本公開涉及生物技術領域，具體地，涉及一種貓傳染性腹膜炎病毒檢測用引物組和試劑盒及其檢測方法。

背景技術：

貓傳染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis viruses，F(xiàn)IPV)為不分節(jié)段、單股正鏈RNA病毒，屬尼多病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)，冠狀病毒屬(Coronavirus)，α冠狀病毒-1種(Alphacoronavirus-1)。該病毒引起的疾病為貓傳染性腹膜炎(Feline infectious peritoniti，F(xiàn)IP)，該疾病以腹膜炎、大量腹水聚積和高致死率為特征。FIP呈地方性流行，雖然發(fā)病率較低、多為隱性感染，但其病死率幾乎高達100％，相當于貓病中的“艾滋病”。

目前國內(nèi)臨床診斷FIP的方法包括病理學檢查、血清學檢測和RT-PCR檢測等。僅通過臨床癥狀進行診斷的方法，需要依賴于臨床癥狀的表現(xiàn)以及診斷者的經(jīng)驗，而患傳染性腹膜炎的貓初期癥狀不明顯，病程進展有較大差異，導致獲得的結果容易不準確，往往因誤診而貽誤治療最終導致病貓死亡。現(xiàn)有的常規(guī)RT-PCR方法是抽取腹腔液提取RNA后進行RT-PCR檢測，這種方法本身的敏感性極低，而同時由于FIPV在腹腔液中含量極少，非常容易導致漏檢，從而不能準確檢測出FIPV。

因此現(xiàn)有的貓傳染性腹膜炎病毒的檢測手段存在漏檢率高、敏感性低的缺陷，無法實現(xiàn)對病毒的快速準確檢測。

技術實現(xiàn)要素：

本公開的目的是克服現(xiàn)有的貓傳染性腹膜炎病毒檢測手段中存在的上述缺陷，提供一種新的貓傳染性腹膜炎病毒檢測用引物組和方法。

為達到以上目的，本公開第一方面：提供一種貓傳染性腹膜炎病毒檢測用引物組，其中，該引物組包括SEQ ID NO.1-4所示的引物。

本公開第二方面提供了一種貓傳染性腹膜炎病毒的檢測方法，該方法包括如下步驟：

(1)提取待測樣本的總RNA；

(2)對所述總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄獲得PCR模板；用SEQ ID NO.1-2所示的引物對所述PCR模板進行第一PCR擴增，獲得第一擴增產(chǎn)物；

(3)以所述第一擴增產(chǎn)物為模板，用SEQ ID NO.3-4所示的引物進行第二PCR擴增，獲得第二擴增產(chǎn)物；

(4)對所述第二擴增產(chǎn)物進行核酸電泳檢測，得到核酸電泳檢測的結果。

本公開第三方面提供一種貓傳染性腹膜炎病毒檢測試劑盒該試劑盒包括本公開第一方面所述的引物組。

本公開的第四方面還提供了本公開第一方面所述的引物組在制備檢測貓傳染性腹膜炎病毒的試劑盒中的用途。

通過上述技術方案本公開建立了新的貓傳染性腹膜炎病毒的檢測引物組和方法，能夠?qū)崿F(xiàn)現(xiàn)有檢測技術所無法完成的快速、特異、敏感的結果判定，顯著提高了對貓傳染性腹膜炎病毒的檢測效率，利用該方法獲得的作為中間結果的信息的效率、準確性和可靠性高，為盡早發(fā)現(xiàn)和有效防控貓傳染性腹膜炎病毒提供了重要的技術支持。

本公開的其他特征和優(yōu)點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細說明。

附圖說明

附圖是用來提供對本公開的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與下面的具體實施方式一起用于解釋本公開，但并不構成對本公開的限制。在附圖中：

圖1是實施例1中第一擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果；

其中，M：DL2000；1：空白對照；2-7：第一擴增產(chǎn)物。

圖2是實施例1中第二擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果；

其中，M：DL2000；1：空白對照；2-7：第二擴增產(chǎn)物。

圖3是實施例2中敏感性測試的檢測結果；

其中，M：DL2000；1：空白對照；2-14：依次為模板濃度1.363×10²ng/μL至1.363×10^-10ng/μL的RNA的第一擴增產(chǎn)物。

圖4是實施例2中敏感性測試的檢測結果；

其中，M：DL2000；1：空白對照；2-14：依次為模板濃度1.363×10²ng/μL-1.363×10^-10ng/μL的RNA的第二擴增產(chǎn)物。

圖5是實施例3中特異性測試的檢測結果；

其中，M：DL2000；1：FIPV標準毒株；2：犬冠狀病毒(CCoV)；3：豬流行性腹瀉病毒(PEDV)；4：空白對照。

具體實施方式

以下結合附圖對本公開的具體實施方式進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本公開，并不用于限制本公開。

一種貓傳染性腹膜炎病毒檢測用引物組，其中，該引物組包括SEQ ID NO.1-4所示的引物。

在所述引物組中，SEQ ID NO.2所示的引物可以作為逆轉(zhuǎn)錄引物對待測樣本的總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄從而獲得cDNA模板。

其中，SEQ ID NO.1-2所示的引物構成第一引物對，第一引物對能夠特異性的擴增FIPV標準毒株的一段基因序列，獲得片段長度為685bp的第一擴增產(chǎn)物。

其中，SEQ ID NO.3-4所示的引物構成第二引物對，第二引物對能夠以所述第一擴增產(chǎn)物為模板，特異性的擴增獲得片段長度為380bp的第二擴增產(chǎn)物。

本發(fā)明還提供了一種貓傳染性腹膜炎病毒的檢測方法，該方法包括如下步驟：

(1)提取待測樣本的總RNA；

(2)對所述總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄獲得PCR模板；用SEQ ID NO.1-2所示的引物對所述PCR模板進行第一PCR擴增，獲得第一擴增產(chǎn)物；

(3)以所述第一擴增產(chǎn)物為模板，用SEQ ID NO.3-4所示的引物進行第二PCR擴增，獲得第二擴增產(chǎn)物；

(4)對所述第二擴增產(chǎn)物進行核酸電泳檢測，得到核酸電泳檢測的結果。

在本公開中，當核酸電泳檢測的結果顯示第二擴增產(chǎn)物中具有長度為380bp的條帶時，可以判定待測樣本中存在貓傳染性腹膜炎病毒。如果沒有，則判定待測樣本中不存在貓傳染性腹膜炎病毒。

其中，步驟(1)中可以采用本領域公知的RNA提取方法，例如RNA提取試劑盒，獲得待測樣本的總RNA。所述待測樣本可以包括但不限于病毒、食品、排泄物、嘔吐物、血液、腹腔液、組織和細胞培養(yǎng)物等。在本公開的一種實施方式中，所述待測樣本為腹腔液。

可選的，步驟(2)逆轉(zhuǎn)錄所使用的逆轉(zhuǎn)錄引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。相比于使用隨機引物，以SEQ ID NO.2所示的序列作為逆轉(zhuǎn)錄引物能夠提高檢測結果的特異性。

在本公開的一種實施方式中，所述第一PCR擴增的體系為：PCR模板3μL，2×premix 12.5μL，上游引物(SEQ ID NO.1)1μl，下游引物(SEQ ID NO.2)1μL，加ddH₂O至25μL體系。

其中，在第一PCR擴增中SEQ ID NO.1-2所示的引物的最終使用濃度各自為0.3-0.5pmol/μL。

所述第一PCR擴增的反應程序為：

在本公開的一種實施方式中，所述第二PCR擴增的體系為：第一擴增產(chǎn)物3μL，2×premix 12.5μL，上游引物(SEQ ID NO.3)1μl，下游引物(SEQ ID NO.4)1μL，加ddH₂O至25μL體系。

其中，在第二PCR擴增中SEQ ID NO.3-4所示的引物的最終使用濃度各自為0.3-0.5pmol/μL。

所述第二PCR擴增的反應程序為：

可選的，所述核酸電泳檢測包括核酸凝膠電泳和/或核酸毛細管電泳。

本公開的一個方面還提供了一種貓傳染性腹膜炎病毒檢測試劑盒，該試劑盒包括本公開所述的引物組。

所述試劑盒還可以含有RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑、PCR反應試劑以及陽性對照和陰性對照中的至少一種。

本公開還提供了所述引物組在制備檢測貓傳染性腹膜炎病毒的試劑盒中的用途。

以下，結合實施例進一步詳細說明本公開。

以下實施例中所使用的SEQ ID NO.1-4所示的引物由哈爾濱博仕生物有限公司合成，引物序列及名稱如表1所示：

表1

實施例1

(1)樣品獲得

取6例根據(jù)臨床癥狀、血液檢查和腹水分析確診的患有貓傳染性腹膜炎的動物的腹腔液作為待測樣品。

(2)cDNA合成

總RNA提?。河貌《緳z測用RNA提取試劑盒(購自天根生化科技有限公司)對0.14mL待測樣品進行總RNA提?。?/p>

逆轉(zhuǎn)錄：以FIP-OR(SIQ ID NO.2)為逆轉(zhuǎn)錄引物，M-MuLV為逆轉(zhuǎn)錄酶(購自上海近岸科技有限公司)對總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，合成獲得cDNA模板。

(3)第一PCR擴增

以合成的cDNA為模板，以SEQ ID NO.1-2所示的核苷酸序列為引物進行第一PCR擴增，反應體系及反應程序如下：

反應體系：合成的cDNA模板3μL，2×premix(Takara寶生物工程(大連)有限公司)12.5μL，F(xiàn)IP-OF(10pmol/μL)1μL，F(xiàn)IP-OR(10pmol/μL)1μL，加ddH₂O至25μL體系。

反應程序：95℃預變性5min；95℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共32個循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸5min，反應結束獲得第一擴增產(chǎn)物；

取3μL的第一擴增產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，以ddH₂O為模板的樣品為空白對照，檢測結果如圖1所示。

(4)第二PCR擴增

以第一擴增產(chǎn)物為模板，以SEQ ID NO.3-4所示的核苷酸序列為引物進行第二PCR擴增，反應體系及反應程序如下：

反應體系：第一擴增產(chǎn)物1μL，2×premix(Takara寶生物工程(大連)有限公司)12.5μL，F(xiàn)IP-nF(10pmol/μL)1μL，F(xiàn)IP-nR(10pmol/μL)1μL，加ddH₂O至25μL體系。

反應程序：95℃預變性5min；95℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，32個循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸5min，反應結束獲得第二擴增產(chǎn)物。

取3μL第二擴增產(chǎn)物進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，以ddH₂O為模板的樣品為空白對照，檢測結果如圖2所示。

結果顯示，僅進行第一PCR擴增沒有得到預期的685bp的目的條帶。而在第一PCR擴增的基礎上進行第二PCR擴增，6例樣品均擴增得到了380bp的特異性條帶，空白對照沒有條帶。表示所檢測的樣本中均存在貓傳染性腹膜炎病毒。該檢測結果與床癥狀、血液檢查和腹水分析的結果一致，說明本公開所提供的引物和方法能夠準確的檢測樣本中的貓傳染性腹膜炎病毒。

實施例2

(1)樣品

取貓傳染性腹膜炎病毒標準毒株FIPV-1146(ATCC：VR-2126)總RNA，進行10倍濃度的梯度稀釋，使各梯度中FIPV-1146的濃度為1.363×10²ng/μL至1.363×10^-10ng/μL共13個稀釋度樣品。

(2)cDNA合成

逆轉(zhuǎn)錄：以FIP-OR為逆轉(zhuǎn)錄引物，M-MuLV為逆轉(zhuǎn)錄酶(購自上海近岸科技有限公司)對樣品進行逆轉(zhuǎn)錄，合成獲得cDNA模板。

(3)第一PCR擴增

以合成的cDNA為模板，以SEQ ID NO.1-2所示的核苷酸序列為引物進行第一PCR擴增，反應體系及反應程序如下：

反應體系：合成的cDNA模板3μL，2×premix(Takara寶生物工程(大連)有限公司)12.5μL，F(xiàn)IP-OF(10pmol/μL)1μL，F(xiàn)IP-OR(10pmol/μL)1μL，加ddH₂O至25μL體系。

反應程序：95℃預變性5min；95℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共32個循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸5min，反應結束獲得第一擴增產(chǎn)物；

取3μL的第一擴增產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，以ddH₂O為模板的樣品為空白對照，檢測結果如圖3所示。

(4)第二PCR擴增

以第一擴增產(chǎn)物為模板，以SEQ ID NO.3-4所示的核苷酸序列為引物進行第二PCR擴增，反應體系及反應程序如下：

反應體系：第一擴增產(chǎn)物1μL，2×premix(Takara寶生物工程(大連)有限公司)12.5μL，F(xiàn)IP-nF(10pmol/μL)1μL，F(xiàn)IP-nR(10pmol/μL)1μL，加ddH₂O至25μL體系。

反應程序：95℃預變性5min；95℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，32個循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸5min，反應結束獲得第二擴增產(chǎn)物。

取3μL第二擴增產(chǎn)物進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，以ddH₂O為模板的樣品為空白對照，檢測結果如圖4所示。

由圖4的結果可以得知，當將RNA的濃度稀釋至1.363×10^-3ng/μL時，利用本公開所提供的方法仍可觀察到目的條帶。相比于圖3僅進行第一PCR擴增的檢測結果(當RNA濃度稀釋至1.363×10^-1ng/μL時，可觀察到目的條帶)敏感性明顯提高。說明利用本公開所提供的方法能夠更準確敏感的實現(xiàn)樣品中貓傳染性腹膜炎病毒的檢測。

實施例3

(1)樣品

貓傳染性腹膜炎病毒標準毒株FIPV-1146(ATCC：VR-2126)，犬冠狀病毒CCoV MDJ-19(NCBI：KT192646)、豬流行性腹瀉病毒PEDV SD/QD/2015(NCBI：KU641638)。

(2)cDNA合成

逆轉(zhuǎn)錄：以FIP-OR為逆轉(zhuǎn)錄引物，M-MuLV為逆轉(zhuǎn)錄酶(購自上海近岸科技有限公司)對各樣品進行逆轉(zhuǎn)錄，合成獲得cDNA模板。

(3)第一PCR擴增

以合成的cDNA為模板，以SEQ ID NO.1-2所示的核苷酸序列為引物進行第一PCR擴增，反應體系及反應程序如下：

反應體系：合成的cDNA模板3μL(2.2×10³ng/μL)，2×premix(Takara寶生物工程(大連)有限公司)12.5μL，F(xiàn)IP-OF(10pmol/μL)1μL，F(xiàn)IP-OR(10pmol/μL)1μL，加ddH₂O至25μL體系。

反應程序：95℃預變性5min；95℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共32個循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸5min，反應結束獲得第一擴增產(chǎn)物；

(4)第二PCR擴增

以第一擴增產(chǎn)物為模板，以SEQ ID NO.3-4所示的核苷酸序列為引物進行第二PCR擴增，反應體系及反應程序如下：

反應體系：第一擴增產(chǎn)物1μL，2×premix(Takara寶生物工程(大連)有限公司)12.5μL，F(xiàn)IP-nF(10pmol/μL)1μL，F(xiàn)IP-nR(10pmol/μL)1μL，加ddH₂O至25μL體系。

反應程序：95℃預變性5min；95℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，32個循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸5min，反應結束獲得第二擴增產(chǎn)物。

取3μL第二擴增產(chǎn)物進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，以ddH₂O為模板的樣品為空白對照，檢測結果如圖5所示。

利用本公開的方法檢測CCoV時，沒有獲得目的條帶，且有雜帶；檢測PEDV時，未擴增出目的條帶。說明本公開所提供的方法特異性高，不會對其他近似毒株進行非特異性擴增。

以上結合附圖詳細描述了本公開的優(yōu)選實施方式，但是，本公開并不限于上述實施方式中的具體細節(jié)，在本公開的技術構思范圍內(nèi)，可以對本公開的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本公開的保護范圍。

另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重復，本公開對各種可能的組合方式不再另行說明。

此外，本公開的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本公開的思想，其同樣應當視為本公開所公開的內(nèi)容。

SEQUENCE LISTING

<110> 黑龍江八一農(nóng)墾大學

<120> 貓傳染性腹膜炎病毒檢測用引物組和試劑盒及其檢測方法

<130> 4564HLAU

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> This sequence is synthesized in lab.

<400> 1

tgtcattcta caaccccatt ac 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> This sequence is synthesized in lab.

<400> 2

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<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> This sequence is synthesized in lab.

<400> 3

tcgttatcgt attgtaaaag gc 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> This sequence is synthesized in lab.

<400> 4

ctaatttttc aagcacggct ac 22