑盒適用標本類型包括禽類的組織、血清、咽拭子、分泌排泄物等。組織標本：無菌條件下取組織約100～200mg左右，置入1.5ml潔凈EP管中，保存待檢。血清：用一次性無菌注射器抽取受檢鳥靜脈血3-5ml，留取血清，保存待檢。咽及泄殖腔等拭子：用棉拭子取咽或泄殖腔分泌物，將拭子放入盛有1.0ml PBS的離心管中，立即送檢。分泌排泄物：無菌條件下采集，保存待檢。采集的標本應(yīng)該盡快送檢，或者保存于-20℃。

3、標本RNA提取

3.1RNA提取液的組分：

裂解液

洗滌液

3.2使用杭州萊楓生物生產(chǎn)的RNA純化柱進行純化，以如下步驟提取：

1)200μl標本加入500μl裂解液，室溫靜止1min；

2)12000rpm離心5分鐘，棄套管中液體；

3)加入600μL洗滌液，振蕩混勻；

4)12000rpm離心5分鐘，棄套管中液體；

5)加入600μL洗滌液，振蕩混勻；

6)12000rpm離心5分鐘，棄套管，換新的1.5mL離心管；

7)加入50μL DEPC處理水，振蕩混勻；

8)12000rpm離心5分鐘，管中液體即為所提取的RNA。

4、陽性質(zhì)控品的制備

H7N9假病毒陽性標準品序列如SEQ ID NO.13所示；H9N2假病毒陽性標準品序列如SEQ ID NO.14所示。

將二者分別提交廈門致善生物，合成載體、用MS2噬菌體包裝成假病毒顆粒并測定濃度。

返回的H7N9假病毒與H9N2假病毒，以1：1混合，作為試劑盒的陽性質(zhì)控品，-20±5℃條件下儲存。所得假病毒顆粒擴增前需進行RNA提取實驗。

5’-GCGGTTATAAAGATGTGATACTTTGGTTTAGCTTCGGGGCATCATGTTTCATACTTCTTGCCATTGCAATGGGCCTTGTCTTCATATGTGTGAAGAATGGAAACATGCGGTGCACTATTTGTATATAATCGCGCCCTGATAAGCTGGCCACTATCATCACCGCCCACAGTATACAACAGCAGGGTGGAATGCATTGGG-3’(SEQ ID NO.13)

5’-CAATGGGGTTTGCTGCCTTCTTGTTCTGGGCCATGTCCAATGGATCATGCAGGTGCAACATTTGTATATAATGACACTGCACTTCAAGCAAAATGAATGCAGCATCCCCTCGAACAATCAAGTAGTGACATGTGAACCAA-3’(SEQ ID NO.14)

5、陰性質(zhì)控品的制備

取純化水，高壓滅菌后，貯存于冷藏冰箱(2-8℃)，超過7天未分裝的轉(zhuǎn)至-20±5℃條件下儲存。

6、四通道熒光定量PCR擴增

熒光定量PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系總體積為25μl，組成如下：多通道熒光定量PCR Mix 20μl、DNA聚合酶1μl，以及提取標本RNA(或者陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品)4μl；其中四通道熒光定量PCR Mix中含有四通道熒光定量PCR buffer、dNTPs等成分。

2×四通道熒光定量PCR buffer中含有以下成分：

四通道熒光定量PCR Mix組成為：

四通道熒光定量PCR反應(yīng)條件為：

95℃1分鐘；58℃20分鐘；95℃1分鐘；

95℃10秒，58℃70秒，68℃10s，采集熒光信號，40個循環(huán)。

7、結(jié)果分析和判定

7.1結(jié)果分析條件設(shè)定

1)設(shè)置基線(baseline)：根據(jù)機型不同，設(shè)置3～15循環(huán)，6～15循環(huán)，特殊情況可對基線適當調(diào)整。

2)設(shè)置閾值(threshold):以閾值線剛超過陰性對照擴增曲線(無規(guī)則的噪音線)的最高點。

7.2結(jié)果判斷如下表：

實施例2靈敏度實驗

圖1為四通道熒光PCR體系中禽流感病毒H7基因檢測的靈敏度實驗，從左到右依次為1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹cp/μl的標準品的擴增結(jié)果。由圖可知，H7基因檢測的靈敏度為1×10²cp/μl。

圖2為四通道熒光PCR體系中禽流感病毒N9基因檢測的靈敏度實驗，從左到右依次為1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹cp/μl的標準品的擴增結(jié)果。由圖可知，N9基因檢測的靈敏度為1×10²cp/μl。

圖3為四通道熒光PCR體系中禽流感病毒H9基因檢測的靈敏度實驗，從左到右依次為1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹cp/μl的標準品的擴增結(jié)果。由圖可知，H9基因檢測的靈敏度為1×10²cp/μl。

圖4為四通道熒光PCR體系中禽流感病毒N2基因檢測的靈敏度實驗，從左到右依次為1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹cp/μl的標準品的擴增結(jié)果。由圖可知，N2基因檢測的靈敏度為1×10²cp/μl。

實施例3特異性實驗

圖5為四通道熒光PCR體系中禽流感病毒H7基因檢測的特異性實驗結(jié)果，檢測哈獸研H7抗原、H7N9棉拭子標本、H7N7棉拭子標本為陽性，檢測哈獸研H5N1抗原、H5N1疫苗、H9N2棉拭子標本、廣州永順NDV疫苗及陰性質(zhì)控品均為陰性。

圖6為四通道熒光PCR體系中禽流感病毒N9基因檢測的特異性實驗結(jié)果，檢測H7N9棉拭子標本為陽性，檢測H7N7棉拭子標本、哈獸研H5N1抗原、華農(nóng)H5N1疫苗、H9N2棉拭子標本、廣州永順NDV疫苗及陰性質(zhì)控品均為陰性。

圖7為四通道熒光PCR體系中禽流感病毒H9基因檢測的特異性實驗結(jié)果，檢測H9N2棉拭子標本為陽性，檢測H7N7棉拭子標本、哈獸研H5N1抗原、華農(nóng)H5N1疫苗、H7N9棉拭子標本、廣州永順NDV疫苗及陰性質(zhì)控品均為陰性。

圖8為四通道熒光PCR體系中禽流感病毒N2基因檢測的特異性實驗結(jié)果，檢測H9N2棉拭子標本為陽性，檢測H7N7棉拭子標本、哈獸研H5N1抗原、華農(nóng)H5N1疫苗、H7N9棉拭子標本、廣州永順NDV疫苗及陰性質(zhì)控品均為陰性。

以上實驗結(jié)果表明：本發(fā)明方法及試劑盒可方便地同時檢測出禽流感病毒H7N9的H7基因和N9基因，以及禽流感病毒H9N2的H9基因和N2基因，靈敏度和特異性得到很大程度的增強。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所

<120> 一種聯(lián)合檢測禽流感H7N9和H9N2的四通道熒光定量PCR檢測方法及試劑盒

<130>

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgcactgcat gtttccattc tt 22

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggctacaaag atgtgatact ttggtttag 29

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgaaaacaa ggcccattgc aatggc 26

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcgcgccctg ataagct 17

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcattccacc ctgctgttg 19

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccactatcat caccgcccac agtgt 25

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

caatggggtt tgctgcct 18

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttatatacaa atgttgcatc tgc 23

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ttctgggcca tgtccaatgg ttct 24

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tgacactgca cttcaagcaa 20

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ttggttcaca tgtcactact tgat 24

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

atgaatgcag catcccctcg aac 23

<210> 13

<211> 198

<212> DNA

<213> H7N9

<400> 13

gcggttataa agatgtgata ctttggttta gcttcggggc atcatgtttc atacttcttg 60

ccattgcaat gggccttgtc ttcatatgtg tgaagaatgg aaacatgcgg tgcactattt 120

gtatataatc gcgccctgat aagctggcca ctatcatcac cgcccacagt atacaacagc 180

agggtggaat gcattggg 198

<210> 14

<211> 140

<212> DNA

<213> H7N9

<400> 14

caatggggtt tgctgccttc ttgttctggg ccatgtccaa tggatcatgc aggtgcaaca 60

tttgtatata atgacactgc acttcaagca aaatgaatgc agcatcccct cgaacaatca 120

agtagtgaca tgtgaaccaa 140