技術特征：

1.一種檢測豬臍帶血豬傳染性胃腸炎病毒的Taqman實時熒光PCR試劑盒，其特征在于，包括擴增引物和特異性熒光探針，所述擴增引物和特異性熒光探針的序列如下所示：

上游擴增引物：5’-GCTGAAGGTGCTATTATATGC-3’，其為SEQ ID NO:1序列；

下游擴增引物：5’-GCCTCTGAATTAGAAGGAC-3’，其為SEQ ID NO:2序列；

特異性熒光探針：FAM-5’-CTCACCACCTAYTACCACCAC-3’-TAMRA，其為SEQ ID NO:3序列，其中，Y＝C/T，FAM為熒光報告基因，TAMRA為熒光淬滅基因。

2.根據權利要求1所述的檢測豬臍帶血豬傳染性胃腸炎病毒的Taqman實時熒光PCR試劑盒，其特征在于，所述上游擴增引物、所述下游擴增引物和所述特異性熒光探針的摩爾比為3:3:2。

3.根據權利要求2所述的檢測豬臍帶血豬傳染性胃腸炎病毒的Taqman實時熒光PCR試劑盒，其特征在于，所述上游擴增引物、所述下游擴增引物和所述特異性熒光探針在所述試劑盒中的終濃度均為0.3～0.5μM。

4.根據權利要求1所述的檢測豬臍帶血豬傳染性胃腸炎病毒的Taqman實時熒光PCR試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括陰性對照、陽性對照、2×熒光定量Mixture。

5.根據權利要求4所述的檢測豬臍帶血豬傳染性胃腸炎病毒的Taqman實時熒光PCR試劑盒，其特征在于，所述陰性對照為無DNA酶的ddH₂O；所述陽性對照為含有豬傳染性胃腸炎病毒S基因序列的克隆質粒pEASY-T1-TGEV-S，克隆質粒pEASY-T1-TGEV-S的終濃度為1.0×10⁵copies/μl～1.0×10⁷copies/μl。

6.根據權利要求5所述的檢測豬臍帶血豬傳染性胃腸炎病毒的Taqman實時熒光PCR試劑盒，其特征在于，所述豬傳染性胃腸炎病毒S基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

7.根據權利要求6所述的檢測豬臍帶血豬傳染性胃腸炎病毒的Taqman實時熒光PCR試劑盒，其特征在于，所述克隆質粒采用以下方法制備得到：利用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物序列擴增豬傳染性胃腸炎病毒S基因序列，示的引物序列擴增豬傳染性胃腸炎病毒S基因序列酶切后與pEASY-T1載體連接，篩選陽性克隆，測序正確的克隆質粒命名為pEASY-T1-TGEV-S。

8.一種如權利要求1-7任一項所述的檢測豬臍帶血豬傳染性胃腸炎病毒的Taqman實時熒光PCR試劑盒的使用方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)使用權利要求1-7任一項所述的實時熒光PCR試劑盒進行PCR擴增時，實時熒光PCR反應體系以20μL計為：

0.3μM的SEQ ID NO:1所示的上游擴增引物：0.6μL；

0.3μM的SEQ ID NO:2所示的下游擴增引物：0.6μL；

0.4μM的SEQ ID NO:3所示的特異性熒光探針：0.4μL；

2×熒光定量Mixture：10μL；

RNA模板：2μL；

ddH₂O：補足至20μL；

PCR的反應條件為：95℃預變性1min；94℃變性15Sec，58℃退火45Sec，62℃延伸2sec，收集熒光，共45個循環(huán)；然后25℃延伸10sec，最后4℃保護，結束反應；

(2)結果分析：

根據擴增結果判定：陰性對照擴增無Ct值，陽性對照擴增Ct值≤38時，則結果判定成立；Ct值≤40，則判斷為豬傳染性胃腸炎病毒陽性；無Ct值顯示，則判斷為豬傳染性胃腸炎病毒陰性，豬傳染性胃腸炎病毒疫苗免疫成功。

9.根據權利要求8所述的檢測豬臍帶血豬傳染性胃腸炎病毒的Taqman實時熒光PCR試劑盒的使用方法，其特征在于，所述RNA模板采用以下方法制備得到：

(1)取50-100mg豬臍帶血置1.5mlEP管中，加入1ml裂解液充分勻漿，室溫靜置10min；

所述裂解液的成分及配比如下：①鹽酸胍4-6M；②十二烷基磺酸鈉SDS0.1-0.2％；③吐溫20 1-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP40 1-2％；

(2)加入0.6ml異丙醇和10μL磁珠，振蕩15s，靜置2min；

(3)將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；

(4)加入0.5ml異丙醇，將EP管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min；

(5)將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；

(6)加入1ml質量百分比濃度為70％的乙醇溶液，輕輕洗滌沉淀；將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；

(7)晾干，加入適量的DEPC H₂O溶解，56℃促溶10～15min；

(8)快速電泳檢測RNA完整性。

10.權利要求1-7任一項所述的試劑盒在制備檢測豬臍帶血豬傳染性胃腸炎病毒的Taqman實時熒光PCR試劑中的用途。