本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種用于檢測(cè)不同基因型傳染性支氣管炎病毒的通用試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)屬冠狀病毒科(Coronaviridae)，冠狀病毒屬(Coronavirus)，有囊膜單股正鏈RNA病毒，基因組約為27.6kb。IBV基因組編碼四種必需結(jié)構(gòu)蛋白：纖突蛋白(S)、膜蛋白(M)、核衣殼蛋白(N)和小膜蛋白(E)。N蛋白是位于膜內(nèi)的磷酸化核心多肽，分子量約46ku，磷酸化后的分子量約51ku。N蛋白基因序列較保守，主要作用是與病毒RNA結(jié)合形成核衣殼，能特異性地結(jié)合到引導(dǎo)RNA上，并且能誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和交叉反應(yīng)性ELISA抗體。

IBV血清型多并且不同血清型毒株之間僅有部分或無(wú)交叉保護(hù)作用，所以即使免疫IB疫苗，本病仍可發(fā)生，給養(yǎng)禽業(yè)造成很大危害。IBV引起雞的臨床癥狀和病理變化復(fù)雜多樣，造成的損傷主要表現(xiàn)為破壞呼吸道黏膜的完整性，感染IBV可誘發(fā)其它條件性疾病混合感染(如支原體、新城疫、慢性呼吸道病等)以及引起大腸桿菌、沙門氏菌等繼發(fā)感染，且IB臨床癥狀與禽流感(AI)、新城疫(ND)、雞傳染性喉氣管炎(ILT)具有一定的相似性，給IB的診斷帶來(lái)困難。因此，快速準(zhǔn)確地檢測(cè)IBV，是預(yù)防和控制IB的關(guān)鍵。國(guó)際上已經(jīng)建立的診斷方法很多，如血清學(xué)方法有細(xì)胞中和試驗(yàn)、ELISA、血凝和血凝抑制試驗(yàn)等，這些方法雖已屬常規(guī)技術(shù)，但具體應(yīng)用到IBV檢測(cè)中，或因IBV型間抗原差異大而降低敏感性，導(dǎo)致漏檢；或因常規(guī)血清學(xué)方法本身的缺陷而呈現(xiàn)假陽(yáng)性，造成誤檢。而傳統(tǒng)的病毒分離方法，對(duì)采集病料的時(shí)機(jī)和病料的新鮮程度要求較高，且檢測(cè)周期往往要幾周以上，具有明顯的局限性。

RT-PCR技術(shù)是一種快速、敏感、特異的分子生物學(xué)檢測(cè)方法。80年代該技術(shù)的產(chǎn)生給病毒檢測(cè)提供了一種新的選擇，在檢測(cè)各種病毒中得到了廣泛應(yīng)用。IBV眾多血清型中的序列同源性存在一定差異，且不斷有新的變異株產(chǎn)生，這為檢測(cè)IBV帶來(lái)了技術(shù)困難。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的在于，克服現(xiàn)有技術(shù)的障礙，為保證較高的IBV檢出率和檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，本發(fā)明針對(duì)IBV核蛋白N基因的保守序列設(shè)計(jì)了通用檢測(cè)引物，可用于檢測(cè)不同基因型傳染性支氣管炎病毒。

本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供檢測(cè)不同基因傳染性支氣管炎病毒的試劑盒。

本發(fā)明以NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中IBV-YN(GenBank：F893452)基因組序列作為參考，上游引物在26235nt-26254nt之間，下游引物在27045nt-27064nt之間。在眾多備選的引物中，經(jīng)過(guò)多次篩選，比對(duì)試驗(yàn)，以排除引物與其他物種序列可能存在的非特異性匹配，最終獲得優(yōu)化后的引物對(duì)。

本發(fā)明提供的優(yōu)選的引物對(duì)，其序列為：

上游引物為5’-GGTATAGTGTGGGTT(G/T)CTGC-3’(SEQ ID NO.1)；以及下游引物為5’-AGCTGTGCATTGTTCCTCTC-3’(SEQ ID NO.2)。

提取樣本總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(RT)合成cDNA后，利用上述引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，采用下列反應(yīng)程序：起始變性94℃5min，30個(gè)循環(huán)(94℃45s，57℃45s，72℃50s)，最后經(jīng)過(guò)72℃10min延伸，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，利用紫外凝膠成像儀檢測(cè)目的條帶，如果擴(kuò)增出目的條帶則證明為IBV陽(yáng)性，否則為陰性。

本發(fā)明提供了上述通用性引物對(duì)在制備檢測(cè)傳染性支氣管炎病毒血清型試劑盒中的應(yīng)用。

含有SEQ ID NO.1-2所示通用性引物對(duì)的檢測(cè)試劑屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

含有SEQ ID NO.1-2所示通用性引物對(duì)的試劑盒屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

進(jìn)一步地，本發(fā)明的試劑盒其PCR階段的工作程序?yàn)椋?4℃5min；94℃45s，57℃45s，72℃50s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。

本發(fā)明的上述試劑盒是對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)后，擴(kuò)增產(chǎn)物若有830bp大小的條帶，則待測(cè)樣本中含有傳染性支氣管炎病毒。

本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)不同基因型傳染性支氣管炎病毒的非診斷目的方法，包括以下步驟：

(1)提取待測(cè)樣本的總RNA，反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA；

(2)利用SEQ ID NO.1-2所示通用性引物對(duì)對(duì)步驟(1)的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判斷待測(cè)樣本中是否有傳染性支氣管炎病毒。

其中，步驟(2)中陽(yáng)性樣本擴(kuò)增的目的片段為830bp。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，1)擴(kuò)增的目的片段位于IBV的N蛋白的高度保守區(qū)，長(zhǎng)度為830bp，敏感性好、操作方便、對(duì)不同基因型的IBV均有較好檢出(通用性)；2)將IBV病毒樣本cDNA進(jìn)行10倍系列稀釋后，發(fā)現(xiàn)進(jìn)行100000倍稀釋后利用本方法仍能檢測(cè)到IBV特異性條帶，表明該方法具有較高的靈敏度；3)該方法對(duì)其它常見(jiàn)禽病病原，如禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性法氏囊病毒、禽呼腸孤病毒、禽腺病毒和禽傳染性喉氣管炎病毒的檢測(cè)結(jié)果皆為陰性，沒(méi)有交叉反應(yīng)，表明該方法亦具有良好的特異性；4)本發(fā)明方法適用于養(yǎng)禽生產(chǎn)中進(jìn)行IBV的檢測(cè)，具有高特異性、高靈敏度、高效率、低成本的特點(diǎn)，可在6.5h內(nèi)對(duì)臨床病料進(jìn)行快速鑒別診斷，克服了傳統(tǒng)檢測(cè)方法耗時(shí)較長(zhǎng)的缺點(diǎn)，對(duì)IBV的早期快速診斷以及分子流行病學(xué)調(diào)查研究提供了可靠的技術(shù)手段。

附圖說(shuō)明

圖1是最佳擴(kuò)增引物篩選電泳結(jié)果。點(diǎn)樣順序?yàn)镸：Marker III；1：引物1(830bp)；2：引物2(837bp)；3：引物3(785bp)；4：引物4(704bp)。

圖2是RT-PCR反應(yīng)最佳退火溫度篩選電泳結(jié)果。點(diǎn)樣順序?yàn)镸：Marker III；1：55℃；2：56℃；3：57℃；4：58℃；5：59℃。

圖3是RT-PCR反應(yīng)最佳循環(huán)數(shù)篩選電泳結(jié)果。M：Marker III；1：28循環(huán)；2：29循環(huán)；3：30循環(huán)；4：31循環(huán)；5：32循環(huán)；6：33循環(huán)。

圖4是根據(jù)IBV S1基因所繪制的遺傳進(jìn)化樹(shù)，圖中●顯示不同基因型的IBV代表性毒株，用于本發(fā)明方法的IBV通用性檢測(cè)。

圖5是對(duì)不同基因型傳染性支氣管炎病毒進(jìn)行檢測(cè)的電泳結(jié)果。點(diǎn)樣順序?yàn)镸：DNA Maker II；P：陽(yáng)性對(duì)照；N：陰性對(duì)照；1：4/91；2：T株(腎型標(biāo)準(zhǔn)株)；3：YN株(YN-like)；4：M41(M型標(biāo)準(zhǔn)株)；5：JS株(QX-like)；6：GD株(TW-like)。

圖6是該引物檢測(cè)傳染性支氣管炎病毒的靈敏度電泳結(jié)果。點(diǎn)樣順序?yàn)镸:DNA maker II；P:陽(yáng)性對(duì)照；N：陰性對(duì)照；1：cDNA稀釋10倍；2：cDNA稀釋10²倍；3：cDNA稀釋10³倍；4：cDNA稀釋10⁴倍；5：cDNA稀釋10⁵倍。

圖7是對(duì)其它常見(jiàn)禽病病原進(jìn)行檢測(cè)的電泳結(jié)果。其中M：DNA Maker II；P:陽(yáng)性對(duì)照；N：陰性對(duì)照；1：H5亞型禽流感病毒；2：H7亞型禽流感病毒；3：H9亞型禽流感病毒；4：新城疫病毒(NDV)；5：傳染性法氏囊病毒(IBDV)；6：禽呼腸孤病毒(REOV)；7：禽腺病毒(FAdV)；8：禽傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)。

圖8為文獻(xiàn)中記載的引物檢測(cè)IBV結(jié)果圖，樣品順序：M：Marker II；P：陽(yáng)性對(duì)照；N：陰性對(duì)照；1：cDNA稀釋10倍；2：cDNA稀釋10²倍；3：cDNA稀釋10³倍；4：cDNA稀釋10⁴倍；5：cDNA稀釋10⁵倍。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

下列實(shí)施例中常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法，參見(jiàn)Sambrook等編寫的分子克隆。儀器的使用參照儀器操作說(shuō)明。LEGEND MICRO 17R低溫臺(tái)式離心機(jī)，為Thermo公司產(chǎn)品；VS-1渦旋振蕩器購(gòu)自鼎昊源科技有限公司；TL-2010S組織研磨震蕩器購(gòu)自鼎昊源科技有限公司。反轉(zhuǎn)錄酶(Reverse Transcriptase)200U/μl(Promega)、核酸酶抑制劑(Rnase Inhibitor)50U/μl(Takara)、5倍體積的反應(yīng)緩沖液(5×Reaction Buffer)、dNTP混合物2.5mM和隨機(jī)引物(Random Primer)500μg/ml(Promega)，購(gòu)自北京愛(ài)普銳晟科技有限公司；DEPC處理水，購(gòu)自北京明豪至遠(yuǎn)有限公司。Marker II DNA Ladder購(gòu)自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司。Veriti 96-Well Thermal Cycler PCR擴(kuò)增儀為Applied Biosystems公司產(chǎn)品，購(gòu)自北京誠(chéng)茂興業(yè)科技發(fā)展有限公司；MINI-Smart小型臺(tái)式離心機(jī)為HERO公司產(chǎn)品；HW·SYII-KP3型電熱恒溫水槽購(gòu)自北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司。

本發(fā)明實(shí)施例中選用的生物材料如下：禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性法氏囊病毒、禽呼腸孤病毒、禽腺病毒和禽傳染性喉氣管炎病毒，傳染性支氣管炎病毒4/91型、T株(腎型標(biāo)準(zhǔn)株)、M41(M型標(biāo)準(zhǔn)株)、YN株(YN-like)、JS株(QX-like)、GD株(TW-like)均由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院保藏和提供。

實(shí)施例1用于檢測(cè)不同基因型傳染性支氣管炎病毒的通用性引物的設(shè)計(jì)

參照NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中IBV-YN(GenBank：F893452)基因組序列并篩選引物。在眾多備選的引物中，經(jīng)過(guò)多次篩選，比對(duì)試驗(yàn)，以排除引物與其他物種序列可能存在的非特異性匹配，經(jīng)反復(fù)篩選和驗(yàn)證，最終獲得4組備選引物對(duì)，繼續(xù)對(duì)四組引物對(duì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，選擇最優(yōu)化的引物對(duì)。表1中的引物1、2、3、4組引物對(duì)均為針對(duì)同一個(gè)靶基因的引物，它們的位置鄰近。各引物擴(kuò)增電泳結(jié)果如圖1所示。選擇擴(kuò)增目的條帶最亮，無(wú)非特異性雜帶的引物對(duì)1為最佳引物，上游引物在GenBank登錄號(hào)為F893452的26235nt-26254nt之間，下游引物在27045nt-27064nt之間。

表1用于檢測(cè)不同基因型IBV備選引物序列

本發(fā)明提供的優(yōu)選特異性引物對(duì)，其序列為：上游引物為5’-GGTATAGTGTGGGTT(G/T)CTGC-3’(SEQ ID NO.1)；以及下游引物為5’-AGCTGTGCATTGTTCCTCTC-3’(SEQ ID NO.2)。

實(shí)施例2檢測(cè)傳染性支氣管炎病毒的RT-PCR檢測(cè)方法最佳退火溫度的摸索

1、檢測(cè)樣品的預(yù)處理

(1)組織樣品處理：取100mg臟器組織樣品加入0.5ml滅菌生理鹽水并用研磨器進(jìn)行研磨混懸，組織懸液3000rpm離心30min后取上清用于檢測(cè)分析。

(2)泄殖腔或口咽拭子樣品處理：將拭子樣品加入0.5ml滅菌生理鹽水并用渦旋振蕩器振蕩混懸，樣品懸液3000rpm離心30min后取上清用于檢測(cè)。

2、樣品總RNA的提取

參照Trizol RNA提取試劑盒(Invitrogen)說(shuō)明書進(jìn)行提取。

3、反轉(zhuǎn)錄為cDNA

在0.2ml離心管內(nèi)加入下列成分：RNA溶液4μl，隨機(jī)引物1μl，輕輕混勻，70℃水浴5min，冰浴2min，然后依次加入下列成分：5×反應(yīng)緩沖液4μl，dNTP混合物2μl，核酸酶抑制劑1μl，反轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，DEPC處理水7.5μl，輕輕混勻，37℃作用1h，得到樣本cDNA。

4、PCR檢測(cè)

利用實(shí)施例1最終確定的引物對(duì)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，設(shè)計(jì)不同的退火溫度梯度(55℃、56℃、57℃、58℃和59℃)對(duì)IBV進(jìn)行RT-PCR。

在0.2ml離心管中加入下列成分：

輕輕混勻后，以不同的退火溫度分別進(jìn)行如下反應(yīng)：94℃預(yù)變性5min，94℃45s，(55℃、56℃、57℃、58℃和59℃)45s，72℃50s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束72℃延伸10min。

PCR反應(yīng)結(jié)束后，用1×TAE電泳緩沖液制備1％瓊脂糖凝膠并按照參考比例混入熒光染料Gelsafe。取7μl PCR產(chǎn)物加入凝膠孔中，選擇合適的電壓(4V/cm-10V/cm)進(jìn)行電泳，電泳時(shí)間為20-30分鐘，電泳結(jié)束后將凝膠塊置于凝膠成像儀上觀察并拍照，根據(jù)電泳結(jié)果確定樣品中能否擴(kuò)增出目的條帶，如果擴(kuò)增出目的條帶則證明為傳染性支氣管炎病毒檢測(cè)陽(yáng)性，否則為傳染性支氣管炎病毒檢測(cè)陰性。

電泳結(jié)果如圖2所示，57℃為擴(kuò)增目的條帶最亮，結(jié)合退火溫度過(guò)高不利于引物與模板結(jié)合，所以選擇該溫度為最佳溫度。

實(shí)施例3檢測(cè)傳染性支氣管炎病毒的RT-PCR檢測(cè)方法最佳循環(huán)數(shù)摸索

檢測(cè)樣品的預(yù)處理、樣品總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄為cDNA參見(jiàn)實(shí)施例2對(duì)應(yīng)的方法。利用實(shí)施例1和2確定的條件，設(shè)計(jì)6個(gè)不同的循環(huán)數(shù)(28、29、30、31、32和33)對(duì)IBV進(jìn)行RT-PCR。

輕輕混勻后，以不同的循環(huán)數(shù)分別進(jìn)行如下反應(yīng)：94℃預(yù)變性5min，94℃45s，57℃45s，72℃50s，進(jìn)行不同的循環(huán)個(gè)數(shù)(28、29、30、31、32和33)，循環(huán)結(jié)束72℃延伸10min。電泳結(jié)果如圖3所示，30個(gè)循環(huán)數(shù)擴(kuò)增目的條帶條帶與更多循環(huán)數(shù)亮度相似，且沒(méi)有非特異性雜帶，能節(jié)省時(shí)間、提高檢測(cè)效率，因此選擇其為最佳循環(huán)數(shù)。

實(shí)施例4檢測(cè)不同基因型傳染性支氣管炎病毒的RT-PCR檢測(cè)方法的建立

檢測(cè)樣品的預(yù)處理、樣品總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄為cDNA參見(jiàn)實(shí)施例2對(duì)應(yīng)的方法。

采用下列反應(yīng)程序：起始變性94℃5min，30個(gè)循環(huán)(94℃45s，57℃45s，72℃50s)，最后經(jīng)過(guò)72℃10min延伸，PCR反應(yīng)結(jié)束后，用1×TAE電泳緩沖液制備1％瓊脂糖凝膠并按照參考比例混入熒光染料Gelsafe，取7μl PCR產(chǎn)物加入凝膠孔中，選擇合適的電壓(4V/cm-10V/cm)進(jìn)行電泳，電泳時(shí)間為20-30min，電泳結(jié)束后將凝膠塊置于紫外凝膠成像儀上觀察并拍照，根據(jù)電泳結(jié)果確定樣品中能否擴(kuò)增出目的條帶，如果擴(kuò)增出目的條帶長(zhǎng)度為830bp則證明待測(cè)樣品為IBV檢測(cè)陽(yáng)性，否則為檢測(cè)陰性。

利用上述方法分別對(duì)不同基因型(圖4所示)IBV進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均有較好的檢出，如圖5所示，表明本方法具有良好的通用性。

實(shí)施例5檢測(cè)傳染性支氣管炎病毒的RT-PCR檢測(cè)方法的敏感性檢測(cè)

按照實(shí)施例4建立的方法進(jìn)行。

將cDNA溶液進(jìn)行10倍系列稀釋，稀釋度為10、10²、10³、10⁴和10⁵倍，分別以稀釋后的模板按如下體系進(jìn)行PCR反應(yīng)。

在0.2ml離心管中加入下列成分：

輕輕混勻后，進(jìn)行如下反應(yīng)：94℃預(yù)變性5min，94℃45s，57℃45s，72℃50s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束72℃延伸10min。

利用上述方法分別對(duì)傳染性支氣管炎病毒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示對(duì)反轉(zhuǎn)錄的傳染性支氣管炎病毒cDNA稀釋10⁵倍后，仍能檢測(cè)到病毒DNA，如圖3所示，表明本方法具有良好的敏感性。

實(shí)施例6檢測(cè)傳染性支氣管炎病毒的RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)禽常見(jiàn)病病原的特異性檢測(cè)

1、利用實(shí)施例4建立方法對(duì)其它常見(jiàn)的禽病病原：禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性法氏囊病毒、禽呼腸孤病毒、禽腺病毒和禽傳染性喉氣管炎病毒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示，結(jié)果顯示，除陽(yáng)性對(duì)照外，其他實(shí)驗(yàn)對(duì)象皆為陰性，表明本方法在檢測(cè)禽類常見(jiàn)的其他病原體過(guò)程中，實(shí)施例4建立的方法針對(duì)不同基因型IBV具有良好的特異性。

2、本發(fā)明方法與現(xiàn)有技術(shù)方法的比較

根據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 23197-2008雞傳染性支氣管炎診斷技術(shù))中推薦的檢測(cè)IBV的通用引物序列，如下：

IB-3'-290-F：GGAAGATAGGCATGTAGCTT

IB-3'-290-R：CTAACTCTATACTAGCCTAT

IB-M-740-F：CCTAAGAACGGTTGGAAT

IB-M-740-R：TACTCTCTACACACACAC

進(jìn)行檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)如下不足：(1)上述引物僅能檢測(cè)到稀釋10⁴倍后的IBV cDNA，其敏感性低于本發(fā)明引物(10⁵倍)。如圖8所示。(2)上述國(guó)標(biāo)中使用的反轉(zhuǎn)錄酶為AMV，比本發(fā)明引物使用的反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV貴5倍，無(wú)疑提高了檢測(cè)成本；(3)上述國(guó)標(biāo)中使用兩對(duì)引物進(jìn)行雙重PCR，操作比本發(fā)明方法復(fù)雜，成本高?？梢?jiàn)與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明引物特異度強(qiáng)、靈敏度高，使用本發(fā)明方法進(jìn)行IBV檢測(cè)，操作更加簡(jiǎn)便、成本顯著降低。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。