本發(fā)明涉及基因工程、單細(xì)胞分選技術(shù)及抗體文庫(kù)展示技術(shù)領(lǐng)域,具體地說(shuō),涉及一種人源抗h7n9禽流感病毒高親和力抗體10k及其應(yīng)用。
背景技術(shù):
自2013年2月以來(lái),中國(guó)東南部陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了由甲型h7n9禽流感病毒引起人感染病例,由上海、安徽逐漸蔓延到全國(guó)其他省市。截至2017年2月,全國(guó)共報(bào)道1079例h7n9流感感染,死亡人數(shù)為417例,死亡率高達(dá)38.6%。目前并無(wú)治療該高致病型禽流感感染的特效藥,而現(xiàn)有非特異性藥物神經(jīng)氨酸酶抑制劑-奧司他韋的療效僅局限于感染早期。由于高致病性h7n9感染的前期癥狀與普通流感并無(wú)明顯區(qū)別,大部分感染者錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)間而發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(ards)和多器官衰竭。高致病性禽流感病毒的抗原快速、靈敏診斷需求迫切。
單克隆抗體是由單一b細(xì)胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對(duì)某一特定抗原表位的免疫球蛋白。人源單克隆抗體由于副作用小,其應(yīng)用于人類疾病治療通常不需要進(jìn)行人源化,避免了此過(guò)程中的的親和力丟失。人源單克隆抗體在感染性疾病的預(yù)防和控制過(guò)程中發(fā)揮了巨大作用,其能中和病毒,還能介導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)病毒感染細(xì)胞的殺傷,其保護(hù)效果在hiv、流感病毒、mers病毒,登革熱病毒,漢坦病毒、麻疹病毒、rsv病毒、狂犬病毒等動(dòng)物感染模型中得到充分的證實(shí)。此外,高親和力、高特異性單克隆抗體還是病原的快速檢測(cè)試劑的關(guān)鍵組分。
2008年以來(lái),單個(gè)b細(xì)胞分選和抗體基因直接擴(kuò)增技術(shù)成為人源抗體篩選的主要途徑之一(tiller等,journalofimmunologicalmethods329,(2008),112–124)。2010年,wu等(science329,(2010)856-861)利用流式細(xì)胞分選技術(shù)分選hiv感染者外周血中抗原特異性的單個(gè)記憶性b細(xì)胞,進(jìn)而利用逆轉(zhuǎn)錄pcr技術(shù)直接擴(kuò)增單個(gè)細(xì)胞的抗體基因vh和vκ/vλ,然后將上述基因片段插入全長(zhǎng)igg重組載體進(jìn)行真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染和表達(dá)純化,成功獲得著名的hiv廣譜中和單克隆抗體vrc01。由于該技術(shù)可以在最短的時(shí)間內(nèi)獲得單細(xì)胞來(lái)源的抗體基因和重組抗體蛋白,并且可以保證抗體重鏈和輕鏈的原始配對(duì)(抗體功能最優(yōu)),單細(xì)胞分選和抗體基因直接擴(kuò)增技術(shù)迅速成為抗體開(kāi)發(fā)領(lǐng)域的重磅工具。迄今為止,該技術(shù)已在hiv,流感,mers,埃博拉,登革熱等病毒的廣譜中和單克隆抗體的篩選上成功運(yùn)用,該技術(shù)獲得的多個(gè)高效抗體先后進(jìn)入藥物臨床研究。單個(gè)b細(xì)胞來(lái)源的基因工程抗體為抗原快速檢測(cè)和抗體制藥領(lǐng)域帶來(lái)了新的希望和廣闊前景。
自h7n9流感病毒爆發(fā)以來(lái),國(guó)內(nèi)外報(bào)道的h7n9特異性抗體屈指可數(shù)。已有抗體雖然具有較好的中和h7n9流感病毒的能力,然而其針對(duì)ha7親和力的高低及亞型特異性方面的研究有待進(jìn)一步深入。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的是提供一種人源抗h7n9禽流感病毒高親和力抗體10k及其應(yīng)用。
本發(fā)明的構(gòu)思如下:全人源抗體的獲得目前主要通過(guò)抗體文庫(kù)展示篩選技術(shù)和單個(gè)b細(xì)胞分選技術(shù)。與單細(xì)胞分選法相比,抗體文庫(kù)篩選獲得的單克隆抗體原始輕重鏈配對(duì)的概率較低,而抗體的原始輕重鏈配對(duì)可能使抗體的功能實(shí)現(xiàn)最大化。單細(xì)胞分選法獲得的抗體基因的輕重鏈,理論上均是來(lái)自于原始配對(duì),因此,單細(xì)胞分選法獲得高效功能性抗體的概率遠(yuǎn)高于抗體文庫(kù)展示篩選法。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的,本發(fā)明人源抗h7n9禽流感病毒高親和力抗體10k或其活性片段,所述高親和力抗體10k或其活性片段的輕鏈及重鏈高變區(qū)cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列如下表所示:
前述的高親和力抗體10k,i)其輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.2所示,或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列;以及
ii)其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno.5所示,或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
前述高親和力抗體10k的輕鏈、重鏈全長(zhǎng)氨基酸序列分別如seqidno.3和seqidno.6所示。
本發(fā)明還提供編碼所述高親和力抗體10k的基因。其中,編碼輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的核苷酸序列分別如seqidno.1和seqidno.4所示。
本發(fā)明還提供表達(dá)盒、表達(dá)載體或克隆載體,其包括包含編碼所述高親和力抗體10k的基因序列的核酸。
本發(fā)明還提供含有所述高親和力抗體10k的編碼基因,或所述表達(dá)盒、載體的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明還提供所述高親和力抗體10k或其活性片段經(jīng)改造得到的單鏈抗體scfv或fab抗體或全抗體免疫球蛋白igg。
本發(fā)明中所述h7n9流感病毒高親和力抗體10k的活性片段是指能夠與7型血凝素蛋白結(jié)合的人源h7n9親和抗體10k的fab片段。
本發(fā)明所述的人源抗h7n9禽流感病毒高親和力抗體10k,可按如下方法制備:利用單個(gè)記憶性b細(xì)胞分選和抗體基因直接擴(kuò)增法獲得h7n9病毒血凝素蛋白特異性抗體的可變區(qū)片段,隨后通過(guò)基因工程方法構(gòu)建完整igg抗體的真核瞬間表達(dá)載體,并表達(dá)純化出igg蛋白。
該抗體是由存在于抗體輕鏈和重鏈基因可變區(qū)中的高變區(qū)(cdrs)特異性基因序列決定的,并能夠在真核細(xì)胞中獲得有效表達(dá)的特異性結(jié)合h7n9流感病毒血凝素蛋白的功能性抗體。它能高效結(jié)合7型血凝素蛋白(圖3,圖4),并具有介導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)h7n9病毒感染細(xì)胞的殺傷(adcc)功能(圖5)。
本發(fā)明h7n9流感病毒高親和力抗體10k的輕鏈和重鏈基因來(lái)源于h7n9禽流感病毒感染患者外周血b細(xì)胞。其輕鏈和重鏈可變區(qū)相應(yīng)的三個(gè)cdr區(qū)序列組合及其cdr區(qū)之間的框架區(qū)序列構(gòu)成了該抗體可變區(qū)序列特征,抗體10k的輕鏈可變區(qū)基因?qū)儆诩易錳gkv3-20,重鏈屬于家族ighv5-51??贵w蛋白功能由存在于抗體基因輕鏈和重鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定簇cdr1、cdr2和cdr3中特異性核苷酸序列及其互補(bǔ)序列所決定,6個(gè)相應(yīng)的cdr區(qū)氨基酸序列構(gòu)成了抗體的特異性抗原結(jié)合區(qū)域,決定了本發(fā)明抗體的抗原結(jié)合特征和抗h7n9禽流感病毒功能特征。
此外,考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性,例如可在其編碼區(qū),在不改變氨基酸序列的條件下,對(duì)編碼10k可變區(qū)的基因序列進(jìn)行改造,獲得編碼具有相同功能的抗體的基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)表達(dá)抗體宿主的密碼子偏愛(ài)性,人工合成改造基因,以提高抗體的表達(dá)效率。
進(jìn)一步地,本發(fā)明所述h7n9流感病毒高親和力抗體10k的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)可經(jīng)過(guò)重組以形成較小分子量的fab抗體或更小分子量的單鏈抗體(scfv)。fab抗體和單鏈抗體同樣具有識(shí)別h7n9流感病毒表面抗原的特性。小分子量的抗體具有穿透力強(qiáng),易進(jìn)入局部組織或細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。
可將上述編碼fab抗體的基因、scfv抗體的基因克隆到表達(dá)載體,進(jìn)而轉(zhuǎn)化宿主,通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)獲得fab抗體和單鏈抗體(scfv)。
利用sds-page、elisa、體外病毒中和實(shí)驗(yàn)、抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性殺傷(adcc)實(shí)驗(yàn)等方法對(duì)獲得的igg抗體10k進(jìn)行功能鑒定,結(jié)果表明表達(dá)純化的人源igg抗體10k分子量大小符合預(yù)期(圖2),其可以高效特異性結(jié)合7型血凝素蛋白(圖3,圖4),具有介導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)h7n9病毒感染細(xì)胞的殺傷(adcc)活性(圖5)。
本發(fā)明還提供所述高親和力抗體10k或其活性片段在制備預(yù)防或治療由h7n9禽流感病毒引起的疾病,特別是呼吸道疾病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供所述高親和力抗體10k或其活性片段在制備h7n9禽流感病毒抗原檢測(cè)試劑或檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
本發(fā)明進(jìn)一步提供含有所述高親和力抗體10k或其活性片段的藥物、檢測(cè)試劑或檢測(cè)試劑盒。
本發(fā)明采用多色熒光標(biāo)記的流式細(xì)胞儀分選法獲得7型血凝素蛋白抗原特異性記憶性b細(xì)胞,利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得單個(gè)b細(xì)胞的cdna,利用抗體特異性引物擴(kuò)增抗體基因可變區(qū)片段,利用基因工程技術(shù)構(gòu)建真核igg表達(dá)載體,利用細(xì)胞工程技術(shù)通過(guò)瞬間轉(zhuǎn)染和抗體純化技術(shù)獲得純化的目標(biāo)igg抗體10k;利用上述獲得的人源高親和力h7n9禽流感病毒基因工程抗體可變區(qū)基因,可以以fab抗體、單鏈抗體基因及全長(zhǎng)igg抗體的形式在原核細(xì)胞、真核細(xì)胞(包括酵母細(xì)胞)及任何重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)和生產(chǎn)該抗體,或以上述可變區(qū)基因?yàn)榛A(chǔ)的改造后的含有該抗體基因的任何其他基因,獲得具有高親和力特異性識(shí)別h7n9流感病毒并能介導(dǎo)殺傷h7n9病毒感染細(xì)胞的抗體產(chǎn)物,用以開(kāi)發(fā)h7n9流感病毒抗原快速檢測(cè)試劑盒或制成臨床上用于預(yù)防和治療由h7n9禽流感病毒引起的疾病,如急性呼吸道傳染病的特異性抗體藥物。
本發(fā)明提供的抗體10k可以高效結(jié)合h7n9流感病毒血凝素蛋白ha7,其針對(duì)ha7蛋白親和力的ec50=0.00698μg/ml(0.0465nm)(圖3)。具體地,抗體10k在與7型血凝素蛋白親和力檢測(cè)的elisa實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)抗體濃度低至0.00698μg/ml(0.0465nm)時(shí),其od450值仍可以達(dá)到最大值的一半。本發(fā)明提供的抗體可用于h7n9流感病毒抗原檢測(cè)試劑的開(kāi)發(fā)。
本發(fā)明提供的抗體10k可以特異性地識(shí)別h7n9流感病毒血凝素蛋白ha7。通過(guò)elisa實(shí)驗(yàn)檢測(cè)igg10k與h1n1、h5n1和h7n9流感病毒的血凝素蛋白的親和力,結(jié)果發(fā)現(xiàn),igg10k特異性地識(shí)別h7n9的血凝素蛋白,ec50=0.00698μg/ml(0.0465nm),而對(duì)h1n1和h5n1流感病毒的血凝素蛋白不具有結(jié)合能力,說(shuō)明其為ha7亞型特異性抗體(圖4)。本發(fā)明提供的抗體可用于h7n9流感病毒抗原檢測(cè)試劑的開(kāi)發(fā)。
本發(fā)明提供的抗體10k可以有效地介導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞(如nk細(xì)胞)對(duì)h7n9感染細(xì)胞的殺傷。具體地,10μg/ml的10k抗體介導(dǎo)的針對(duì)h7n9感染的mdck細(xì)胞的殺傷百分?jǐn)?shù)可達(dá)43.5%(圖5)。本發(fā)明提供的抗體可以用于h7n9流感病毒感染患者的治療。
附圖說(shuō)明
圖1為本發(fā)明基于單細(xì)胞分選和抗體基因擴(kuò)增的全人源單克隆抗體技術(shù)平臺(tái)示意圖。
圖2為本發(fā)明igg10k的變性和非變性sds-page電泳檢測(cè)抗體分子量和純度。
圖3為本發(fā)明實(shí)施例中igg10k針對(duì)ha7蛋白親和力檢測(cè)結(jié)果(elisa法)。其中,ha7蛋白以1μg/ml的濃度包被在elisa板上,igg10k從333.3nm開(kāi)始4倍梯度稀釋。當(dāng)od450值為最高值一半時(shí)抗體10k的濃度即為其針對(duì)ha7的ec50值。igg9114l作為陰性對(duì)照同樣進(jìn)行梯度稀釋檢測(cè)其與ha7的親和力,igg9114l為廣譜中和抗體cr9114(參考文獻(xiàn):dreyfusc,laursenns,kwakst,zuijdgeestd,khayatr,ekiertdc,etal.highlyconservedprotectiveepitopesoninfluenzabviruses.science2012sep14;337(6100):1343-8)。
圖4為本發(fā)明實(shí)施例中igg10k針對(duì)不同亞型及不同片段ha蛋白的親和力檢測(cè)結(jié)果(elisa法)。igg10k的孵育濃度為0.1μg/ml。h7為包被的influenzaah7n9(a/shanghai/2/2013)血凝素蛋白1μg/ml(acrobiosystems,貨號(hào)ha9-v5227);h1為包被的influenzaah1n1(a/beijing/22808/2009)血凝素蛋白1μg/ml(北京義翹神州生物技術(shù)有限公司,貨號(hào)40035-v08h-100),h5為包被的influenzaah5n1(a/commonmagpie/hongkong/2256/2006)血凝素蛋白1μg/ml(北京義翹神州生物技術(shù)有限公司,貨號(hào)11700-v08h-100)。
圖5為本發(fā)明實(shí)施例中igg10k針對(duì)h7n9感染細(xì)胞的adcc活性檢測(cè)結(jié)果。sp17病毒感染mdck細(xì)胞48h后,加入10μg/ml的抗體吸附細(xì)胞,去掉上清后加入健康人外周血淋巴細(xì)胞,培養(yǎng)4h后檢測(cè)上清乳酸脫氫酶活性(od492)。每個(gè)抗體各設(shè)6個(gè)試驗(yàn)復(fù)孔,4個(gè)陰性對(duì)照復(fù)孔(未加抗體)和4個(gè)陽(yáng)性對(duì)照復(fù)孔(加入裂解液),取平均值用于計(jì)算細(xì)胞殺傷活性:adcc%=100×(od492試驗(yàn)孔-od492陰性對(duì)照孔)/(od492陽(yáng)性對(duì)照-od492陰性對(duì)照)。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明,但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明,實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件,如sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001),或按照制造廠商說(shuō)明書(shū)建議的條件。
實(shí)施例1人源抗h7n9禽流感病毒高親和力抗體10k及其制備方法
1、抗原的標(biāo)記
從acrobiosystems(ha9-v5227)公司購(gòu)買(mǎi)ha7蛋白,用pbs稀釋成0.5-2mg/ml,然后利用thermal公司的生物素(ez-linktmsulfo-nhs-lc-biotin,21335)按照其試劑盒流程將ha7蛋白標(biāo)記(分子數(shù)之比為蛋白:生物素=1:20-100),室溫避光孵育0.5-2h,然后用10kd的離心半透柱(merckmillipore,ufc501096)以8000g離心4-6次,用無(wú)菌pbs補(bǔ)充,將多余的生物素分子去除干凈,標(biāo)記好的ha7蛋白分子將用于篩選ha7特異性的記憶性b細(xì)胞。
2、抗原特異性的記憶性b細(xì)胞分選及逆轉(zhuǎn)錄
分離h7n9感染患者恢復(fù)期外周血單個(gè)核細(xì)胞,用pbs洗滌一次,然后用含1%bsa的pbs(pbsa)重懸到106~108/ml,先加入生物素化的ha7蛋白使?jié)舛冗_(dá)到10μg/ml,混勻后4℃孵育半小時(shí),然后用pbs洗滌一次,再用同樣體積的pbsa重懸pbmc,然后按照1:50的體積比加入購(gòu)自biolegend公司的小鼠抗人cd19(apc-h7),小鼠抗人igg(apc),小鼠抗人igm(percp-cy5.5)和小鼠抗人cd27(fitc),同時(shí)按照1:200的體積比加入invitrogen公司的7aad(percp-cy5.5)和jacksonimmunolab的streptavidin-pe(016-110-084),混勻后4℃孵育半小時(shí)。pbs洗滌兩遍,pbsa重懸后用于細(xì)胞分選。利用bdfacsariaiii分選患者pbmc中cd19+,igm-,igg+,cd27+,7aad-,ha7/pe+陽(yáng)性的細(xì)胞,每孔1個(gè)細(xì)胞,用5μlresuspensionbuffer(superscripttmiiicellsdirectcdnasynthesissystem,invitrogen18080-300)收集細(xì)胞,-80℃保存或直接按照試劑盒的說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄成cdna,-20℃保存。
3、抗體基因可變區(qū)的擴(kuò)增
利用tiller于2008年發(fā)表在jimmunolmethods雜志上描述的引物和擴(kuò)增方式擴(kuò)增抗體基因重鏈可變區(qū)(vh)和輕鏈可變區(qū)(vk/vl)。vh,vk,vl分別進(jìn)行兩輪擴(kuò)增,首先取3-5μlcdna作為模板,用抗體可變區(qū)基因先導(dǎo)序列特異性引物進(jìn)行第一輪擴(kuò)增,具體地,引物1-4和引物45、46擴(kuò)增重鏈可變區(qū)(vh);引物17、18、19和引物51擴(kuò)增kappa鏈可變區(qū)(vk),引物31-37和引物57擴(kuò)增lambda鏈可變區(qū)(vl)。然后利用帶有酶切位點(diǎn)的巢式引物,以5μl第一輪擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二輪擴(kuò)增,具體地,引物5-16和引物48-50擴(kuò)增重鏈可變區(qū)(vh);引物21-30和引物53-56擴(kuò)增kappa鏈可變區(qū)(vk),引物38-43和引物58擴(kuò)增lambda鏈可變區(qū)(vl)。pcr體系采用tiangen的superhifipcrmix(kt212)2×pcrmix。pcr程序?yàn)椋?5℃3min;95℃30sec,58-60℃30sec,72℃1min,50個(gè)循環(huán);72℃10min;4℃10min。擴(kuò)增產(chǎn)物利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳(120v,40min),切取400bp左右的可變區(qū)片段。為了避免污染造成的假陽(yáng)性,利用沒(méi)有分選細(xì)胞的孔的cdna為模板作為第一輪pcr的陰性對(duì)照,利用沒(méi)有加入第一輪pcr產(chǎn)物為模板的反應(yīng)作為第二輪pcr的陰性對(duì)照。對(duì)于已經(jīng)擴(kuò)增出來(lái)的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)進(jìn)行配對(duì),只有同時(shí)擴(kuò)增出重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的配對(duì)才進(jìn)行下一步酶切和載體構(gòu)建。
4、瞬時(shí)真核表達(dá)載體的構(gòu)建
利用tiller于2008年發(fā)表在jimmunolmethods雜志上描述的抗體基因瞬間表達(dá)載體系統(tǒng)構(gòu)建瞬間表達(dá)載體。該系統(tǒng)共含3個(gè)載體,分別用于表達(dá)igg1重鏈、kappa鏈和lambda鏈,分別命名為igh(accessionnumberdq407610)、igk(accessionnumberdq407610)和igl(accessionnumberfj517647)。按照該系統(tǒng),只要將載體和帶有酶切位點(diǎn)的可變區(qū)片段進(jìn)行雙酶切,連接,轉(zhuǎn)化,即可得到能在真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染獲得全長(zhǎng)igg1的抗體。重鏈載體和片段采用agei和sali雙酶切,kappa鏈載體和片段采用agei和bsiwi雙酶切,lambda鏈載體和片段采用agei和xhoi雙酶切。轉(zhuǎn)化大腸桿菌后,挑取單克隆,利用5’absense引物(引物44)對(duì)載體插入序列進(jìn)行測(cè)序,每個(gè)轉(zhuǎn)化挑取3-5個(gè)細(xì)菌單克隆進(jìn)行測(cè)序,以三個(gè)測(cè)序結(jié)果一致,插入序列和載體一起可以翻譯成完整抗體片段,且插入序列不同于原始載體酶切前序列為載體構(gòu)建成功。
抗體基因擴(kuò)增所用的引物(5′-3′):
1l-vh1acaggtgcccactcccaggtgcag
2l-vh3aaggtgtccagtgtgargtgcag
3l-vh4/6cccagatgggtcctgtcccaggtgcag
4l-vh5caaggagtctgttccgaggtgcag
5ageivh1ctgcaaccggtgtacattcccaggtgcagctggtgcag
6ageivh1/5ctgcaaccggtgtacattccgaggtgcagctggtgcag
7ageivh3ctgcaaccggtgtacattctgaggtgcagctggtggag
8ageivh3–23ctgcaaccggtgtacattctgaggtgcagctgttggag
9ageivh4ctgcaaccggtgtacattcccaggtgcagctgcaggag
10ageivh4–34ctgcaaccggtgtacattcccaggtgcagctacagcagtg
11ageivh1–18ctgcaaccggtgtacattcccaggttcagctggtgcag
12ageivh1–24ctgcaaccggtgtacattcccaggtccagctggtacag
13ageivh3–33ctgcaaccggtgtacattctcaggtgcagctggtggag
14ageivh3–9ctgcaaccggtgtacattctgaagtgcagctggtggag
15ageivh4–39ctgcaaccggtgtacattcccagctgcagctgcaggag
16ageivh6–1ctgcaaccggtgtacattcccaggtacagctgcagcag
17lvκ1/2atgaggstcccygctcagctgctgg
18lvκ3ctcttcctcctgctactctggctcccag
19lvκ4atttctctgttgctctggatctctg
20panvκatgacccagwctccabycwccctg
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5、單克隆抗體的制備和純化
將2ml含有構(gòu)建成功載體的大腸桿菌接種到2yt培養(yǎng)基(trypton16g/l,yeastextract10g/l,nacl5g/l,ampicillin100μg/ml)200ml中,37℃220rpm培養(yǎng)16h。6000g離心15min收集菌體,按照thermal公司的質(zhì)粒大量提取試劑盒(
為本發(fā)明基于單細(xì)胞分選和抗體基因擴(kuò)增的全人源單克隆抗體技術(shù)平臺(tái)示意圖見(jiàn)圖1。
實(shí)施例2單克隆抗體10k針對(duì)ha7蛋白的ec50測(cè)定
用elisa包被液稀釋ha7蛋白至1μg/ml,然后每孔50μl包被elisa板(corning,3690),4℃過(guò)夜。pbst洗板,含5%脫脂牛奶的pbs封閉2h以上。將單克隆抗體從50μg/ml的起始濃度開(kāi)始,用含5%脫脂牛奶的pbs進(jìn)行4倍梯度稀釋后,加入封閉好的elisa板。共設(shè)置10個(gè)梯度,兩個(gè)重復(fù),不加抗體的孔為陰性對(duì)照,加入梯度稀釋的igg9114l(即cr9114,dreyfusc,laursenns,kwakst,zuijdgeestd,khayatr,ekiertdc,etal.highlyconservedprotectiveepitopesoninfluenzabviruses.science2012sep14;337(6100):1343-8)為抗體對(duì)照。羊抗人iggfc-hrp(1:10000,jacksonimmunolab,109-036-098)為二抗,100μltmb顯色,100μl0.2m的硫酸終止,酶標(biāo)儀讀取od450值。取每個(gè)梯度的復(fù)孔的平均值,繪制od450-濃度曲線,按照graphpadprism的sigmoidaldoseresponse模型進(jìn)行曲線擬合,并計(jì)算od450值為最高值一半(即1.6)時(shí)對(duì)應(yīng)的抗體濃度,此即為抗體針對(duì)ha7的ec50值。
實(shí)施例3單克隆抗體10k針對(duì)h7n9(a/shenzhen/sp17/2014(h7n9))的中和活性測(cè)定
在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板接種mdck細(xì)胞,培養(yǎng)至細(xì)胞密度約為70%-90%,pbs洗兩遍后備用;將待檢測(cè)的單克隆抗體在96孔微量滴定板上進(jìn)行3倍的倍比稀釋(100μg/ml起始),每個(gè)待檢測(cè)抗體做4個(gè)孔的重復(fù),8個(gè)梯度;根據(jù)病毒的tcid50滴度稀釋病毒,使稀釋后的病毒滴度為200tcid50/100μl;取60μl稀釋后的病毒液與60μl稀釋好的單克隆抗體樣本混合,37℃培養(yǎng)箱中孵育2h使抗原抗體充分作用;然后取病毒血漿混合物100μl置洗好的96孔mdck細(xì)胞,37℃培養(yǎng)箱中感染1h,用加有tpck胰酶的mem培養(yǎng)基150μl置換病毒液,置37℃co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h,觀察cpe,紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)確認(rèn)cpe結(jié)果。根據(jù)reed-muench法計(jì)算距離比,以能夠抑制半數(shù)孔mdck細(xì)胞感染的濃度作為衡量單抗中和活性的ic50值。
實(shí)施例4單克隆抗體10k的抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性殺傷(adcc)活性檢測(cè)
在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板接種mdck細(xì)胞,培養(yǎng)至細(xì)胞密度約為70%-90%,pbs洗兩遍;用1000tcid50每孔的病毒量感染每孔mdck細(xì)胞,于含5%co2的37℃培養(yǎng)箱中感染1h,隨后去掉上清,加170μl病毒生長(zhǎng)液(mem培養(yǎng)基[thermal,11095-080)含1%青霉素-鏈霉素雙抗(thermal,15140163)和0.1-0.5μg/mltpck胰酶(sigma,t1426)],置于37℃co2,濃度為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h;pbs洗滌病毒感染的細(xì)胞兩遍,每孔加入含10μg/ml待測(cè)抗體的mem培養(yǎng)基(thermal,11095-080),置于37℃,co2濃度為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min,去掉上清,pbs洗滌一次,去掉上清,每孔加入200μl含5×105來(lái)自健康人pbmc的mem培養(yǎng)基,置于37℃,co2濃度為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。利用promega公司的非放射性細(xì)胞毒性試驗(yàn)檢測(cè)試劑盒(g1780),按照操作流程檢測(cè)培養(yǎng)上清中乳酸脫氫酶(ldh)活性。酶標(biāo)儀讀取od492值。未加抗體或加入非流感相關(guān)抗體的孔為陰性對(duì)照,加入試劑盒裂解液(未加pbmc)的孔為陽(yáng)性對(duì)照。adcc%=100×(od492試驗(yàn)孔-od492陰性對(duì)照孔)/(od492陽(yáng)性對(duì)照-od492陰性對(duì)照)。
本發(fā)明提供的抗體10k可以高效結(jié)合h7n9流感病毒血凝素蛋白ha7,其針對(duì)ha7蛋白親和力的ec50=0.00698μg/ml(0.0465nm)(圖3)。具體地,抗體10k在與7型血凝素蛋白親和力檢測(cè)的elisa實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)抗體濃度低至0.00698μg/ml(0.0465nm)時(shí),其od450值仍可以達(dá)到最大值的一半。本發(fā)明提供的抗體可用于h7n9流感病毒抗原檢測(cè)試劑的開(kāi)發(fā)。
本發(fā)明提供的抗體10k可以特異性地識(shí)別h7n9流感病毒血凝素蛋白ha7。通過(guò)elisa實(shí)驗(yàn)檢測(cè)igg10k與h1n1、h5n1和h7n9流感病毒的血凝素蛋白的親和力,結(jié)果發(fā)現(xiàn),igg10k特異性地識(shí)別h7n9的血凝素蛋白,ec50=0.00698μg/ml(0.0465nm),而對(duì)h1n1和h5n1流感病毒的血凝素蛋白不具有結(jié)合能力,說(shuō)明其為ha7亞型特異性抗體(圖4)。本發(fā)明提供的抗體可用于h7n9流感病毒抗原檢測(cè)試劑的開(kāi)發(fā)。
本發(fā)明提供的抗體10k可以有效地介導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞(如nk細(xì)胞)對(duì)h7n9感染細(xì)胞的殺傷。具體地,10μg/ml的10k抗體介導(dǎo)的針對(duì)h7n9感染的mdck細(xì)胞的殺傷百分?jǐn)?shù)可達(dá)43.5%(圖5)。本發(fā)明提供的抗體可以用于h7n9流感病毒感染患者的治療。
雖然,上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述,但在本發(fā)明基礎(chǔ)上,可以對(duì)之做一些修改或改進(jìn),這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此,在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn),均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
序列表
<110>深圳普蘭達(dá)科技有限公司
<120>人源抗h7n9禽流感病毒高親和力抗體10k及其應(yīng)用
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