本發(fā)明涉及分子診斷
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種檢測豬臍帶血豬傳染性胃腸炎病毒的Taqman實時熒光PCR試劑盒及其用途。
背景技術(shù)：
：豬傳染性胃腸炎(Transmissiblegastroenteritisofswine,TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissiblegastroenteritisvirus，TGEV)引起的豬腹瀉病，是具有高度接觸性、高死亡率、危害較大的傳染病，可導致2-3周齡以下的仔豬發(fā)生嚴重的腹瀉和嘔吐，5周齡以上的豬發(fā)病率和死亡率較低。本病已廣泛存在于歐洲、美洲、亞洲各國，20世紀60年代首次在我國豬群中發(fā)現(xiàn)該病。在我國，該病主要以暴發(fā)性和地方流行性兩種形式發(fā)生，2010年以來流行情況及危害程度日趨加深。TGEV經(jīng)常與豬流行性腹瀉病毒(PEDV)及豬輪狀病毒(PoRV)發(fā)生混合感染，給TGEV的診斷帶來了困難。TGEV是成套病毒目冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬具有囊膜的單鏈正向RNA病毒。TGEV有3種主要的結(jié)構(gòu)蛋白，分別是纖突蛋白(S)、核衣殼蛋白(N)和膜蛋白(M)?，F(xiàn)有技術(shù)檢測TGEV的方法包括血清學和分子診斷方法，血清學診斷方法包括以下方法：(1)中和試驗(SN)。1969年，Carbrey等人建立了中和試驗(SN)。病毒感染動物，動物機體的淋巴細胞識別到病毒抗原表面的抗原決定簇后，產(chǎn)生了對應(yīng)的中和抗體。這些抗體和病毒粒子特異性的結(jié)合，進一步阻止病毒粒子對動物機體的入侵和損害。感染TGEV的病豬，血清抗體通常1周后產(chǎn)生，并且抗體在動物體內(nèi)停留時間久，因此能夠用血清SN來檢測該病。血清中和試驗具有快速檢測的特點，然而該方法可能出現(xiàn)假陽性，特異性不強，可對大批量樣品進行巧步篩選。(2)免疫熒光法。1979年，錢永清等人建立了用免疫熒光技術(shù)診斷TGE的方法，進一步提供了快速栓測TGEV的方法。結(jié)果表明，多數(shù)接種TGEV的細胞其細胞膜和胞漿中出現(xiàn)黃綠色的巧光，陰性對照組細胞則被染成了紅色。(3)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。ELISA現(xiàn)已被廣泛用于TGEV的檢測中，包括間接ELISA、雙夾ELISA、競爭ELISA、阻斷ELISA和抗體捕捉ELISA等。外國學者也運用阻斷ELISA方法對TGEV和PRCV的抗體進行鑒別診斷，結(jié)果與SN結(jié)果對比，發(fā)現(xiàn)阻斷ELISA方法和病毒中和試驗的結(jié)果具有良好相關(guān)性，該ELISA方法具有良好的敏感性和特異性，但目前很少在臨床中使用。分子診斷方法包括以下方法：(1)環(huán)介導等溫擴增技術(shù)。Chen等人針對TGEVN基因保守的核酸片段設(shè)計了6種特異性引物，建立了TGEVN基因的LAMP檢測方法，該方法具有很高的特異性，與其他病毒無交叉反應(yīng)，比傳統(tǒng)PCR靈敏度離10倍。(2)聚合酶鏈式反應(yīng)檢測技術(shù)(PCR)。李軍等人針對TGEVS基因序列設(shè)計合成了一對引物，建立了RT-PCR診斷方法并進行了臨床應(yīng)用，并做了平行試驗，符合率為89％，證明了建立的該RT-PCR法更敏感，檢測結(jié)果更優(yōu)。Paton等人根據(jù)TGEV和PRCV的S基因設(shè)立了一對引物，建立了RT-PCR法，該方法利用兩種病毒S基因擴增產(chǎn)物長度不同，可將二者進行鑒別。同時，與病毒分離和抗原檢測ELISA作對比，RT-PCR法具有更高的靈敏度，此方法可以用于進一步確認對經(jīng)過免疫篩選試驗(如FAT、ELISA)的樣品。PCR技術(shù)大大提高TGEV診斷的敏感性和特異性，但是與實時熒光定量PCR相比，PCR方法靈敏性相對不足，操作過程中也相對易污染。(3)實時熒光定量PCR技術(shù)。實時熒光定量PCR能對病毒進行絕對和相對定量，在多方面發(fā)揮作用：用于疾病的檢測；實時監(jiān)測細胞培養(yǎng)病毒含量；用于病毒增殖動態(tài)的研討；對TGEV活疫苗病毒含量進行實時監(jiān)測以評價疫苗效用。但是以上血清學診斷方法存在以下缺點：(1)對豬群中存在的免疫耐受現(xiàn)象評估較困難，相對不能更加有效、直觀和高精準反映豬群的抗體水平。(2)無法定量，易出現(xiàn)假陽性，且血樣采集需要多人協(xié)助，且需要特殊設(shè)備，采集過程相對比較費時。原因在于：①血清學檢測方法是抗原和抗體反應(yīng)，僅檢測1次無法準確判斷豬群的感染狀況和排毒狀況；②血清學檢測抗體，檢測的抗體水平高低無法定量檢測分析，血清學僅能評價機體體液免疫產(chǎn)生的水平；③血清學評估豬群健康度、對無癥狀帶毒和免疫耐受的豬群評估存在技術(shù)上的瓶頸；④血清學需要采集前腔靜脈血，血樣采集相對費力、費時、且需要特殊設(shè)備輔助，多人協(xié)助。而分子診斷方法，不論普通PCR和熒光PCR方法存在以下缺陷和不足：(1)檢測過程復雜，技術(shù)要求高，易出現(xiàn)假陽性，環(huán)境污染嚴重；(2)分子診斷對樣品組織嗜性要求嚴格，如：傳染性胃腸炎病料需要采集糞便或腸道，采集樣品要求嚴格；(3)該診斷方法僅能評估本樣品的情況，而無法同步精準診斷2個豬群的情況等；(4)普通PCR除存在以上缺點外，還無法定量，操作繁瑣等。豬屬于上皮絨毛胎盤，豬胎盤生理正常的結(jié)構(gòu)即血胎屏障，胎盤屏障的存在使正常的臍帶血內(nèi)不存在任何病原和抗體等大分子物質(zhì)。通過采用從仔豬臍帶血中檢測TGEV來評價母豬感染TGEV的情況，同時診斷出生仔豬感染豬傳染性胃腸炎的發(fā)病情況，更加科學、直接有效診斷方法，采集臍帶血診斷是指導產(chǎn)房仔豬腹瀉的防控最為有效的診斷方法。當前在規(guī)?；i場出現(xiàn)疑似豬傳染性胃腸炎的疫情后，通常診斷方法是送檢患病豬的病料，包括患豬腸道淋巴結(jié)、腸道內(nèi)容物和新鮮糞便，利用普通PCR或熒光PCR方法進行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果，結(jié)合該豬場其他情況給出診斷報告并制定疫病防控計劃。但是由于目前所用普通PCR或熒光PCR方法存在以上的缺陷，導致診斷結(jié)果對豬場疫病防控的指導意義有一定的局限性。在實際生產(chǎn)中，由于TGEV病毒不能很好的適應(yīng)細胞，且細胞病變不顯著，病毒分離難度大；TGEV感染與PEDV感染的臨床癥狀幾乎一樣，很難進行臨床鑒別診斷；但在臍帶血運用熒光PCR檢測技術(shù)檢測TGEV，是疾病的預警、診斷和評估最為有效的診斷方法，而快速精準檢測臍帶血中的豬傳染性肺腸炎病毒難度相對很大，由于1)溶血因素對檢測效果影響極大，2)TGEV病毒屬于單股正鏈RNA病毒，易變異，3)無論PCR和熒光PCR技術(shù)存在以上方法的缺陷。對于疾病的診斷和防控，需要建立一種快速鑒別檢測臍帶血豬傳染性肺腸炎病毒的方法，不僅可以對母豬疫苗株的安全評價及仔豬疾病的快速準確診斷，及時制定防控計劃，具有十分重要的臨床意義，而且可根據(jù)臍帶血檢測結(jié)果評估豬群TGEV野毒感染狀況，開展豬傳染性胃腸炎疾病的預警、診斷，達到規(guī)模化豬場豬傳染性胃腸炎疾病的防控。因此，亟待建立一種可以精準檢測豬臍帶血豬傳染性胃腸炎病毒的方法。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提出一種檢測豬臍帶血豬傳染性胃腸炎病毒的Taqman實時熒光PCR試劑盒及其用途。該試劑盒具有靈敏度高、特異性好、抗溶血、重復性優(yōu)、檢測結(jié)果快速客觀準確等優(yōu)點，通過檢測臍帶血中的TGEV，能同時反映母、仔豬豬傳染性胃腸炎病毒帶毒和排毒狀況，母豬健康狀況，評估母豬豬傳染性胃腸炎疫苗的免疫效果，有益于對群體豬傳染性胃腸炎疾病的預警、診斷和免疫情況的早期預警評判，進一步有助于豬場做好該疾病的預警、防控工作?；谏鲜瞿康?，本發(fā)明提供的一種檢測豬臍帶血豬傳染性胃腸炎病毒的Taqman實時熒光PCR試劑盒，包括擴增引物和特異性熒光探針，所述擴增引物和特異性熒光探針的序列如下所示：上游擴增引物：5’-GCTGAAGGTGCTATTATATGC-3’，其為SEQIDNO:1序列；下游擴增引物：5’-GCCTCTGAATTAGAAGGAC-3’，其為SEQIDNO:2序列；特異性熒光探針：FAM-5’-CTCACCACCTAYTACCACCAC-3’-TAMRA，其為SEQIDNO:3序列，其中，Y＝C/T，F(xiàn)AM為熒光報告基因，TAMRA為熒光淬滅基因。特異性熒光探針中Y為兼并堿基，使本發(fā)明的檢測方法的檢測范圍更廣泛。合理的引物設(shè)計和熒光探針設(shè)計是成功應(yīng)用實時熒光PCR技術(shù)的關(guān)鍵。引物和探針的特異性對反應(yīng)有很大影響，如果引物和探針特異性不高，可能在擴增構(gòu)成中產(chǎn)生非靶標條帶，影響檢測結(jié)果的判定。利用本發(fā)明的引物和探針建立的實時熒光PCR方法能鑒別豬臍帶血中的豬傳染性胃腸炎病毒疫苗株和野毒株。采用實時熒光PCR方法鑒別豬臍帶血中的豬傳染性胃腸炎病毒疫苗株和野毒株，關(guān)鍵是需要針對兩者所存在的序列差異片段，設(shè)計得到特異性的引物和探針。TGEV感染與PEDV感染的臨床癥狀幾乎一樣，很難進行臨床鑒別診斷；TGEV病毒不能很好的適應(yīng)細胞，且細胞病變不顯著，病毒分離難度大；對于疾病的診斷和防控，需要建立一種快速鑒別診斷TGEV的方法。但是TGEV病毒屬于單股正鏈RNA病毒，近些年來TGEV病毒已發(fā)生變異，所以設(shè)計檢測范圍更廣泛、特異性更強的引物和探針難度很大。發(fā)明人針對TGEV在NCBI公布的全部基因序列，進行基因序列的比對，發(fā)現(xiàn)TGEV的三種基因片段(3b基因、N基因和S基因)相對比較保守，然后分別對3b基因、N基因和S基因進行引物和探針的設(shè)計，并根據(jù)擴增結(jié)果最終篩選得到本發(fā)明的引物和探針，該引物和探針的廣泛性和特異性強，靈敏性好，用于擴增TGEVS基因，檢測結(jié)果能特異性區(qū)分TGEV與豬流行性腹瀉病毒(PEDV)。本發(fā)明引物和探針設(shè)計在TGEVS基因上，考慮到擴增的TGEV的范圍更寬，設(shè)計兼并堿基，即本發(fā)明的引物和探針含有兼并堿基，因此該引物和探針的廣泛性和特異性強，靈敏性好，用于擴增S基因，檢測結(jié)果能特異性區(qū)分TGEV疫苗毒和TGEV野毒，并能夠特異性區(qū)分TGEV與PEDV。另外，結(jié)合豬胎盤的生理結(jié)構(gòu)，豬屬于上皮絨毛胎盤，豬胎盤生理正常的結(jié)構(gòu)即血胎屏障，胎盤屏障的存在使正常的臍帶血內(nèi)不存在任何病原和抗體等大分子物質(zhì)，即使母源抗體(如IgG，12nm)都不能通過此胎盤屏障，所以成熟的PEDV粒子，PEDV病毒的直徑為60-160nm，很難直接穿越胎盤屏障感染胎兒，也是一道天然的保護屏障?？傊捎脧淖胸i臍帶血中檢測TGEV-S基因來評價母豬豬傳染性胃腸炎野毒帶毒和排毒狀況，仔豬在母豬體內(nèi)感染狀況和反饋母豬的健康狀況，是一種更加科學、直接和有效的診斷豬傳染性胃腸炎疾病、評估豬傳染性胃腸炎疫苗保護力水平和疾病預警方面的方法之一，在規(guī)?；i場的豬傳染性胃腸炎病的預警、防控過程中起到更加可靠的科學技術(shù)支撐。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述上游擴增引物、所述下游擴增引物和所述特異性熒光探針的摩爾比為3:3:2。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述上游擴增引物、所述下游擴增引物和所述特異性熒光探針在所述試劑盒中的終濃度均為0.3～0.5μM。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述試劑盒還包括陰性對照、陽性對照、2×熒光定量Mixture。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述陰性對照為無DNA酶的ddH2O；所述陽性對照為含有豬傳染性胃腸炎病毒S基因序列的克隆質(zhì)粒pEASY-T1-TGEV-S，克隆質(zhì)粒pEASY-T1-TGEV-S的終濃度為1.0×105copies/μl～1.0×107cop-ies/μl。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述豬傳染性胃腸炎病毒S基因的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述克隆質(zhì)粒采用以下方法制備得到：利用SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物序列擴增豬傳染性胃腸炎病毒S基因序列，示的引物序列擴增豬傳染性胃腸炎病毒S基因序列酶切后與pEASY-T1載體連接，篩選陽性克隆，測序正確的克隆質(zhì)粒命名為pEASY-T1-TGEV-S。進一步的，本發(fā)明還提供了所述的檢測豬臍帶血豬傳染性胃腸炎病毒的Taqman實時熒光PCR試劑盒的使用方法，包括以下步驟：(1)使用所述的實時熒光PCR試劑盒進行PCR擴增時，實時熒光PCR反應(yīng)體系以20μL計為：0.3μM的SEQIDNO:1所示的上游擴增引物：0.6μL；0.3μM的SEQIDNO:2所示的下游擴增引物：0.6μL；0.4μM的SEQIDNO:3所示的特異性熒光探針：0.4μL；2×熒光定量Mixture：10μL；RNA模板：2μL；ddH2O：補足至20μL；PCR的反應(yīng)條件為：95℃預變性1min；94℃變性15Sec，58℃退火45Sec，62℃延伸2sec，收集熒光，共45個循環(huán)；然后25℃延伸10sec，最后4℃保護，結(jié)束反應(yīng)；(2)結(jié)果分析：根據(jù)擴增結(jié)果判定：陰性對照擴增無Ct值，陽性對照擴增Ct值≤38時，則結(jié)果判定成立；Ct值≤40，則判斷為豬傳染性胃腸炎病毒陽性；無Ct值顯示，則判斷為豬傳染性胃腸炎病毒陰性，豬傳染性胃腸炎病毒疫苗免疫成功。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述RNA模板采用以下方法制備得到：(1)取50-100mg豬臍帶血置1.5mlEP管中，加入1ml裂解液充分勻漿，室溫靜置10min；所述裂解液的成分及配比如下：①鹽酸胍4-6M；②十二烷基磺酸鈉SDS0.1-0.2％；③吐溫201-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP401-2％；(2)加入0.6ml異丙醇和10μL磁珠，振蕩15s，靜置2min；(3)將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；(4)加入0.5ml異丙醇，將EP管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min；(5)將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；(6)加入1ml質(zhì)量百分比濃度為70％的乙醇溶液，輕輕洗滌沉淀；將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；(7)晾干，加入適量的DEPCH2O溶解，56℃促溶10～15min；(8)快速電泳檢測RNA完整性。在本發(fā)明中，臍帶血溶血對熒光PCR檢測會產(chǎn)生影響，使用鹽酸胍、SDS、吐溫-20和NP-40、異丙醇等核酸提取試劑，可以解決臍帶血溶血的問題。在本發(fā)明中，為了防止核酸污染引起假陽性，在熒光PCR擴增體系中加入UNG酶防污染體系，確保了檢測結(jié)果的真實性。更進一步的，本發(fā)明還提供了所述的試劑盒在制備檢測豬臍帶血豬傳染性胃腸炎病毒的Taqman實時熒光PCR試劑中的用途。本發(fā)明應(yīng)用qPCR方法檢測豬傳染性胃腸炎病毒的工作原理：由于豬屬于上皮絨毛胎盤，母豬和胎兒獨立血液循環(huán)系統(tǒng)，之間存在血胎盤屏障的緣故，正常的“臍帶血”是不含病原體和抗體物質(zhì)的即無存在任何各種病原的相關(guān)的基因片段，因此可通過檢測“臍帶血”中是否存在豬TGEV來判斷帶毒不發(fā)病母豬的情況，評價母豬的免疫水平及帶毒情況，評估仔豬感染豬TGEV情況。具體步驟為：(1)樣品采集；(2)樣品處理；(3)RNA提取：按商業(yè)試劑盒說明書操作；(4)qPCR：利用本發(fā)明設(shè)計的特異性引物和探針進行qPCR反應(yīng)；(5)判定結(jié)果。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的試劑盒具有以下有益效果：(1)采用本發(fā)明設(shè)計的引物和探針所建立的實時熒光PCR方法可對仔豬臍帶血中的豬傳染性胃腸炎病毒野毒感染情況做診斷，從而可以評價母豬豬傳染性胃腸炎疫苗的保護力，而且可以預測和預警仔豬感染豬傳染性胃腸炎病毒野毒的狀況，為疾病防控提供有效的科學依據(jù)。(2)本發(fā)明的的實時熒光PCR方法更能直接，有效、綜合評價疫苗免疫母豬后的效果，與傳統(tǒng)的血清學抗體檢測評估相比更具有優(yōu)勢，該法也是血清學抗體評估疫苗效果的有效的補充，是非常好的疫苗評估質(zhì)量、免疫效果和免疫程序優(yōu)化的有力工具，可進一步推廣和臨床應(yīng)用。(3)使用本發(fā)明的的實時熒光PCR方法進行仔豬臍帶血檢測，即可鑒別豬傳染性胃腸炎病毒野毒株和豬傳染性胃腸炎病毒疫苗株，根據(jù)鑒別結(jié)果制定相應(yīng)的防控策略，最終達到最終凈化該病的目的。(4)本發(fā)明的實時熒光PCR方法具有特異性強、靈敏度高、抗干擾能力強、廣泛性強、可重復性好等優(yōu)點。該方法檢測過程中需要儀器設(shè)備相對簡單，不需要電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)及其分析軟件；檢測過程簡便，檢測時間短，做一次病原檢測僅需要3小時；結(jié)果相對可靠，不需要電泳，空氣中氣溶膠相對較少，不易污染；技術(shù)操作要求低，可以在基層大量推廣；可以相對容易質(zhì)量控制，易于標準化。附圖說明圖1為本發(fā)明檢測豬臍帶血豬傳染性胃腸炎病毒的流程圖；圖2為本發(fā)明樣品中模板RNA的非變性瓊脂糖電泳圖；其中，M：Marker，泳道1-6：樣品中模板RNA；圖3為本發(fā)明陽性對照10倍稀釋的梯度標準曲線；圖4為本發(fā)明敏感性檢測結(jié)果圖；圖5為本發(fā)明特異性檢測結(jié)果圖；圖6為本發(fā)明重復性檢測結(jié)果圖。具體實施方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進一步詳細說明。實施例1本發(fā)明診斷豬臍帶血豬傳染性胃腸炎病毒的流程圖如圖1所示。具體包括以下步驟：(1)樣品采集；(2)樣品處理；(3)RNA提取；(4)qPCR：利用本發(fā)明設(shè)計的特異性引物和探針進行qPCR反應(yīng)；(5)判定結(jié)果。1.樣品采集(1)臍帶血樣品采集a.取干凈的青霉素瓶和瓶塞，清洗干凈，煮沸滅菌30分鐘，烘干后收集備用；b.當仔豬出生時，將每頭母豬分娩的所有仔豬的“臍帶血”都擠到一個干凈的青霉素瓶中，每頭仔豬3-5滴即可，將其“臍帶血”擠到青霉素瓶，密封；注意事項：①必須要采集同窩母豬產(chǎn)的所有的仔豬，避免同窩母豬所產(chǎn)仔豬的個體差異造成漏檢；②可以雙人操作，也可以單獨操作，若仔豬臍帶血不便擠出，可以將臍帶剪成幾段再操作即可；③若母豬分娩出現(xiàn)木乃伊，死胎時，同窩仔豬臍帶血重點檢測；④弱仔的臍帶血可以另外單獨再收集一份，重點檢測；c.臍帶血收集完后蓋好瓶塞，用標簽紙或者醫(yī)用白膠布在青霉素瓶做好標記，注明采集時間、母豬耳號、胎次等信息；d.將收集的臍帶血的青霉素瓶放至-20°冰箱冷凍保存，送至實驗室檢測，并附上采集臍帶血樣品的數(shù)量、母豬耳號、需要檢測項目的清單。(2)病料樣品(扁桃體、腎臟、肺臟和淋巴結(jié)等)A、剖解取內(nèi)臟：將患病豬剖解，取出完整的上述內(nèi)臟，放置在同一個干凈塑料袋內(nèi)。B、記錄：將裝有內(nèi)臟的塑料袋密封，貼標簽并記錄發(fā)病豬的日齡、體重、品種、臨床癥狀等信息。C、將采集的病料樣品集中送至實驗室，并附上所記錄的信息。2.樣品中模板RNA提取具體步驟如下：(1)取50-100mg豬臍帶血置1.5mlEP管中，加入1ml裂解液充分混勻，室溫靜置10min；裂解液的成分及配比如下：①鹽酸胍4-6M；②十二烷基磺酸鈉SDS，其在裂解液中的質(zhì)量分數(shù)為0.1-0.2％；③吐溫20，其在裂解液中的質(zhì)量分數(shù)為1-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP40，其在裂解液中的質(zhì)量分數(shù)為1-2％；(2)加入0.6ml異丙醇和10μL磁珠(購自賽默飛公司)，振蕩15s，靜置2min；(3)將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；(4)加入0.5ml異丙醇，將EP管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min；(5)將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；(6)加入1ml質(zhì)量百分比濃度為70％的乙醇溶液，輕輕洗滌沉淀；將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；(7)晾干，加入適量的DEPCH2O溶解，56℃促溶10～15min；(8)快速電泳檢測RNA完整性。本發(fā)明在RNA提取環(huán)節(jié)中，使用鹽酸胍、SDS、吐溫－20，NP－40，異丙醇和質(zhì)量百分比濃度為70％的乙醇溶液等洗滌，可以有效降低去除溶血的干擾，獲得高質(zhì)量的核酸。依據(jù)上述方法提取6份隨機臍帶血樣品總RNA，RNA經(jīng)非變性瓊脂糖電泳后均能形成3條清晰條帶，分別為28S、18S與5.8/5S，條帶間拖帶不明顯，不見明顯蛋白和DNA污染，表明RNA提取完整，結(jié)果見圖2。RNA經(jīng)核酸蛋白檢測儀檢測，濃度均能達到175ng/μl以上，A260/A280比值均在1.9-2.0之間，表明RNA純度高、完整性好，具體數(shù)據(jù)見表1。表1RNA質(zhì)量檢測結(jié)果樣品編號體積(μl)濃度(ng/μl)總量(μg)A260/A280質(zhì)量評價0015026013.01.90合格0025025812.91.92合格0035023811.91.93合格0045021010.51.91合格005501758.81.96合格0065031815.91.95合格3.引物和熒光探針的的篩選采用實時熒光PCR方法檢測豬臍帶血豬傳染性胃腸炎病毒，其引物和探針設(shè)計是關(guān)鍵。TGEV感染與PEDV感染的臨床癥狀幾乎一樣，很難進行臨床鑒別診斷；TGEV病毒不能很好的適應(yīng)細胞，且細胞病變不顯著，病毒分離難度大；TGEV病毒屬于單股正鏈RNA病毒，病毒的直徑為60-160nm。近些年來TGEV病毒已發(fā)生變異，所以設(shè)計檢測范圍更廣泛、特異性更強的引物和探針難度很大。發(fā)明人針對TGEV病毒的3種基因片段(3b基因、N基因和S基因)進行三組引物和探針的設(shè)計，具體見表2，并根據(jù)擴增結(jié)果進行三組引物和探針的對比。表2為了使擴增的TGEV基因的范圍更寬，設(shè)計兼并堿基，根據(jù)擴增結(jié)果進行比較分析，最終選擇敏感性非常好的第三組引物和探針，用于擴增TGEV的S基因。最終篩選到的特異性引物和特異性熒光探針序列如下：上游擴增引物：5’-GCTGAAGGTGCTATTATATGC-3’(SEQIDNO:1)；下游擴增引物：5’-GCCTCTGAATTAGAAGGAC-3’(SEQIDNO:2)；特異性熒光探針：FAM-5’-CTCACCACCTAYTACCACCAC-3’-TAMRA(SEQIDNO:3)，其中，Y＝C/T，F(xiàn)AM為熒光報告基因，TAMRA為熒光淬滅基因。上述引物和特異性熒光探針由華大基因合成并進行標記，用于擴增豬傳染性胃腸炎病毒S基因序列，目的片段為134bp左右，豬傳染性胃腸炎病毒S基因的核苷酸序列如下所示。GCTGAAGGTGCTATTATATGCATTTGCAAGGGCTCACCACCTACTACCACCACAGAATCTAGTTTGACTTGCAATTGGGGTAGTGAGTGCAGGTTAAACCATAAGTTCCCTATATGTCCTTCTAATTCAGAGGC(SEQIDNO:4)。4.陽性對照質(zhì)粒的構(gòu)建與制備(1)按照商業(yè)試劑盒操作說明書提取豬傳染性胃腸炎病毒RNA；以SEQIDNO:1和SEQIDNO:2作為特異性引物擴增豬傳染性胃腸炎病毒S基因序列，反應(yīng)條件為：94℃預變性1min；94℃變性15Sec，58℃退火2Sec，62℃延伸20Sec，共45個循環(huán)；然后25℃延伸10sec，最后4℃保護，結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物于2％的瓊脂糖凝膠中進行電泳鑒定；(2)PCR產(chǎn)物的純化、克隆及序列分析：PCR產(chǎn)物用AXYGEN公司的AxyPrepDNAGelExcractionKit膠回收試劑盒回收，然后酶切后與同樣酶切的pEASY-T1克隆載體進行連接，連接后轉(zhuǎn)化Trans1-T1PhageResistant化學感受態(tài)細胞，涂布于含IPTG和X-gal的LB培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)12h-18h。經(jīng)藍白斑篩選后，用OMEGA公司的PlasmidMiniKit1質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，然后用引物進行擴增和測序，測序后比對成功的克隆質(zhì)粒命名pEASY-T1-TGEV-S?？寺≠|(zhì)粒用質(zhì)粒小提試劑盒進行提純，獲得定量標準質(zhì)粒。根據(jù)蛋白核酸測定儀測定A260和A280值計算質(zhì)粒濃度，并換算為質(zhì)?？截悢?shù)，克隆質(zhì)粒終濃度為1.0×105copies/μl～1.0×107copies/μl。5.本發(fā)明試劑盒的成分上游擴增引物：5’-GCTGAAGGTGCTATTATATGC-3’(SEQIDNO:1)；下游擴增引物：5’-GCCTCTGAATTAGAAGGAC-3’(SEQIDNO:2)；特異性熒光探針：FAM-5’-CTCACCACCTAYTACCACCAC-3’-TAMRA(SEQIDNO:3)，其中，Y＝C/T，F(xiàn)AM為熒光報告基因，TAMRA為熒光淬滅基因。陽性對照：含有豬傳染性胃腸炎病毒S基因序列的克隆質(zhì)粒pEASY-T1-TGEV-S；陰性對照：無DNA酶的ddH2O；2×熒光定量Mixture(含UNG酶系統(tǒng))。在本發(fā)明中，為了防止核酸污染引起假陽性，在熒光PCR擴增體系中加入UNG酶防污染體系，確保了檢測結(jié)果的真實性。6.標準曲線的制作對克隆質(zhì)粒進行10倍梯度稀釋，使其為：108-101copies/μl，每個梯度重復三次進行實時熒光定量PCR。根據(jù)擴增結(jié)果制作標準曲線。圖3為本發(fā)明陽性對照10倍稀釋的梯度制作標準曲線圖，其中該標準曲線的參數(shù)如下：斜率：-3.31921，截距：41.79840，相關(guān)系數(shù)：-0.99970，擴增效率：1.00114。制作標準曲線的相關(guān)系數(shù)R2大于0.99，斜率位于-3.3－-3.4之間，PCR擴增效率E位于1.0－1.1之間。7.診斷豬臍帶血豬傳染性胃腸炎病毒本發(fā)明的實時熒光PCR反應(yīng)體系和實時熒光PCR的反應(yīng)條件如下：(1)實時熒光PCR反應(yīng)體系以20μL計為：0.3μM的SEQIDNO:1所示的上游擴增引物：0.6μL；0.3μM的SEQIDNO:2所示的下游擴增引物：0.6μL；0.4μM的SEQIDNO:3所示的特異性熒光探針：0.4μL；2×熒光定量Mixture(TOYOBOMixture)：10μL；RNA模板：2μL；ddH2O：補足至20μL?；靹蚝笊w好管蓋，轉(zhuǎn)移到擴增區(qū)。同時設(shè)有陽性對照和陰性對照，陽性對照克隆質(zhì)粒：2μL，其余組分相同；陰性對照無DNA酶的ddH2O：2μL，其余組分相同。(2)實時熒光PCR的反應(yīng)條件95℃預變性1min；94℃變性15Sec，58℃退火45Sec，62℃延伸20Sec，收集熒光，共45個循環(huán)；然后25℃延伸10Sec，最后4℃保護，結(jié)束反應(yīng)。8.結(jié)果分析：根據(jù)擴增結(jié)果判定：每次試驗的過程都要加入陽性對照及陰性對照。在陰性對照擴增無Ct值，陽性對照擴增Ct值≤38時，則結(jié)果判定成立，即陽性結(jié)果出現(xiàn)典型的擴增曲線；并且制作的標準曲線如圖3所示，R2大于0.99，斜率位于-3.3－-3.4之間，PCR擴增效率E位于1.0－1.1之間。若Ct值≤40，則判斷為豬傳染性胃腸炎病毒陽性，即仔豬臍帶血中感染豬傳染性胃腸炎病毒野毒，表明母豬存在排毒現(xiàn)象，疫苗保護力存在一定不足，建議加強免疫接種或調(diào)整免疫程序；若無Ct值顯示，則判斷為豬傳染性胃腸炎病毒陰性，即仔豬臍帶血中沒有感染豬傳染性胃腸炎病毒，表明豬傳染性胃腸炎疫苗免疫母豬保護力很好，且仔豬無感染豬傳染性胃腸炎病毒，疫苗免疫效果和免疫程序很到位。若陽性對照Ct值>38或無顯示，則該樣本的檢測結(jié)果無效，應(yīng)查找并排除原因，并對此樣本進行重復實驗。實施例2靈敏度研究以陽性對照克隆質(zhì)粒評價本發(fā)明的試劑盒的靈敏度，將克隆質(zhì)粒進行10倍梯度稀釋，檢測范圍為108-101copies/μl。結(jié)果表明，該方法的檢測范圍為108-101copies/μl，在此范圍的豬傳染性胃腸炎病毒含量可以得到可靠的結(jié)果，即該方法的靈敏度可以檢測到10個拷貝的豬傳染性胃腸炎病毒病毒含量的樣品。檢測結(jié)果見圖4。實施例3特異性研究為了檢測本發(fā)明試劑盒的特異性，利用本發(fā)明的試劑盒檢測豬細小病毒，豬輪狀病毒，豬繁殖與呼吸綜合征病毒，豬圓環(huán)病毒，豬流行性腹瀉病毒，豬乙型腦炎病毒，豬偽狂犬病毒等7種病毒。檢測結(jié)果表明：本發(fā)明的試劑盒僅對仔豬臍帶血中TGEVS基因進行擴增，表明本發(fā)明試劑盒能特異性擴增TGEV，而不與其它核酸發(fā)生交叉反應(yīng)。檢測結(jié)果見圖5。實施例4重復性研究選用陽性對照克隆質(zhì)粒106、105、104個copies/μl,對每個濃度的樣本做3個重復，結(jié)果不同核酸濃度的檢測Ct值標準差≤0.13和≤0.09，變異系數(shù)≤0.46％，具有較好的重復性。檢測結(jié)果見表3和圖6。表3實時熒光PCR檢測豬傳染性胃腸炎病毒的重復性試驗質(zhì)?？截悢?shù)(copies/μl)106105104Ct121.4324.8128.16Ct221.624.9628.27Ct321.4925.0328.42Ctmean21.5124.9328.28SD0.090.110.13CV0.40％0.45％0.46％實施例5準確性研究同時采用本發(fā)明的試劑盒以及普通PCR對各10份已知陽性和陰性樣品進行檢測以及對未知的臨床73份仔豬臍帶血進行檢測，檢測結(jié)果見表4和表5。(1)已知陽性和陰性樣品各10份的臨床驗證表4采用本發(fā)明試劑盒以及普通PCR對臨床樣品進行檢測結(jié)果的比較(2)未知的臨床73份臍帶血檢測結(jié)果表5采用本發(fā)明試劑盒以及普通PCR對臨床樣品進行檢測結(jié)果的比較從表4和表5中可以看出：本發(fā)明實時熒光PCR檢測陽性樣品與普通PCR檢測陽性樣品的結(jié)果100％符合，但實時熒光PCR檢測比普通PCR檢測更敏感，且臨床癥狀表現(xiàn)是一致的。綜上可見，本發(fā)明設(shè)計的一對特異性引物和一條熒光探針以及構(gòu)成的試劑盒可以快速診斷豬臍帶血豬傳染性胃腸炎病毒，并能鑒別豬傳染性胃腸炎病毒疫苗株和野毒株，同時能與豬流行性腹瀉病毒區(qū)分開來，而且該檢測方法簡單、快速、抗干擾能力強、特異性好、靈敏度高、可重復性好，檢測結(jié)果真實可靠。所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解：以上任何實施例的討論僅為示例性的，并非旨在暗示本公開的范圍(包括權(quán)利要求)被限于這些例子；在本發(fā)明的思路下，以上實施例或者不同實施例中的技術(shù)特征之間也可以進行組合，并存在如上所述的本發(fā)明的不同方面的許多其它變化，為了簡明它們沒有在細節(jié)中提供。因此，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何省略、修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁1 2 3