本發(fā)明涉及一種快速顯色一步法檢測豬細小病毒的LAMP試劑盒。

背景技術：

豬細小病毒porcine parvovirus (PPV)會導致母豬和育肥豬的繁殖障礙，是給豬場帶來嚴重經(jīng)濟損失的最常見的豬繁殖障礙性病毒之一，目前仍然在我國豬場廣泛流行。由于我國大部分豬場，尤其是大規(guī)模養(yǎng)殖場，廣泛采用PPV型滅活疫苗接種豬只，使得采用ELISA等血清學方法基本無法區(qū)分感染和免疫。所以，普查或者診斷PPV的感染主要依賴于基于檢測核酸存在的各種診斷方法。常見的PPV核酸診斷方法包括常規(guī)PCR、實時定量PCR和原位雜交，這些方法由于受特殊儀器和對操作人員高水平要求的限制，主要在各種實驗室使用。目前，針對PPV感染的豬場現(xiàn)場診斷方法還在研制中，沒有相應的商品化產(chǎn)品問世。

本申請人在2009年建立了針對PPV型的LAMP診斷方法（Chen et al,2009)，該方法針對VP2基因設計了4條特異性引物，擴增產(chǎn)物可以采用在瓊脂糖凝膠電泳形成的典型梯形條帶檢測，也可以在反應結束后，打開反應管蓋子加入SYBR Green或者含有鈣黃素和錳離子的預混熒光染料，根據(jù)反應管顏色的變化，判斷待檢樣品的PPV感染的有無。添加SYBR Green染料后陽性反應管可形成棕色顏色，能夠肉眼觀察識別，但是棕色不如加入鈣黃素預混染料形成的明亮綠色易于觀察。含鈣黃素的熒光染料會在一定程度上抑制Bst聚合酶，所以，在反應管直接加入這些染料，會導致擴增產(chǎn)物量下降，在瓊脂糖凝膠電泳上很難形成典型的梯形條帶，也很難觀察到反應管熒光的改變。在反應結束后再加入熒光染料進行觀察判斷的二步法，不僅操作繁瑣，更主要的問題是在打開反應管蓋子時，擴增產(chǎn)物被釋放到空氣中，形成了大量的氣溶膠，再次進行LAMP檢測時，假陽性率就會大大增加。為了簡化操作步驟，最大可能性地降低假陽性率，滿足豬場現(xiàn)場檢測以及廣大養(yǎng)殖業(yè)者能夠自行診斷的需求，需要進一步進行改進。

技術實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明提供了一種快速顯色一步法檢測豬細小病毒的LAMP試劑盒，該試劑盒包括提供用于檢測豬細小病毒的特異性LAMP引物組，共六條引物。

本發(fā)明提供用于檢測豬細小病毒的特異性LAMP引物組，所述引物組為以下六條引物：

F3：5'-gCACACgCATCAAgACTCATAC-3'，

B3：5'-TggTggTgAggTTgCTgATTC-3'，

FIP：5'-gCATCgTCTTgTACCATTTgTCCCTgCCAgAACACgAAACATACAA-3'，

BIP：5'-CCTTggTCACTAATAgATgCTAACgCAgTTTATTTCTgTCATgTTgTTggA-3'，

FLoop：5'-TAAATTCAgAATCAggggTggC-3'，

BLoop：5'-gCCAgTCCgCTggATTgAA-3'。

本發(fā)明還提供一種快速顯色一步法檢測豬細小病毒的LAMP試劑盒，所述試劑盒包括權利要求1所述的引物組。

作為優(yōu)選，還包括含有鈣黃素和錳離子的熒光染料。

作為優(yōu)選，所述熒光染料的用量為在25μL檢測體系中含有0.4-1.0μL。

作為優(yōu)選，所述試劑盒構成LAMP檢測體系；25μL檢測體系的具體配置為：

PM預混引物:FIP/BIP (50UM) 0.4μL

FLOOP/BLOOP (50UM) 0.4μL

F3/B3 (10UM) 0.2μL

提取DNA 1.0-2.0μL

Bst酶 1.5μL

2×U-loadmix buffer 12.5μL

含有鈣黃素和錳離子的榮研Loopamp 熒光染料 0.4-1.0μL

DEPC-treated ddH₂O 補充至25.0μL

作為優(yōu)選，所述試劑盒的檢測反應條件為：63-65℃，45-90分鐘；終止反應。

作為優(yōu)選，所述試劑盒的檢測反應條件為：63℃，45-60分鐘；終止反應。

本發(fā)明針對PPV VP2基因設計了6條特異性引物，在引入一對環(huán)引物之后，大大提高了擴增效率，產(chǎn)生了大量擴增產(chǎn)物，所以，將含鈣黃素的預混染料直接加入反應管，在反應結束后，就可以直接觀察對比顏色變化，判斷樣品感染的有無。通過引入環(huán)引物，摸索最佳擴增溫度，本發(fā)明成功建立了PPV快速一步法LAMP檢測方法，并應用該方法檢測了大量的田間血清以及組織樣品，達到了預期效果，有望開發(fā)為可以在廣大豬場現(xiàn)場直接使用的快速診斷試劑盒。

本發(fā)明的試劑盒在不延長原有1小時反應時間的條件下，實現(xiàn)了將熒光染料直接加入反應管的一步操作，不僅簡化了操作程序，解決了含有鈣黃素的預混染料對Bst DNA擴增酶的抑制而導致在反應管直接加入熒光染料不顯色的根本問題，還有效避免了由于反應結束后二次開蓋導致的釋放產(chǎn)物形成氣溶膠的污染發(fā)生。應用本發(fā)明的試劑盒進行檢測，能夠肉眼直接直觀判斷，具有良好的特異性、敏感性和穩(wěn)定性。

附圖說明

附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發(fā)明的實施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構成對本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1為60-65℃不同溫度條件下，PPV一步法快速顯色LAMP圖譜；

圖2為以10倍系列稀釋的AV30毒株細胞毒DNA或者含有VP2編碼基因的質(zhì)粒為模板，進行PPV一步法快速顯色LAMP檢測結果；

圖3為以10倍系列稀釋的DNA為模板，進行常規(guī)PCR（P16/P17引物對) 檢測結果；

圖4為PPV一步法快速顯色LAMP分析特異性檢測結果。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為市售。

毒株

建立LAMP檢測方法采用的兩株PPV毒株分別為AV30株（CVCCAV30）和AV31株（CVCCAV31），均來自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。用于分析特異性檢測實驗的其它與豬殖障礙性疫病有關的病毒毒株包括豬圓環(huán)病毒1型PCV1（CAU0672）、豬圓環(huán)病毒2型PCV2（CAU0673)、豬偽狂犬病毒RRV（CVCC AV250）和古典豬瘟病毒CSF（CVCCAV65，豬瘟弱毒株）均來自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，在PK-15細胞傳代后保存的細胞毒，HP-PRRSV（QH08毒株，由實驗室從田間分離保存的Marc-145細胞毒，全基因組測序Genebank登錄號：KU201579）和非高致病性PRRSV(CH-1R毒株，源自海利疫苗公司生產(chǎn)的藍耳凈豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗，由實驗室在Marc-145細胞傳代的細胞毒）。

臨床樣品

用于臨床檢測的田間樣品共有505份，其中豬血清101份，組織樣品404份。這些田間樣品經(jīng)過ELISA、PK-15細胞接毒后間接免疫熒光IFA以及PCR檢測和測序分析等綜合方法確定是否為PPV感染。101份豬血清中41份為陽性，60份為陰性。組織樣品包括肺臟組織71份（34份陽性，37份陰性），肝臟組織67份（32份陽性，35份陰性），心臟組織60份（陰、陽性各30份），腎臟組織70份（陽性33份，陰性37份），脾臟組織63份（31份陽性，32份陰性），淋巴結73份（37份陽性，36份陰性），提取核酸后，分別進行PPV一步法快速顯色LAMP和常規(guī)PCR檢測，用于檢測新建立方法的臨床特異性和敏感性。

3.核酸擴增和提取相關試劑盒

用于建立PPV LAMP方法的擴增試劑盒為北京美萊博醫(yī)學科技有限公司的LAMP試劑盒以及日本榮研公司Loopamp 熒光目視檢測試劑盒（含有鈣黃素和錳離子）。核酸提取采用Takara寶生物工程（大連）有限公司生產(chǎn)的TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0。用于常規(guī)PCR擴增的試劑盒源自Takara寶生物工程（大連）有限公司Premix Taq Version 2.0 plus dye。

實施例1 本發(fā)明的試劑盒的制備

一、樣品DNA的提取

采用Takara寶生物工程（大連）有限公司生產(chǎn)的MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit提取細胞毒、血清和研磨后的組織樣品中核酸。

二、采用不同的方法對樣品中的PPV進行測定

1、常規(guī)PCR反應實驗測定PPV

PPV常規(guī)PCR擴增引物序列

表1 PPV 1型常規(guī)PCR擴增引物序列

P16-F和P17-R作為引物對合用，用于常規(guī)PCR鑒定PPV豬細小病毒，針對衣殼蛋白VP2基因的461-905bp片段區(qū)域，預計擴增產(chǎn)物大小445bp。

PCR擴增反應體系（20μl）

PrimeSTAR? GXL DNA Polymerase 0.4μL

dNTP Mixture 1.6μL

5×PrimeSTAR GXL Buffer 4μL

上游引物 （20μM) 0.5μL

下游引物 （20μM) 0.5μL

模板 (濃度在5-15ng/μL) 1μL

DEPC水 加至20μL。

PCR擴增反應

擴增程序為：94℃ 5min；94℃ 30s，57℃ 30s，72℃50S，36個循環(huán)；72℃ 10min。

2、PPV一步法快速顯色LAMP建立

（1）PPV一步法快速顯色LAMP擴增引物序列

PPV一步法快速顯色LAMP共有6條引物（見表2），針對VP2基因8個不同的靶序列，除了常規(guī)的一對外引物（F3和B3）和一對內(nèi)引物（FIP和BIP）之外，還有一對環(huán)引物，即FLooP和BLooP。引入環(huán)引物的目的旨在進一步提高擴增效率，提高產(chǎn)物量，利于快速顯色。內(nèi)引物FIP和BIP各由兩段序列組成，故此，6條引物由8段序列組成。

表2. PPV一步法快速顯色LAMP引物

（2）LAMP擴增反應體系（25μl）

PM預混引物:FIP/BIP (50UM) 0.4μL

FLOOP/BLOOP (50UM) 0.4μL

F3/B3 (10UM) 0.2μL

提取DNA 1.0-2.0μL

Bst酶 1.5μL

2×U-loadmix buffer 12.5μL

榮研Loopamp 熒光染料(含有鈣黃素和錳離子) 0.4-1.0μL

DEPC-treated ddH₂O 補充至25.0μL

總體積 25.0μL。

（3）LAMP擴增反應流程

擴增程序：63℃反應45-90分鐘。一般情況60分鐘就可以。

（4）LAMP擴增產(chǎn)物電泳檢測

A、瓊脂糖凝膠電泳檢測法

RT-LAMP擴增產(chǎn)物可以采用常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠濃度為2-2.5%，電泳緩沖液為1×TAE，電泳速度為5-6伏特/厘米（即電壓降）。電泳結束后凝膠放入含有EB的染色中染色30分鐘，然后在紫外燈下觀察，電腦拍照。

B、熒光目測法

快速顯色一步法RT-LAMP由于在反應管內(nèi)加入了含有鈣黃素和錳離子的染料，所以，在反應結束后，陽性樣品管就會出現(xiàn)明亮的綠色熒光，而對照管和陰性樣品管僅是有微弱的本底熒光。這樣通過與系統(tǒng)設置的陰性和陽性對照的比較，在自然光下，通過肉眼觀察即可以做出判斷。再有，陽性樣品由于擴增產(chǎn)生了大量產(chǎn)物，所以，與陰性對照相比較，陽性管溶液更為渾濁。在實驗室，還可以通過在紫外燈下觀察顏色變化，較自然光觀察，更為明顯。

實施例2 本發(fā)明的試劑盒的性能實驗

一、PPV一步法快速顯色LAMP分析敏感性實驗

AV30株（CVCCAV30）與經(jīng)典毒株NADL-2具有高度同源性，所以，本實驗參考NADL-2株基因組序列計算提取核酸的拷貝數(shù)。

拷貝數(shù)計算公式:

(6.02×10²³拷貝數(shù)/摩爾)×(濃度g/ml)/(MW g/mol)=拷貝數(shù)/ml

或者 (6.02×10²³拷貝數(shù)/摩爾)×(濃度ng/μl)x10^-6/(MW g/mol)=拷貝數(shù)/ml

【平均分子量(MW g/mol)：dsDNA=(堿基數(shù))×(660 道爾頓/堿基)；ssDNA=(堿基數(shù))×(330 道爾頓/堿基)；ssRNA=(堿基數(shù))×(340 道爾頓/堿基)】。

PPV屬于單鏈DNA，NADL-2參考毒株基因組全長為5075bp，所以，其平均分子量MW=330×5075=1674750道爾頓。

AV30毒株DNA拷貝數(shù)為/ml=(6.02×10²³拷貝數(shù)/摩爾)×(濃度g/ml)/1674750=拷貝數(shù)/ml

若是AV30毒株DNA的濃度為1ng/μl，那么每微升含有3.6×10⁸ 拷貝數(shù)的PPV單鏈DNA，計算如下：

(6.02×10²³拷貝數(shù)/摩爾)×(濃度1ng/μl) ×10^-6/1674750=3.6×10¹¹ 拷貝數(shù)/mL=3.6×10⁸ 拷貝數(shù)/μl。

從AV30株（CVCCAV30）PK-15細胞毒中提取DNA，采用紫外分光光度計測定核酸濃度，然后根據(jù)上述公式計算出提取DNA樣品的每微升核酸拷貝數(shù)。將DNA樣品用無菌和無核酸酶的ddH₂O系列稀釋成1×10^8- 1×10^0拷貝數(shù)/μL，然后按上述方法進行LAMP實驗，每個反應管加入1μL上述系列稀釋的DNA樣品作為模板。反應結束后進行瓊脂糖凝膠電泳和熒光檢測。同時將上述倍比稀釋的DNA樣品進行常規(guī)PCR擴增(P16/P17引物對)，比較兩種方法的分析敏感性。此外，還以實驗室保存的含有PPV VP2基因的質(zhì)粒為模板，按著1-10^8的進行10倍系列稀釋，比較上述兩種方法的分析敏感性。

二、PPV一步法快速顯色LAMP分析特異性實驗

在進行PPV病毒一步法快速顯色LAMP的分析特異性檢測時，分別檢測其與PCV1、PCV2、PRV、CSF、HP-PRRSV和Non-HP-PRRSV病毒的交叉反應性分析。提取PCV1（CAU0672）、PCV2（CAU0673)、PRV（CVCC AV250）、CSF（CVCCAV65）、HP-PRRSV（QH08毒株）和非高致病性PRRSV(CH-1R毒株）細胞毒核酸，放入-70℃保存待用。采用本發(fā)明建立的PPV一步法快速顯色LAMP檢測這些核酸樣品，評估該方法與這些病毒的交叉反應性。

三、PPV一步法快速顯色LAMP臨床敏感性實驗

用于PPV快速顯示一步法LAMP臨床靈敏度分析的PPV陽性樣品以流產(chǎn)胎兒組織為主，共有238份。組織樣品包括肺臟組織34份，肝臟組織32份，心臟組織30份，腎臟組織33份，脾臟組織31份；淋巴結37份，感染豬血清41份。采用Takara試劑盒重新提取這些經(jīng)過鑒定為PPV陽性的組織樣品核酸后，分別進行PPV快速顯示一步法LAMP和常規(guī)PCR檢測。

四、PPV一步法快速顯色LAMP臨床特異性實驗

用于PPV一步法快速顯色LAMP臨床特異性分析的PPV陰性樣品來自健康豬場，這些豬場在最近幾年內(nèi)沒有發(fā)生過豬繁殖障礙性疫病，共有267份樣品，其中血清60份，組織樣品207份。組織樣品中肺臟組織37份，肝臟組織35份，心臟組織30份，腎臟組織37份，脾臟組織32份；淋巴結36份。提取這些樣品核酸后，分別進行PPV一步法快速顯色LAMP和常規(guī)PCR檢測，評估新建立的PPV一步法快速顯色LAMP臨床特異性。

【結果】

1. PPV一步法快速顯色LAMP建立

以AV30毒株的細胞毒DNA為模板建立PPV一步法快速顯色LAMP，結果表明，在63℃、64℃和65℃都能夠有效擴增出典型的梯形條帶，在凝膠成像儀紫外燈光紫外模式下反應管的綠色熒光都非常明亮。在60℃反應條件下沒有條帶形成，基本看不到熒光出現(xiàn)。在61℃和62℃時能看到條帶形成，反應管開始出現(xiàn)熒光。在自然光情況下，肉眼可見綠色熒光隨著溫度變化而變化，但是拍照效果不是很明顯。圖1結果可見，PPV一步法快速顯色LAMP的適宜擴增溫度為63-65℃，其中以63℃反應效果最佳。

圖1為60-65℃不同溫度條件下，PPV一步法快速顯色LAMP圖譜；其中，

A圖：LAMP擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜；

B圖：LAMP擴增產(chǎn)物對應反應管在凝膠成像儀紫外光的紫外模式下拍照圖譜；

C圖：LAMP擴增產(chǎn)物對應反應管在凝膠成像儀紫外光的黑白模式下拍照圖譜；

D圖：LAMP擴增產(chǎn)物對應反應管在自然光條件下拍照圖譜；

M：DL2000 Marker（2000,1000,750,500,250,100bp)；

1，2，3，4，5，6分別代表在60℃、61℃、62℃、63℃、64℃和65℃下的LAMP等溫擴增。

2. PPV一步法快速顯色LAMP的分析敏感性

以1×10^8-1×10^0拷貝數(shù)/μL系列稀釋DNA作為模板，進行PPV一步法快速顯色LAMP（63℃等溫擴增）和常規(guī)PCR檢測，并比較兩種的敏感性。結果表明，不管以AV30毒株的細胞毒DNA為擴增模板還是以含有VP2基因的質(zhì)粒為模板，PPV一步法快速顯色LAMP的檢出限都是10個拷貝數(shù)/μL（圖2）。而常規(guī)PCR方法（P16/P17引物對）在以AV30細胞毒DNA為模板的檢出限為1x10^5個拷貝數(shù)/μL左右，以含有VP2基因的質(zhì)粒為模板的檢出限為1x10^2個拷貝數(shù)/μL左右（見圖3），這表明，PPV一步法快速顯色LAMP不僅要比常規(guī)PCR靈敏高，可以提高10-10000倍左右，而且反應的敏感性不受核酸來源的限制。

圖2為以10倍系列稀釋的AV30毒株細胞毒DNA或者含有VP2編碼基因的質(zhì)粒為模板，進行PPV一步法快速顯色LAMP檢測結果；其中，

A圖：LAMP擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜；

B圖：LAMP擴增產(chǎn)物對應反應管在凝膠成像儀紫外光的紫外模式下拍照圖譜；

C圖：LAMP擴增產(chǎn)物對應反應管在凝膠成像儀紫外光的黑白模式下拍照圖譜；

M：DL2000 Marker（2000,1000,750,500,250,100bp); 對應的模板拷貝數(shù)（拷貝數(shù)/μL）分別為1(0)；2 (1×10^0)；3 (1×10^1)；4(1×10^2)；5(1×10^3)；6(1×10^4)；7(1×10^5)；8(1×10^6)。

圖3為以10倍系列稀釋的DNA為模板，進行常規(guī)PCR（P16/P17) 檢測結果；其中，

A圖：以AV30毒株的細胞毒DNA為擴增模板；

B圖：以含有PPV VP2編碼基因的質(zhì)粒為擴增模板；

M：DL2000 Marker（2000,1000,750,500,250,100bp)；對應的模板拷貝數(shù)（拷貝數(shù)/μL）分別為1(0)；2 (1×10^0)；3 (1×10^1)；4(1×10^2)；5(1×10^3)；6(1×10^4)；7(1×10^5)；8(1×10^6)；9(1×10^7)；10 (1×10^8)。

3. PPV一步法快速顯色LAMP的分析特異性

PPV一步法快速顯色LAMP不與PCV1、PCV2、PRV、CSF、HP-PRRSV和非高致病性PRRSV發(fā)生交叉反應，瓊脂糖凝膠電泳不形成條帶，肉眼和紫外燈下觀察未產(chǎn)生明亮的顏色變化。與此同時，以AV30和AV31毒株為陽性對照實驗，瓊脂糖凝膠電泳形成了典型的梯形條帶，肉眼或者白光燈模式下和紫外燈下觀察反應管都發(fā)生了明顯的顏色變化。以ddH₂O為陰性對照的反應管仍應呈陰性反應，試劑盒提供的陽性對照成立(見圖4）。綜上所述，新建立的PPV一步法快速顯色LAMP分析特異性強，不與其它有關豬病病毒發(fā)生交叉反應。

圖4為PPV一步法快速顯色LAMP分析特異性檢測結果；其中，

A圖: LAMP等溫擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜；

B圖: LAMP等溫擴增產(chǎn)物對應反應管在凝膠成像儀紫外光的紫外模式下拍照圖譜；

C圖: LAMP等溫擴增產(chǎn)物對應反應管在凝膠成像儀紫外光的黑白模式下拍照圖譜；

M：DL2000 Marker（2000,1000,750,500,250,100bp)； 以不同病毒的核酸為模板，依次為：1.ddH₂O陰性對照；2. PPV1型AV30毒株；3. PPV1型AV31毒株；4. PCV1；5. PCV2；6.PRV；7. CSFV；8.HP-PRRSV；9.Non-HP-PRRSV；10.試劑盒提供的陽性對照模板。

4. PPV一步法快速顯色LAMP的臨床敏感性

采用發(fā)生了PPV感染豬場收集的流產(chǎn)胎兒組織樣品和母豬以及種公豬的血清作為臨床陽性樣品評估PPV一步法快速顯色LAMP的敏感性，并與常規(guī)PCR方法進行比較。這些陽性臨床樣品經(jīng)過ELISA、PK-15細胞接毒后間接免疫熒光以及PCR檢測和測序分析后確定。PPV一步法快速顯色LAMP能夠全部檢出肺臟和脾臟中的PPV病毒核酸，總陽性檢出率為97.5%。以P16/P17引物對擴增的常規(guī)PCR總檢出率為91.2%。對組織樣品的檢出率在90-94%之間。LAMP方法對豬血清的檢出率為97.3%,常規(guī)PCR方法的檢出率為90.2%（結果見表3）。對比兩種方法對上述PPV陽性樣品的檢出率，結果顯示PPV一步法快速顯色LAMP的臨床敏感性明顯高于常規(guī)PCR方法。

表3 238份PPV陽性臨床樣品的PPV一步法快速顯色LAMP和常規(guī)PCR檢出敏感性比較

5.PPV一步法快速顯色LAMP的臨床特研性

以從最近幾年內(nèi)沒有發(fā)生過豬繁殖障礙性疫病的豬場采集的樣品進行PPV一步法快速顯色LAMP的臨床特研性分析，并與以P16/P17為引物對的常規(guī)PCR進行比較。共檢測267份樣品，其中血清60份，組織樣品207份。這些PPV陰性臨床樣品經(jīng)過ELISA、PK-15細胞接毒后間接免疫熒光以及PCR檢測和測序分析等綜合診斷方法確定。兩種方法的結果顯示PPV一步法快速顯色LAMP和常規(guī)PCR對267份陰性臨床樣品的檢出率基本接近，分別為97.7%(261/267)和97.3% (260/267)，沒有明顯差別。這表明新建立的PPV一步法快速顯色LAMP特異性強，適于在臨床推廣使用。

表4 267份陰性臨床樣品的PPV一步法快速顯色LAMP和常規(guī)PCR方法的特異性比較

最后應說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。