本申請是2012年9月18日提交的題為“免疫球蛋白基因多樣性的操縱及多抗體治療劑”的中國專利申請201280056528.x的分案申請。

發(fā)明領域

本發(fā)明涉及提供具有長hcdr3長度的抗體。本發(fā)明還涉及提供在免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因座中新的v、d和j配對。本發(fā)明提供了新的、偏向的(biased)抗體多樣性和潛在擴展的多樣性。本發(fā)明還提供了新的和潛在擴展的多樣性或者偏向于抗體共有的可變基因使用的多樣性，可用于治療和/或預防某些疾病或病癥，如感染性疾病。偏向抗體所有成分的這種能力還提供了簡化生產抗體混合物如可用于治療和/或預防感染性疾病的多克隆抗體治療劑的方法，其中需要靶向多個病原體抗原的多克隆方法。為此，本發(fā)明還提供了雙特異性抗體，其能結合一個以上的抗原(例如由相同病原體表達的多個感染性抗原)，因此提供了多克隆抗體混合物不可能有的優(yōu)勢(如生產、用量和施用優(yōu)勢)。

本發(fā)明提供了脊椎動物和細胞，如轉基因小鼠或大鼠或者轉基因小鼠或大鼠細胞。此外，本發(fā)明涉及使用脊椎動物分離抗體或者編碼抗體的核苷酸序列的方法。本發(fā)明還提供了抗體、核苷酸序列、藥物組合物及應用。

發(fā)明背景

現有技術提供了包含轉基因免疫球蛋白基因座的非人脊椎動物(例如小鼠和大鼠)和細胞，這種基因座包含人可變(v)、多樣性(d)和/或連接(j)區(qū)段，及任選存在的人恒定區(qū)。或者，在轉基因基因座中提供了宿主脊椎動物的內源性恒定區(qū)(例如小鼠或大鼠恒定區(qū))。構建這種轉基因脊椎動物及使用其在抗原免疫之后產生抗體及其核酸的方法為本領域已知，見例如us7501552(medarex)、us5939598(abgenix)、us6130364(abgenix)、wo02/066630(regeneron)、wo2011004192(genomeresearchlimited)、wo2009076464、wo2009143472和wo2010039900(ablexis)所述，所述文獻并入本文作參考。本領域中的這種轉基因基因座包括不同量的人v(d)j庫集(repertoire)。

現有的轉基因免疫球蛋白基因座趨于基于單一人dna來源。攜帶這種轉基因基因座的非人脊椎動物中人抗體可變區(qū)的潛在多樣性因此受到所用的庫集的限制。

希望在轉基因免疫球蛋白基因座及攜帶其的非人脊椎動物中以及在免疫這些動物之后產生的抗體中提供人可變區(qū)的新的及潛在擴展的庫集和多樣性。

發(fā)明概述

本發(fā)明人通過構建轉基因非人脊椎動物、免疫、抗體重鏈收集及深度生物信息學分析，已經揭示了怎樣合理設計vh結構域、重鏈及具有長hcdr3的抗體。這些可用于針對(addressing)抗原(如感染性疾病病原體抗原，受體和酶裂縫)，其中較長的cdr更好地針對靶位。

本發(fā)明人還認識到以新的方式提供v、d和j基因區(qū)段的組合以在免疫球蛋白基因座中提供在天然或在本領域現有基因座中未發(fā)現的合成的基因區(qū)段組合的可能性。本發(fā)明人認識到在轉基因免疫球蛋白基因座及攜帶其的非人脊椎動物以及在免疫這些動物之后產生的抗體中提供人可變區(qū)的新的和潛在擴展的庫集和多樣性的重要性。一方面，本發(fā)明人認識到希望偏向于新的庫集以產生具有改良的親和性和/或生物物理學特性的抗體，和/或其中通過這種庫集產生的表位特異性的范圍是新的，為抗體提供迄今為止通過現有轉基因免疫球蛋白基因座難處理或者難以針對的表位。例如，本發(fā)明人設想了特異性應用以偏向新的庫集產生可用于治療和/或預防感染性疾病的抗體。

為此，本發(fā)明的第一種配置是提供非人脊椎動物(任選小鼠或大鼠)或者脊椎動物細胞，其基因組包含：

(a)免疫球蛋白重鏈基因座，其包含位于恒定區(qū)上游的一或多個人v基因區(qū)段、一或多個人d基因區(qū)段及一或多個人j基因區(qū)段；任選其中重鏈基因座處于下文描述的本發(fā)明的任一配置中；及

(b)免疫球蛋白輕鏈基因座，其包含：

(i)位于恒定區(qū)上游的一或多個人vh基因區(qū)段和一或多個人j基因區(qū)段(任選重排的vhjlcl或vhjλcl，其中cl是cλ或cκ)；或者

(ii)位于恒定區(qū)上游的一或多個人vl基因區(qū)段、一或多個人d基因區(qū)段及一或多個人jh基因區(qū)段(任選重排的vldjhcl或vλdjhcl，其中cl是cλ或cκ)；或者

(iii)位于恒定區(qū)上游的一或多個人vl基因區(qū)段以及一或多個人jl基因區(qū)段，所述人vl基因區(qū)段選自如下一組中：vλii基因家族成員、vλvii4a、vλii2.1、vλvii4a、vλ1基因家族成員、vλ3基因家族成員、iglv1s2、vλ3-cml70、lalh2、lalvl、la3h3、kv325、vκi基因家族成員、κi-15a(kl012)、vκii家族成員、vκiii家族成員、vκi基因家族成員、κi-15a(kl012)、vκiia2(任選a2a等位基因)、vκa27(humkv325)及與其至少80％相同的基因區(qū)段；

其中所述重鏈基因座中的基因區(qū)段與其恒定區(qū)可操縱地連接，所述輕鏈基因座中的基因區(qū)段與其恒定區(qū)可操縱地連接，由此在免疫時，小鼠能產生包含通過重鏈基因座的重組產生的重鏈和通過輕鏈基因座的重組產生的輕鏈的抗體。

一方面，

在(b)(i)中，所述輕鏈基因座的v基因區(qū)段庫集包含或者由一或多個vh基因區(qū)段組成，所述vh基因區(qū)段選自如下一組中：vhiii基因家族成員(任選vhiiia或vhiiib家族成員)、vhiv基因家族成員、vhiii9.1(vh3-15)、vhiiivh26(vh3-23)、vh3-21、lsg6.1、lsg12.1、dp77(v3-21)、vhh11、vh1grr、ha3h2、vhi-ha1c1、vhiii-vh2-1、vh4.18、ha4h3、hv1051、71-2、hv1f10、vh4.11、71-4、vh251、vh1-69及與其至少80％相同的基因區(qū)段；或者

在(b)(iii)中，輕鏈基因座v基因區(qū)段庫集由一種vl基因區(qū)段類型(任選及一或多種其突變體)組成，其中vl基因區(qū)段選自所述一組vl基因區(qū)段。

在本發(fā)明的第二種配置中，提供了：

非人脊椎動物(任選小鼠或大鼠)或者脊椎動物細胞，其基因組包含：

(a)免疫球蛋白重鏈基因座，其包含位于恒定區(qū)上游的一或多個人v基因區(qū)段、一或多個人d基因區(qū)段及一或多個人j基因區(qū)段；及

(b)(i)未重排的免疫球蛋白輕鏈基因座，其包含位于恒定區(qū)上游的一或多個人vh基因區(qū)段和一或多個人j基因區(qū)段，其中每個人vh基因區(qū)段是與用于產生編碼來自抗體表達細胞的人抗體重鏈可變區(qū)的重排的vdj的人vh基因區(qū)段(或其突變體)相同的人基因區(qū)段，其中所述抗體結合感染性疾病病原體抗原(任選所述抗體的可變區(qū)與來自患有、易感于或恢復自由攜帶或分泌所述抗原的生物體引起或介導的疾病或病癥的人類個體或者來自攜帶所述生物體的人類個體的抗體相同)；或者

(ii)免疫球蛋白輕鏈基因座，其包含位于恒定區(qū)上游的重排的vj區(qū)或者vdj區(qū)，其中所述重組區(qū)的核苷酸序列與通過人j基因區(qū)段及任選存在的人d基因區(qū)段與人vh基因區(qū)段的重組產生的核苷酸序列相同，所述人vh基因區(qū)段與用于產生編碼來自抗體表達細胞的人抗體重鏈可變區(qū)的重排的vdj的人vh基因區(qū)段(或其突變體)相同，其中所述抗體結合感染性疾病病原體抗原(任選所述抗體的可變區(qū)與來自患有、易感于或者恢復自由攜帶或分泌所述抗原的生物體引起或介導的疾病或病癥的人類個體或者來自攜帶所述生物體的人類個體的抗體相同)；

(c)其中所述重鏈基因座中的基因區(qū)段與其恒定區(qū)可操縱地連接，所述輕鏈基因座中的基因區(qū)段或vj或vdj與其恒定區(qū)可操縱地連接，由此在免疫時，小鼠能產生包含通過所述重鏈基因座的重組產生的重鏈和衍生自所述輕鏈基因座的輕鏈的抗體；

(d)任選地，當應用(b)(i)時，所述輕鏈基因座中每個所述vh基因區(qū)段選自如下一組中：vhiii基因家族成員(任選vhiiia或vhiiib家族成員)、vhiv基因家族成員、vhiii9.1(vh3-15)、vhiiivh26(vh3-23)、vh3-21、lsg6.1、lsg12.1、dp77(v3-21)、vhh11、vh1grr、ha3h2、vhi-ha1c1、vhiii-vh2-1、vh4.18、ha4h3、hv1051、71-2、hv1f10、vh4.11、71-4、vh251、vh1-69及與其至少80％相同的基因區(qū)段；

(e)任選地，當應用(b)(ii)時，重組區(qū)的核苷酸序列與通過人j基因區(qū)段及任選存在的人d基因區(qū)段與人vh基因區(qū)段重組產生的核苷酸序列相同，所述人vh基因區(qū)段選自如下一組中：vhiii基因家族成員(任選vhiiia或vhiiib家族成員)、vhiv基因家族成員、vhiii9.1(vh3-15)、vhiiivh26(vh3-23)、vh3-21、lsg6.1、lsg12.1、dp77(v3-21)、vhh11、vh1grr、ha3h2、vhi-ha1c1、vhiii-vh2-1、vh4.18、ha4h3、hv1051、71-2、hv1f10、vh4.11、71-4、vh251、vh1-69及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

一方面，所述輕鏈基因座的v基因區(qū)段庫集包含或者由一個人vh基因區(qū)段、任選種系vh及其一或多種多態(tài)性變體組成，例如每個多態(tài)性變體與種系vh核苷酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個位置不同。一方面，所述輕鏈基因座的v基因區(qū)段庫集包含或者由人vh1-69基因區(qū)段、任選種系vh1-69及其一或多種多態(tài)性變體組成，例如每個多態(tài)性變體與種系vh1-69核苷酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個位置不同。下文提供了構建包含vh1-69及多態(tài)性變體的免疫球蛋白基因座的實例。通過使用特定基因區(qū)段(例如通常在人體中對抗感染或者其它病癥產生的人抗體中發(fā)現的一個基因區(qū)段)及其一或多種多態(tài)性變體，可以提供基因的庫集且仍使抗體基因庫集偏向于與疾病(例如感染性疾病，如細菌或病毒性疾病，如流感)相關的基因區(qū)段。這提供了有用的基因庫，從中最后產生并分離先導抗體(leadantibody)以治療/預防所述研究的疾病。在一個實例中，所述多態(tài)性變體是在人類或人群中見到的天然變體。技術人員將獲知人抗體基因序列的來源，如imgt(www.imgt.org)、genbank(www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)及1000基因組數據庫(www.1000genomes.org)。關于數據庫操作的生物信息學工具也易于獲得且為技術人員已知，例如從1000genomesproject/ebi(www.1000genomes.org)中公開獲得。

另一方面，所述脊椎動物或細胞的基因組對于輕鏈基因座(b)(i)或(ii)是純合的，任選其中：

-所述輕鏈基因座的v基因區(qū)段庫集由一或多個人vh基因區(qū)段組成，所述vh基因區(qū)段選自如下一組中：vhiii基因家族成員(任選vhiiia或vhiiib家族成員)、vhiv基因家族成員、vhiii9.1(vh3-15)、vhiiivh26(vh3-23)、vh3-21、lsg6.1、lsg12.1、dp77(v3-21)、vhh11、vh1grr、ha3h2、vhi-ha1c1、vhiii-vh2-1、vh4.18、ha4h3、hv1051、71-2、hv1f10、vh4.11、71-4、vh251、vh1-69及與其至少80％相同的基因區(qū)段；或者

-所述輕鏈基因座的重組的vj或vdj庫集由與通過人vh基因區(qū)段與人j基因區(qū)段及任選存在的人d基因區(qū)段重組產生的一或多個核苷酸序列相同的序列組成，所述人vh基因區(qū)段選自如下一組中：vhiii基因家族成員(任選vhiiia或vhiiib家族成員)、vhiv基因家族成員、vhiii9.1(vh3-15)、vhiiivh26(vh3-23)、vh3-21、lsg6.1、lsg12.1、dp77(v3-21)、vhh11、vh1grr、ha3h2、vhi-ha1c1、vhiii-vh2-1、vh4.18、ha4h3、hv1051、71-2、hv1f10、vh4.11、71-4、vh251、vh1-69及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

另一方面，所述脊椎動物或細胞的每個免疫球蛋白輕鏈基因座是如(b)(i)所述，包含僅一個人vh基因區(qū)段，所述人vh基因區(qū)段選自如下一組中：vhiii基因家族成員(任選vhiiia或vhiiib家族成員)、vhiv基因家族成員、vhiii9.1(vh3-15)、vhiiivh26(vh3-23)、vh3-21、lsg6.1、lsg12.1、dp77(v3-21)、vhh11、vh1grr、ha3h2、vhi-ha1c1、vhiii-vh2-1、vh4.18、ha4h3、hv1051、71-2、hv1f10、vh4.11、71-4、vh251、vh1-69及與其至少80％相同的基因區(qū)段，任選其中所述脊椎動物或細胞的基因組對于所述輕鏈是純合的，由此所有輕鏈基因座均包含相同的單個人vh基因區(qū)段。

本發(fā)明提供了分離結合預定抗原的抗體的第一種方法，所述方法包括：

(a)提供根據任何前述配置或方面的脊椎動物(任選小鼠或大鼠)；

(b)用所述抗原免疫所述脊椎動物(任選其中所述抗原是感染性疾病病原體的抗原)；

(c)從所述脊椎動物中取出b淋巴細胞，選擇表達結合所述抗原的抗體的一或多個b淋巴細胞；

(d)任選使所述選擇的b淋巴細胞或其后代永生化，任選通過從中產生雜交瘤進行；及

(e)分離由所述b淋巴細胞表達的抗體(例如，以及igg型抗體)。

本發(fā)明提供的第二種方法包括進行第一種方法以及從所述b淋巴細胞中分離編碼結合所述抗原的所述抗體的核酸的步驟；任選用編碼人或人源化重鏈恒定區(qū)的核苷酸序列交換所述抗體的重鏈恒定區(qū)核苷酸序列及任選親和性成熟所述抗體的可變區(qū)；及任選將所述核酸插入表達載體及任選宿主中。

本發(fā)明一方面提供了產生多克隆抗體混合物的方法，所述方法包括進行第一種方法，通過用抗原分別免疫第一和第二脊椎動物(任選第一和第二小鼠或者第一和第二大鼠)及組合分離自每個脊椎動物的抗-抗原抗體(或者所述抗體的突變體或衍生物)以產生多克隆抗體混合物；任選其中單獨或組合((i)和(ii)；或者(i)和(iii))應用如下步驟：

(i)用相同抗原或不同抗原免疫所述脊椎動物(任選其中不同抗原由相同病原性生物體(或其家族成員)表達)；

(ii)在免疫之前，所述脊椎動物的輕鏈基因座含有相同的vh基因庫集(任選單個vh基因)及任選存在的相同的j庫集；任選哺乳動物的輕鏈基因座在免疫之前是相同的；

(iii)在免疫之前，所述脊椎動物的輕鏈基因座含有相同的重排的vj或vdj庫集(任選單個vj或vdj)；任選所述脊椎動物輕鏈基因座在免疫之前是相同的。

本發(fā)明一方面提供了產生多克隆抗體混合物的方法，所述方法包括進行第一種方法，通過用第一和第二抗原免疫一或多個脊椎動物(任選小鼠或大鼠)，組合分離自每個脊椎動物的抗-抗原抗體(或者所述抗體的突變體或衍生物)以產生多克隆抗體混合物；任選其中單獨或組合((i)和(ii)；或者(i)和(iii))應用如下步驟：

(i)所述抗原由相同病原性生物體(或其家族成員)表達；

(ii)在免疫之前，脊椎動物的輕鏈基因座含有相同的vh基因庫集(任選單個vh基因)及任選存在的相同的j庫集；任選哺乳動物的輕鏈基因座在免疫之前是相同的；

(iii)在免疫之前，脊椎動物的輕鏈基因座含有相同的重排的vj或vdj庫集(任選單個vj或vdj)；任選脊椎動物的輕鏈基因座在免疫之前是相同的。

本發(fā)明一方面提供了產生能表達多克隆抗體混合物的宿主細胞的方法，所述方法包括：在第二種方法中，

(a)用第一和第二抗原免疫一或多個脊椎動物(任選小鼠或大鼠)(任選其中不同抗原由相同病原性生物體(或者其家族成員)表達)；

(b)從所述脊椎動物的b淋巴細胞中分離編碼第一種和第二種抗-抗原抗體的核酸；

(c)確定第一種抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列；

(d)確定第二種抗體的重鏈可變區(qū)及任選確定輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列；

(e)將每種抗體的重鏈可變區(qū)編碼序列插入重鏈表達載體中；任選其中每個重鏈的恒定區(qū)編碼序列被交換為編碼人或人源化恒定區(qū)的核苷酸序列；

(f)將第一種抗體的輕鏈可變區(qū)編碼序列插入輕鏈表達載體中；任選其中第一種抗體的輕鏈恒定區(qū)編碼序列被交換為編碼人或人源化恒定區(qū)的核苷酸序列；

(g)任選將第二種抗體的輕鏈可變區(qū)編碼序列插入輕鏈表達載體中；任選其中第二種抗體的輕鏈恒定區(qū)編碼序列被交換為編碼人或人源化恒定區(qū)的核苷酸序列；及

(h)將每個表達載體導入宿主細胞中并在所述宿主細胞的混合物中共表達抗體鏈以產生抗體，每個抗體均包含所述重鏈可變區(qū)和輕鏈之一或二者；任選其中表達載體一起導入相同宿主細胞中(例如cho或hek293細胞)，由此所述細胞能表達抗體輕鏈與重鏈，由此所述細胞或多個宿主細胞表達抗體，每個抗體均包含所述重鏈可變區(qū)和輕鏈之一或二者；

(i)任選地，

在免疫之前，脊椎動物的輕鏈基因座含有相同的vh基因庫集(任選單個vh基因區(qū)段)及任選存在的相同的j庫集(任選單個j基因區(qū)段)；任選脊椎動物的輕鏈基因座在免疫之前是相同的；或者

在免疫之前，脊椎動物的輕鏈基因座含有相同的重排的vj或vdj庫集(任選單個vj或vdj)；任選脊椎動物的輕鏈基因座在免疫之前是相同的。

本發(fā)明還提供了產生單克隆或多克隆抗體混合物的方法，任選用于醫(yī)藥學中，任選用于治療和/或預防感染性疾病，其中任選每個抗體均結合感染性疾病病原體的抗原，優(yōu)選相同抗原。本發(fā)明還提供了分離的單克隆或多克隆抗體或其突變體或衍生物抗體在生產治療和/或預防感染性疾病的藥物中的應用，任選其中感染性疾病是由細菌或病毒病原體引起的疾病。

本發(fā)明進一步提供了通過本發(fā)明的方法可獲得或者獲得的分離的抗體(例如igg型抗體)或其突變體或衍生物抗體，其中(i)所述分離的抗體包含所述第一種抗體的重鏈可變區(qū)的兩個拷貝，與所述第一種抗體的輕鏈可變區(qū)的兩個拷貝配對；或者(ii)所述分離的抗體包含所述第二種抗體的重鏈可變區(qū)的兩個拷貝，與所述第一種抗體的輕鏈可變區(qū)的兩個拷貝配對；或者(iii)所述分離的抗體是雙特異性抗體，其包含所述第一種抗體的重鏈可變區(qū)的一個拷貝，與所述第一種抗體的輕鏈可變區(qū)的一個拷貝配對，及所述抗體的重鏈可變區(qū)的一個拷貝，與所述第一種抗體的輕鏈可變區(qū)的一個拷貝配對，任選其中所述雙特異性抗體結合由相同病原性生物體(或其家族成員)表達的所述第一和第二抗原；任選用于醫(yī)藥學中，任選用于治療和/或預防感染性疾病。

一方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明抗體的核苷酸序列，任選其中所述核苷酸序列是載體的一部分。

一方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的抗體及稀釋劑、賦形劑或載體。

在本發(fā)明的第三種配置中，提供了：

非人脊椎動物(任選小鼠或大鼠)或者脊椎動物細胞，其基因組包含：

(a)免疫球蛋白重鏈基因座，其包含：

(i)位于恒定區(qū)上游的一或多個人vl基因區(qū)段、一或多個人d基因區(qū)段及一或多個人j基因區(qū)段(任選重排的vldjhch或vλdjhch)；或

(ii)位于恒定區(qū)上游的一或多個人vh基因區(qū)段、一或多個人d基因區(qū)段及一或多個人jh基因區(qū)段，其中所述人vh基因區(qū)段選自如下一組中：vhiii基因家族成員(任選vhiiia或vhiiib家族成員)、vhiv基因家族成員、vhiii9.1(vh3-15)、vhiiivh26(vh3-23)、vh3-21、lsg6.1、lsg12.1、dp77(v3-21)、vhh11、vh1grr、ha3h2、vhi-ha1c1、vhiii-vh2-1、vh4.18、ha4h3、hv1051、71-2、hv1f10、vh4.11、71-4、vh251、vh1-69及與其至少80％相同的基因區(qū)段；及

(b)免疫球蛋白輕鏈基因座，其包含位于恒定區(qū)上游的一或多個人v基因區(qū)段及一或多個人j基因區(qū)段，任選其中輕鏈基因座如本發(fā)明第一種配置中的(b)(i)或(b)(ii)所述；

其中所述重鏈基因座中的基因區(qū)段與其恒定區(qū)可操縱地連接，所述輕鏈基因座中的基因區(qū)段與其恒定區(qū)可操縱地連接，由此在免疫時小鼠能產生包含通過所述重鏈基因座的重組產生的重鏈和通過所述輕鏈基因座的重組產生的輕鏈的抗體。

在本發(fā)明的第四種配置中，提供了：

非人脊椎動物(任選小鼠或大鼠)或者脊椎動物細胞，其基因組包含：

(a)(i)未重排的免疫球蛋白重鏈基因座，其包含位于恒定區(qū)上游的一或多個人vl基因區(qū)段、一或多個人d基因區(qū)段及一或多個jh基因區(qū)段，其中每個人vl基因區(qū)段是與用于產生編碼來自抗體表達細胞的人抗體輕鏈可變區(qū)的重排的vj的人vl基因區(qū)段(或其突變體)相同的人基因區(qū)段，其中所述抗體結合感染性疾病病原體的抗原(任選所述抗體的可變區(qū)與來自患有、易感于或者恢復自由攜帶或分泌所述抗原的生物體引起或介導的疾病或病癥的人類個體或者來自攜帶所述生物體的人類個體的抗體相同)；或者

(ii)免疫球蛋白重鏈基因座，其包含位于恒定區(qū)上游的重排的vj區(qū)或vdj區(qū)，其中重組區(qū)的核苷酸序列與通過人j基因區(qū)段及任選存在的人d基因區(qū)段與人vl基因區(qū)段重組產生的核苷酸序列相同，所述人vl基因區(qū)段與用于產生編碼來自抗體表達細胞的人抗體的輕鏈可變區(qū)的重排的vj的人vl基因區(qū)段(或其突變體)相同，其中所述抗體結合感染性疾病病原體的抗原(任選所述抗體的可變區(qū)與來自患有、易感于或者恢復自由攜帶或分泌所述抗原的生物體引起或介導的疾病或病癥的人類個體或者來自攜帶所述生物體的人類個體的抗體相同)；

(b)免疫球蛋白輕鏈基因座，其包含位于恒定區(qū)上游的一或多個人v基因區(qū)段及一或多個人j基因區(qū)段；及

(c)其中輕鏈基因座中的基因區(qū)段與其恒定區(qū)可操縱地連接，及重鏈基因座中的基因區(qū)段或vj或vdj與其恒定區(qū)可操縱地連接，由此在免疫時小鼠能產生包含通過所述輕鏈基因座的重組產生的輕鏈及衍生自所述重鏈基因座的重鏈的抗體；

(d)任選地，當應用(a)(i)時，重鏈基因座中每個所述vl基因區(qū)段選自如下一組中的vl基因區(qū)段：vλii基因家族成員、vλvii4a、vλii2.1、vλvii4a、vλ1基因家族成員、vλ3基因家族成員、iglv1s2、vλ3-cml70、lalh2、lalvl、la3h3、kv325、vκi基因家族成員、κi-15a(kl012)、vκii家族成員、vκiii家族成員、vκi基因家族成員、κi-15a(kl012)、vκiia2(任選a2a等位基因)、vκa27(humkv325)及與其至少80％相同的基因區(qū)段；

(e)任選地，當應用(a)(ii)時，重組區(qū)的核苷酸序列與通過人j基因區(qū)段及任選存在的人d基因區(qū)段與人vl基因區(qū)段重組產生的核苷酸序列相同，所述人vl基因區(qū)段選自如下一組中的vl基因區(qū)段：vλii基因家族成員、vλvii4a、vλii2.1、vλvii4a、vλ1基因家族成員、vλ3基因家族成員、iglv1s2、vλ3-cml70、lalh2、lalvl、la3h3、kv325、vκi基因家族成員、κi-15a(kl012)、vκii家族成員、vκiii家族成員、vκi基因家族成員、κi-15a(kl012)、vκiia2(任選a2a等位基因)、vκa27(humkv325)及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

在本發(fā)明的第四種配置的一方面，所述脊椎動物或細胞的基因組對于重鏈基因座(a)(i)或(ii)是純合的；任選其中：

-所述重鏈基因座的v基因區(qū)段庫集由一或多個人vl基因區(qū)段組成，所述人vl基因區(qū)段選自如下一組中的vl基因區(qū)段：vλii基因家族成員、vλvii4a、vλii2.1、vλvii4a、vλ1基因家族成員、vλ3基因家族成員、iglv1s2、vλ3-cml70、lalh2、lalvl、la3h3、kv325、vκi基因家族成員、κi-15a(kl012)、vκii家族成員、vκiii家族成員、vκi基因家族成員、κi-15a(kl012)、vκiia2(任選a2a等位基因)、vκa27(humkv325)及與其至少80％相同的基因區(qū)段；或者

-所述重鏈基因座的重組的vj或vdj庫集由與通過人vl基因區(qū)段與人j基因區(qū)段及任選存在的人d基因區(qū)段重組產生的一或多個核苷酸序列相同的序列組成，所述人vl基因區(qū)段選自如下一組中的vl基因區(qū)段：vλii基因家族成員、vλvii4a、vλii2.1、vλvii4a、vλ1基因家族成員、vλ3基因家族成員、iglv1s2、vλ3-cml70、lalh2、lalvl、la3h3、kv325、vκi基因家族成員、κi-15a(kl012)、vκii家族成員、vκiii家族成員、vκi基因家族成員、κi-15a(kl012)、vκiia2(任選a2a等位基因)、vκa27(humkv325)及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

本發(fā)明提供了一種單克隆或多克隆抗體組合物，通過用抗原免疫前述任何配置或方面所述的至少一種脊椎動物(例如小鼠或大鼠)而制備，任選其中所述抗原是感染性疾病病原體抗原，任選其中相同抗原用于免疫所有脊椎動物；任選其中所述抗體是igg型。

本發(fā)明還提供了分離的嵌合抗體以治療和/或預防感染性疾病或病癥，所述抗體包含非人脊椎動物(任選小鼠或大鼠)重鏈恒定區(qū)及結合感染性疾病病原體抗原的人可變區(qū)，其中所述抗體在包括用所述抗原免疫本發(fā)明的非人脊椎動物的方法中可獲得或獲得。

本發(fā)明還提供了分離的人抗體以治療和/或預防感染性疾病或病癥，所述抗體包含人重鏈恒定區(qū)及結合感染性疾病病原體抗原的人可變區(qū)，其中所述抗體在包括在轉基因非人脊椎動物(例如小鼠或大鼠)中在體內親和性成熟抗體可變區(qū)的方法中可獲得或獲得，當所述可變區(qū)與所述脊椎動物重鏈恒定區(qū)(例如小鼠或大鼠重鏈恒定區(qū))可操縱地連接時，通過(a)用所述抗原免疫本發(fā)明的脊椎動物，(b)分離編碼本發(fā)明的嵌合抗體的核酸，(c)用編碼人重鏈恒定區(qū)的核苷酸序列置換編碼非人脊椎動物重鏈恒定區(qū)的核酸的核苷酸序列，產生編碼人抗體的核酸，(d)在體外表達人抗體(任選從攜帶所述人核酸的cho或hek293細胞中表達)及(e)分離所述人抗體(任選進一步親和性成熟所述抗體和/或產生其衍生物)。

本發(fā)明一方面提供了第一種和第二種人抗體的混合物，每個抗體均能結合感染性疾病病原體抗原(任選其中第一種抗體結合第一抗原，第二種抗體結合第二抗原，所述抗原來自相同病原體；或者其中所述抗原是相同的)。在一個實施方案中，使用共同輕鏈，其能簡化抗體混合物的生產。因此在混合物中提供了第一種抗體的輕鏈氨基酸序列，其與第二種抗體的輕鏈氨基酸序列相同，或者具有直至15個氨基酸改變。

本發(fā)明進一步提供了宿主細胞，其包含編碼3或更多個第一種和第二種抗體重鏈和輕鏈的一或多個表達載體。

在本發(fā)明的第五種配置中，提供了：

合成的免疫球蛋白基因座，其包含一或多個可變和j基因區(qū)段(及任選存在的一或多個d基因區(qū)段)，與恒定區(qū)5’端可操縱地連接，其中所述基因座包含5’至3’v(d)j排列，選自可以用如下一或多種排列(5’至3’)構建的免疫球蛋白基因座：

(a)[v(重鏈，λ或κ)]-[兩轉角(two-turn)rss]-[一轉角(one-turn)rss]-[d]-[jh]，其中所述rss是相反方向；

(b)[vh]-[d]-[兩轉角rss]-[一轉角rss]-[jλ]，其中所述rss是相反方向；

(c)[vh]-[d]-[一轉角rss]-[兩轉角rss]-[jκ]，其中所述rss是相反方向；

(d)[vh或vκ]-[兩轉角rss]-[一轉角rss]-[jλ]，其中所述rss是相反方向；

(e)[vκ]-[一轉角rss]-[兩轉角rss]-[jh或jλ],其中所述rss是相反方向；

(f)[v(重鏈，λ或κ)]-[一轉角rss]-[兩轉角rss]-[d]-[jh]，其中所述rss是相反方向；

(g)[vh]-[d]-[一轉角rss]-[兩轉角rss]-[jλ]，其中所述rss是相反方向；

(h)[vh]-[d]-[兩轉角rss]-[一轉角rss]-[jκ]，其中所述rss是相反方向；

(i)[vh或vκ]-[一轉角rss]-[兩轉角rss]-[jλ]，其中所述rss是相反方向；

(j)[vκ]-[兩轉角rss]-[一轉角rss]-[jh或jλ]，其中所述rss是相反方向。

在本發(fā)明的第六種配置中還提供了產生vh結構域、重鏈和具有長hcdr3長度的抗體的方式。在此，本發(fā)明提供了：

非人脊椎動物(例如小鼠或大鼠)或者非人脊椎動物細胞(例如小鼠細胞或大鼠細胞)，其基因組包含人免疫球蛋白d基因區(qū)段庫集，其偏向于人d2和/或d3家族或者偏向于一、多個或所有人d基因區(qū)段，所述人d基因區(qū)段選自d1-26、d2-2、d3-9、d3-10、d3-22、d4-17、d6-13和d6-19。

非人脊椎動物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎動物細胞(例如小鼠細胞或大鼠細胞)，任選根據前述權利要求所述，其基因組包含人免疫球蛋白vh基因區(qū)段庫集，其偏向于選自如下一組中的一個、多個或所有基因區(qū)段：vh1-2、vh1-3、vh1-8、vh1-18、vh5-51、vh1-69、vh2-5、vh3-7、vh3-9、vh3-11、vh3-13、vh3-20、vh3-21、vh3-23、vh4-4、vh6-1和vh7-4-1。

非人脊椎動物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎動物細胞(例如小鼠細胞或大鼠細胞)，其基因組包含人免疫球蛋白jh基因區(qū)段庫集，其偏向于人jh6。

單克隆或多克隆抗體組合物或者產生這種組合物的抗體生產細胞群，其中所述組合物或細胞群是通過用抗原免疫前述任何權利要求所述至少一種脊椎動物而制備的，其中所述抗體具有人重鏈可變區(qū)，當與相應人種系v、d和j序列相比時其包含非人脊椎動物aid-模式體細胞超變(例如小鼠或大鼠aid-模式突變)和/或當與相應人種系v、d和j序列相比時其包含非人(例如小鼠或大鼠)末端脫氧核苷酸轉移酶(tdt)-模式連接突變(junctionalmutation)；其中所述組合物包含至少一種抗原特異性抗體，其具有長度為至少20個氨基酸的hcdr3(根據imgt)。

包含一或多個重鏈的抗體重鏈庫集(例如由抗體提供)，其可變結構域hcdr3的長度為至少20個氨基酸(根據imgt)，衍生自人vh、d和jh的重組，其中所述vh選自：

vh1-2*02、vh1-3*01、vh1-8*01、vh1-18*01、vh2-5*10、vh3-7*01、vh3-9*01、vh3-11*01、vh3-13*01、vh3-21*03、vh3-23*04、vh4-4*02、vh6-1*01和vh7-4-1*01，以及

所述d選自：

d2-2*02、d3-9*01、d3-10*01和d3-22*01，或者

d2-2*02、d3-9*01和d3-10*01，或者

d3-9*01和d3-10*01，或者

d1-26、d2-2、d3-9、d3-10、d3-22、d4-17、d6-13和d6-19，或者

d1-26*01、d2-2*02、d3-9*01、d3-10*01、d3-22*01、d4-17*01、d6-13*01和d6-19*01，或者

d2-2、d3-9、d3-10、d3-22、d4-17、d6-13和d6-19，或者d2-2*02、d3-9*01、d3-10*01、d3-22*01、d4-17*01、d6-13*01和d6-19*01，或者

d1-26、d2-2、d3-10和d6-19，或者

d2-2、d3-9和d3-10；并且

任選jh是jh6(例如jh6*02)；

其中

(a)所述重鏈可變結構域已經在非人脊椎動物(例如小鼠或大鼠)中在體內產生；和/或

(b)所述重鏈可變結構域當與相應人種系v、d和j序列相比時包含非人脊椎動物aid-模式體細胞超變(例如小鼠或大鼠aid-模式突變)和/或當與相應人種系v、d和j序列相比時包含非人(例如小鼠或大鼠)末端脫氧核苷酸轉移酶(tdt)-模式連接突變。

附圖簡述

圖1-3：例證了產生重組工程bac載體以將v基因區(qū)段加入小鼠基因組中的方案示意圖；

圖4：例證了使用相繼重組酶介導的盒交換(srmce)將v基因區(qū)段加入小鼠基因組中的方案示意圖；

圖5(4部分)：僅示出可變(v)編碼區(qū)的13個ighv1-69等位基因的比對。與vh1-69等位基因*01不同的核苷酸在適當位置標示，而相同的核苷酸用破折號標示。在核苷酸改變導致氨基酸不同的情況中，編碼的氨基酸在相應三聯(lián)體上示出。方框區(qū)相應于cdr1、cdr2和cdr3；

圖6：rss結構及重組示意圖。

發(fā)明詳述

人v、d和j基因區(qū)段的來源是細菌人工染色體(rpci-11bac)，得自roswellparkcancerinstitute(rpci)/invitrogen。見http://bacpac.chori.org/hmale11.htm，其描述了如下的bac：

rpci-11人男性bac文庫

rpci-11人男性bac文庫(osoegawaetal.,2001)使用由kazutoyoosoegawa開發(fā)的改良的克隆技術構建(osoegawaetal.,1998)。所述文庫由kazutoyoosoegawa產生。構建由nationalhumangenomeresearchinstitute(nhgri,nih)(#1r01rg01165-03)提供資金。這個文庫根據新的nhgri/doe"guidanceonhumansubjectsinlarge-scalednasequencing產生。

“男性血液通過雙盲選擇方案獲得。男性血液dna分離自一個隨機選擇的供體(在10個男性供體中)”。

·osoegawak,mammoserag,wuc,frengene,zengc,catanesejj,dejongpj；genomeres.2001mar；11(3):483-96；"abacterialartificialchromosomelibraryforsequencingthecompletehumangenome"；

·osoegawa,k.,woon,p.y.,zhao,b.,frengen,e.,tateno,m.,catanese,j.j,anddejong,p.j.(1998)；"animprovedapproachforconstructionofbacterialartificialchromosomelibraries"；genomics52,1-8.

作為抗體基因區(qū)段序列的來源，技術人員也意識到如下可利用的數據庫和資源(包括其更新材料)：

1.1.kabat數據庫(g.johnsonandt.t.wu,2002；http://www.kabatdatabase.com)。由e.a.kabat和t.t.wu在1966年產生，kabat數據庫公開了抗體、t-細胞受體、主要組織相容性復合體(mhc)i類和ii類分子及其它免疫學感興趣的蛋白質的排列對比的序列?？伤阉鞯慕缑嬗蓅eqhuntii工具提供，可獲得關于序列排列對比、序列子群分類及產生變異性作圖(variabilityplot)的效用范圍。也見kabat,e.a.,wu,t.t.,perry,h.,gottesman,k.,andfoeller,c.(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.,nihpublicationno.91-3242，bethesda,md所述，該文獻并入本文作參考，特別是參考人基因區(qū)段用于本發(fā)明。

1.2.kabatman(a.c.r.martin,2002；http://www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html)。這是產生簡單查詢kabat序列數據庫的網頁。

1.3.imgt,theinternationalimmunogeneticsinformationm.-p.lefranc,2002；http://imgt.cines.fr)。imgt是一個整合的信息系統(tǒng)，其專攻所有脊椎動物物種的抗體、t細胞受體和mhc分子。其提供了標準化數據的一個公共端口，包括核苷酸和蛋白質序列、寡核苷酸引物、基因作圖、遺傳多態(tài)性、特異性及二維(2d)和三維(3d)結構。imgt包括三個序列數據庫(imgt/ligm-db、imgt/mhc-db、imgt/primerdb)，一個基因組數據庫(imgt/gene-db)，一個3d結構數據庫(imgt/3d結構-db)，及一系列網站資源("imgtmarie-paulepage")和交互工具。

1.4v-base(i.m.tomlinson,2002；http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)。v-base是從1000個以上的公開序列中匯編的所有人抗體種系可變區(qū)序列的綜合目錄。其包括排列軟件dnaplot(由hans-helmaralthaus和wernermuller開發(fā))，其使得可以將重排的抗體v基因分配給其最接近種系基因區(qū)段。

1.5.antibodies—structureandsequence(a.c.r.martin,2002；http://www.bioinf.org.uk/abs)。這個網頁概括了關于抗體結構和序列的有用信息。其提供了kabat抗體序列數據的查詢界面，關于抗體的一般信息，、晶體結構及與其它抗體相關信息的鏈接。其還指示proteindatabank(pdb)中保藏的所有抗體結構的自動化摘要。特別感興趣的是其全面描述和對比了抗體可變區(qū)的各種編號方案。

1.6.aaaaa—aho'samazingatlasofantibodyanatomy(a.honegger,2001；http://www.unizh.ch/～antibody)。這個資源包括結構分析、建模及工程化的工具。其采用一致的方案綜合抗體和t細胞受體序列的結構排列，包括抗體分析和圖示的excelmacros。

1.7.wam—webantibodymodeling(n.whitelegganda.r.rees,2001；http://antibody.bath.ac.uk)。由thecentreforproteinanalysisanddesignattheuniversityofbath,unitedkingdom主持?；赼bm程序包(先前由oxfordmolecular銷售)構建抗體fv序列的3d模型，組合使用確立的理論方法，這個網站還包括最新的抗體結構信息。

1.8.mike'simmunoglobulinstructure/functionpage(m.r.clark,2001；http://www.path.cam.ac.uk/～mrc7/mikeimages.html)。這些網頁提供了關于免疫球蛋白結構和功能的教育材料，通過許多彩色圖片、模型和動畫例證?？色@得關于抗體人源化和mikeclark'stherapeuticantibodyhumanhomologyproject的另外信息，其關注于使臨床效力和抗免疫球蛋白應答與治療性抗體的可變區(qū)序列相關聯(lián)。

1.9.theantibodyresourcepage(theantibodyresourcepage,2000；http://www.antibodyresource.com)。這個網站描述了其自身作為“抗體研究和供應的完全指導”。與氨基酸測序工具、核苷酸抗體測序工具鏈接，提供了雜交瘤/細胞培養(yǎng)數據庫。

1.9.humanizationbydesign(j.saldanha,2000；http://people.cryst.bbk.ac.uk/～ubcg07s)。這個資源提供了關于抗體人源化技術的綜述。最有用的特征是超過40個公開的人源化抗體的可搜索數據庫(通過序列和文本)，包括關于人源化構建體的設計問題、構架選擇、構架回復突變及結合親和性的信息。

也見antibodyengineeringmethodsandprotocols,ed.bennykclo,methodsinmolecularbiology^tm,humanpress所述。見http://www.blogsua.com/pdf/antibody-engineering-methods-and-protocolsantibody-engineering-methods-and-protocols.pdf。

在本說明書中的一個實施方案中，“種系”是指規(guī)范的種系基因區(qū)段序列。

本發(fā)明涉及提供在免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因座中的新的v、d和j配對。提供了新的、偏向的抗體多樣性及潛在擴展的多樣性。本發(fā)明的一方面在體內在抗體v(d)j重組期間利用相容的重組信號序列(rss)的天然配對，本發(fā)明的這個方面提供了使用rss相容性觀測結果的v、d和j基因區(qū)段的新的合成組合。

本發(fā)明另一方面基于在針對感染性疾病病原體產生的天然發(fā)生的人抗體中v、d和j的使用偏向的觀測。本發(fā)明可用于在轉基因非人動物中操縱抗體基因多樣性，由此提供新的及潛在擴展的多樣性或者偏向于抗體共同的可變基因使用的多樣性，可用于治療和/或預防某些疾病或病癥，如感染性疾病。這個偏向抗體庫集的能力還提供了簡化抗體混合物生產的方法，如在希望靶向多個病原體抗原的多克隆方法中可用于治療和/或預防感染性疾病的多克隆抗體治療劑。為此，本發(fā)明還提供了雙特異性抗體，其能結合一種以上的抗原(例如由相同病原體表達的多個感染性抗原)，因此提供了使用多克隆抗體混合物不可能的優(yōu)勢(如生產、給藥劑量和施用優(yōu)勢)。

本發(fā)明提供了脊椎動物和細胞，如轉基因小鼠或大鼠或者轉基因小鼠或大鼠細胞。此外，本發(fā)明涉及使用所述脊椎動物分離抗體或編碼抗體的核苷酸序列的方法。本發(fā)明還提供了抗體、核苷酸序列、藥物組合物及應用。

為此，本發(fā)明在第一種配置中提供了：

非人脊椎動物(任選小鼠或大鼠)或者脊椎動物細胞，其基因組包含：

(a)免疫球蛋白重鏈基因座，其包含位于恒定區(qū)上游的一或多個人v基因區(qū)段(任選多個vh)、一或多個人d基因區(qū)段及一或多個人j基因區(qū)段；任選其中重鏈基因座如下述第二種配置中的(a)所述；及

(b)免疫球蛋白輕鏈基因座，其包含：

(i)位于恒定區(qū)上游的一或多個人vh基因區(qū)段和一或多個人j基因區(qū)段(任選重排的vhjlcl或vhjλcl，其中cl是cλ或cκ)；或者

(ii)位于恒定區(qū)上游的一或多個人vl基因區(qū)段、一或多個人d基因區(qū)段及一或多個人jh基因區(qū)段(任選重排的vldjhcl或vλdjhcl，其中cl是cλ或cκ)；或者

(iii)位于恒定區(qū)上游的一或多個人vl基因區(qū)段及一或多個人jl基因區(qū)段，所述vl基因區(qū)段選自如下一組中：vλii基因家族成員、vλvii4a、vλii2.1、vλvii4a、vλ1基因家族成員、vλ3基因家族成員、iglv1s2、vλ3-cml70、lalh2、lalvl、la3h3、kv325、vκi基因家族成員、κi-15a(kl012)、vκii家族成員、vκiii家族成員、vκi基因家族成員、κi-15a(kl012)、vκiia2(任選a2a等位基因)、vκa27(humkv325)及與其至少80％相同的基因區(qū)段；任選一或多個vl基因區(qū)段選自下文的列表a1、a2、a1.1、a1.2、a2.1、a2.2、a2.3或a2.4。

其中所述重鏈基因座中基因區(qū)段與其恒定區(qū)可操縱地連接，所述輕鏈基因座中基因區(qū)段與其恒定區(qū)可操縱地連接，由此在免疫時小鼠能產生包含通過所述重鏈基因座的重組產生的重鏈及通過所述輕鏈基因座的重組產生的輕鏈的抗體。

本發(fā)明的這個配置因此在轉基因非人脊椎動物如小鼠或大鼠中提供了新的、合成的抗體和基因庫集的可能性。這種新的庫集是需要的，因為其提供了新抗體庫的可能性，從中在用預定抗原免疫脊椎動物之后可以選擇先導抗體。這因此提供了可以從中分離具有希望特性的抗體的庫，例如對于特異性靶抗原結合具有相對高親和性的抗體。希望的是可以從免疫的脊椎動物中直接分離高親和性抗體，因為這樣可以提供可潛在用作治療和/或預防性藥物的抗體前導，而不需要進一步大量的親和性成熟(例如通過體外抗體展示如核糖體展示或者噬菌體展示)?？梢愿鶕枰獙贵w的效應子部分進行修飾(例如恒定區(qū)的人源化)，而不需要操縱可變區(qū)的序列?；蛘?，或此外，抗體的庫可以允許選擇具有希望的生物物理學特性和/或表位特異性的先導抗體。后者對于發(fā)現針對如下表位的先導抗體是重要的，所述表位是先前未產生治療性和/或預防性抗體的表位或者難以由攜帶轉基因免疫球蛋白基因座的先前非人脊椎動物產生的抗體基因多樣性產生的抗體達到的，例如基于由rpci-11bac所示的單個人基因座的那些。

本發(fā)明的細胞(根據本發(fā)明任何方面或配置)是例如b細胞、雜交瘤或干細胞，任選胚胎干細胞或者造血干細胞。一方面，所述es細胞衍生自小鼠c57bl/6n、c57bl/6j、129s5或129sv品系。一方面，所述非人脊椎動物是嚙齒類動物，優(yōu)選小鼠，及本發(fā)明的細胞是嚙齒類動物細胞或es細胞，適當的是小鼠es細胞。本發(fā)明的es細胞可用于產生動物，使用本領域熟知的技術進行，包括將es細胞注射進胚泡中，隨后將嵌合的胚泡植入雌性動物中以產生可以繁殖的后代，針對具有需要插入的純合重組體進行選擇。一方面，本發(fā)明涉及包含es細胞衍生的組織及宿主胚胎衍生的組織的轉基因動物。一方面，本發(fā)明涉及遺傳改變的后代動物，包括具有對于vdj和/或vj區(qū)是純合重組體的動物。

攜帶如(b)(i)和(ii)所述一或多個輕鏈基因座的脊椎動物提供了新的及潛在擴展的抗體和基因庫集，通過采用合成的非天然發(fā)生的免疫球蛋白基因區(qū)段(v、d、j、c)組合而成。在這方面，本發(fā)明人意識到提供混合重鏈基因區(qū)段與輕鏈基因座那些基因區(qū)段的抗體和基因庫集的需求和可能性。這基于本發(fā)明人的觀測結果：首先，自然提示具有vh-vh或vl-vl配對(與更經典的vh-vl配對相反)的功能性抗體的可能性。例如，參見駱駝科(camelidae)的重鏈抗體，其產生具有配對的vh結構域及缺乏輕鏈vl結構域的抗體(例如見nature.1993jun3；363(6428):446-8；naturallyoccurringantibodiesdevoidoflightchains；hamers-castermanc,atarhoucht,muyldermanss,robinsong,hamersc,songaeb,bendahmann,hamersr)。這些抗體發(fā)揮特異性結合抗原的功能，這種抗體在這種駱駝科動物(例如美洲駱駝，駱駝，羊駝)的血液中發(fā)現。具有vh配對的這種抗體也可以是合成產生的，以提供治療性和預防性藥物(見例如wo1994004678、wo2004041862、wo2004041863所述)。轉基因小鼠也可以產生這種重鏈抗體，以及所述抗體的體內產生使得小鼠的免疫系統(tǒng)可以選擇vh-vh配對，有時選擇其中已經在體內由小鼠導入突變的這種配對以適應配對(wo2010109165a2)。因此，本發(fā)明人認識到采用體內抗體產生系統(tǒng)(而不是體外系統(tǒng)如抗體的噬菌體或核糖體展示)可以適應于本發(fā)明設想的合成的免疫球蛋白基因區(qū)段組合。

本發(fā)明人的第二個觀測結果在于天然發(fā)生的免疫球蛋白基因座的結構，特別是介導體內v(d)j重組的重組信號序列(rss)的排列(見例如cell.2002apr；109suppl:s45-55.themechanismandregulationofchromosomalv(d)jrecombination；bassingch,swatw,altfw，所述文獻并入本文作參考)。如圖6所例證，已經鑒別了兩種類型的rss元件：一轉角rss(12-rss)和兩轉角rss(23-rss)。自然地，λ輕鏈基因座中的vj重組，如果在位于vλ的3’端的兩轉角rss與位于jλ的5’端的一轉角rss之間發(fā)生重組，rss是相反方向。自然地，在κ輕鏈基因座中的vj重組，如果在位于vκ的3’端的一轉角rss與位于jκ的5’端的兩轉角rss之間發(fā)生重組，rss是相反方向。自然地，在重鏈基因座中的vd重組，如果在位于vh的3’端的兩轉角rss與位于d的5’端的一轉角rss之間發(fā)生重組，rss是相反方向。自然地，在重鏈基因座中的dj重組，如果在位于d的3’端的一轉角rss與位于jh的5’端的兩轉角rss之間發(fā)生重組，rss是相反方向。因此，通常兩轉角rss與相反方向的一轉角rss相容。本發(fā)明人認識到可以使用這個觀測結果構建轉基因免疫球蛋白基因座，由此當以相反方向提供兩轉角rss與一轉角rss時，5’基因區(qū)段可以與3’基因區(qū)段重組(例如v與j；或者v與d)，每個rss鄰近各自的一個基因區(qū)段。因此，本發(fā)明人認識到，在一個實施方案中，免疫球蛋白基因座可以用一或多個如下排列方式構建(5’至3’)：

(k)[v(重鏈，λ或κ)]-[兩轉角rss]-[一轉角rss]-[d]-[jh]，其中所述rss是相反方向；

(l)[vh]-[d]-[兩轉角rss]-[一轉角rss]-[jλ]，其中所述rss是相反方向；

(m)[vh]-[d]-[一轉角rss]-[兩轉角rss]-[jκ]，其中所述rss是相反方向；

(n)[vh或vκ]-[兩轉角rss]-[一轉角rss]-[jλ]，其中所述rss是相反方向；

(o)[vκ]-[一轉角rss]-[兩轉角rss]-[jh或jλ]，其中所述rss是相反方向；

(p)[v(重鏈，λ或κ)]-[一轉角rss]-[兩轉角rss]-[d]-[jh]，其中所述rss是相反方向；

(q)[vh]-[d]-[一轉角rss]-[兩轉角rss]-[jλ]，其中所述rss是相反方向；

(r)[vh]-[d]-[兩轉角rss]-[一轉角rss]-[jκ]，其中所述rss是相反方向；

(s)[vh或vκ]-[一轉角rss]-[兩轉角rss]-[jλ]，其中所述rss是相反方向；

(t)[vκ]-[兩轉角rss]-[一轉角rss]-[jh或jλ]，其中所述rss是相反方向。

技術人員將認識到可以使用標準分子生物學技術提供包含rss與v、d或j的合成組合的載體用于本發(fā)明的這個方面中，由此所述載體可用于構建轉基因免疫球蛋白基因座(例如使用本領域已知的同源重組和/或重組酶介導的盒交換，例如見us7501552(medarex)、us5939598(abgenix)、us6130364(abgenix)、w002/066630(regeneron)、w02011004192(genomeresearchlimited)、w02009076464、w02009143472和w02010039900(ablexis)所述，所述文獻在此并入本文作參考。例如，可以使用標準重組工程技術在大腸桿菌中產生rss與基因區(qū)段的這種合成組合以構建攜帶所述合成組合的bac載體，之后使用同源重組或rmce(例如使用cre/lox位點特異性重組)插入胚胎干細胞中。關于重組工程的詳細描述可見于www.genebridges.com及在ep1034260和ep1204740中所述，所述文獻在此并入本文作參考。

在(b)(i)的一個實施方案中，所有輕鏈基因座v基因區(qū)段均是人vh基因區(qū)段(任選具有一或多個人vλ基因區(qū)段)。

在(b)(i)的一個實施方案中，所述恒定區(qū)是小鼠、大鼠或者人cl，如cλ。在一個實施方案中，j和恒定區(qū)均由一或多個人jλcλ提供。

盡管通常對任何抗原和疾病均有效，但是攜帶(b)(iii)的一或多個輕鏈基因座的脊椎動物是有益的，特別用于產生針對感染性疾病病原體的抗體前導。在這方面，本發(fā)明人認識到提供抗體和基因庫集的需要性和可能性，其偏向于通常見于人對感染性疾病病原體的天然抗體反應中的免疫球蛋白基因區(qū)段。本發(fā)明人認識到希望的是提供脊椎動物、細胞、方法等用于基于對抗原如感染性疾病病原體的抗原的天然人免疫應答產生治療性和/或預防性抗體。在這個方面，所述文獻觀測通常使用免疫球蛋白基因區(qū)段在人體中產生抗感染性應答(表1)。

表1：在針對感染性疾病病原體的人抗體應答中免疫球蛋白基因使用

參考文獻:

1.natbiotechnol.2005sep；23(9):1117-25；humanantibodiesfromtransgenicanimals；lonbergn.

2.jclininvest.1992mar；89(3):729-38；immunoglobulinlightchainvariableregiongenesequencesforhumanantibodiestohaemophilusinfluenzaetypebcapsularpolysaccharidearedominatedbyalimitednumberofvkappaandvlambdasegmentsandvjcombinations；addersonee,shackelfordpg,inselra,quinna,wilsonpm,carrollwl.

3.jimmunol.1993oct15；151(8):4352-61；clonalcharacterizationofthehumaniggantibodyrepertoiretohaemophilusinfluenzaetypebpolysaccharide.v.invivoexpressionofindividualantibodyclonesisdependentonigchhaplotypesandthecategoriesofantigen；chunggh,scottmg,kimkh,kearneyj,sibergr,ambrosinodm,nahmmh.

4.jimmunol.1998dec1；161(11):6068-73；decreasedfrequencyofrearrangementduetothesynergisticeffectofnucleotidechangesintheheptamerandnonameroftherecombinationsignalsequenceofthevkappagenea2b,whichisassociatedwithincreasedsusceptibilityofnavajostohaemophilusinfluenzaetypebdisease；nadelb,tanga,lugog,lovev,escurog,feeneyaj.

5.jclininvest.1996may15；97(10):2277-82；adefectivevkappaa2alleleinnavajoswhichmayplayaroleinincreasedsusceptibilitytohaemophilusinfluenzaetypebdisease；feeneyaj,atkinsonmj,cowanmj,escurog,lugog.

6.infectimmun.1994sep；62(9):3873-80；variableregionsequencesofaprotectivehumanmonoclonalantibodyspecificforthehaemophilusinfluenzaetypebcapsularpolysaccharide；lucasah,larrickjw,reasondc.

7.jclininvest.1993jun；91(6):2734-43；restrictedimmunoglobulinvhusageandvdjcombinationsinthehumanresponsetohaemophilusinfluenzaetypebcapsularpolysaccharide.nucleotidesequencesofmonospecificanti-haemophilusantibodiesandpolyspecificantibodiescross-reactingwithselfantigens；addersonee,shackelfordpg,quinna,wilsonpm,cunninghammw,inselra,carrollwl.

8.jclininvest.1993mar；91(3):788-96；variableregionexpressionintheantibodyresponsesofinfantsvaccinatedwithhaemophilusinfluenzaetypebpolysaccharide-proteinconjugates.descriptionofanewlambdalightchain-associatedidiotypeandtherelationbetweenidiotypeexpression,avidity,andvaccineformulation.thecollaborativevaccinestudygroup；granoffdm,shackelfordpg,holmessj,lucasah.

9.infectimmun.1994may；62(5):1776-86；variableregionsequencesandidiotypicexpressionofaprotectivehumanimmunoglobulinmantibodytocapsularpolysaccharidesofneisseriameningitidisgroupbandescherichiacolik1；azmifh,lucasah,raffhv,granoffdm.

10.jclininvest.1992dec；90(6):2197-208；sequenceanalysesofthreeimmunoglobulingantivirusantibodiesrevealtheirutilizationofautoantibody-relatedimmunoglobulinvhgenes,butnotvlambdagenes；huangdf,oleet,masuhoy,matsumotoy,carsonda,chenpp.

11.science.2011aug12；333(6044):834-5,biochemistry.catchingamovingtarget,wangtt,palesep

12.science.2009apr10；324(5924):246-51.epub2009feb26；antibodyrecognitionofahighlyconservedinfluenzavirusepitope；ekiertdc,bhabhag,elsligerma,friesenrh,jongeneelenm,throsbym,goudsmitj,wilsonia.

13.plosone.2008；3(12):e3942.epub2008dec16；heterosubtypicneutralizingmonoclonalantibodiescross-protectiveagainsth5n1andh1n1recoveredfromhumanigm+memorybcells；throsbym,vandenbrinke,jongeneelenm,poonll,alardp,cornelissenl,bakkera,coxf,vandeventere,guany,cinatlj,termeulenj,lastersi,carsettir,peirism,dekruifj,goudsmitj.

14.natstructmolbiol.2009mar；16(3):265-73.epub2009feb22,structuralandfunctionalbasesforbroad-spectrumneutralizationofavianandhumaninfluenzaaviruses,suij,hwangwc,perezs,weig,airdd,chenlm,santellie,stecb,cadwellg,alim,wanh,murakamia,yammanurua,hant,coxnj,bankstonla,donisro,liddingtonrc,marascowa.

15.science.2011aug12；333(6044):843-50.epub2011jul7,ahighlyconservedneutralizingepitopeongroup2influenzaaviruses,ekiertdc,friesenrh,bhabhag,kwakst,jongeneelenm,yuw,ophorstc,coxf,korsehj,brandenburgb,vogelsr,brakenhoffjp,kompierr,koldijkmh,cornelissenla,poonll,peirism,koudstaalw,wilsonia,goudsmitj.

***

在一個實施方案中，在(b)(i)中，輕鏈基因座的j基因區(qū)段是jλ基因區(qū)段，任選輕鏈基因座的恒定區(qū)是λ恒定區(qū)；或者在(b)(ii)中，vl是vλ，及任選輕鏈基因座的恒定區(qū)是λ恒定區(qū)。或者，所述恒定區(qū)是cκ。

在一個實施方案中，在(b)(i)中，輕鏈基因座的v基因區(qū)段庫集包含或者由一或多個vh基因區(qū)段組成，所述vh基因區(qū)段選自如下一組中：vhiii基因家族成員(任選vhiiia或vhiiib家族成員)、vhiv基因家族成員、vhiii9.1(vh3-15)、vhiiivh26(vh3-23)、vh3-21、lsg6.1、lsg12.1、dp77(v3-21)、vhh11、vh1grr、ha3h2、vhi-ha1c1、vhiii-vh2-1、vh4.18、ha4h3、hv1051、71-2、hv1f10、vh4.11、71-4、vh251、vh1-69及與其至少80％相同的基因區(qū)段。這些基因區(qū)段是有用的，因為其在體內擴展在對抗原如感染性疾病病原體的抗原的天然人體免疫應答中發(fā)現的vh基因區(qū)段庫集。例如當用感染性疾病病原體抗原免疫脊椎動物時，這可用于產生和分離抗體以治療和/或預防由所述病原體介導的疾病或病癥。在一個實例中，在(b)(i)中，輕鏈基因座的v基因區(qū)段庫集包含或者僅由vh基因區(qū)段組成，所述vh基因區(qū)段選自如下一組中：vhiii基因家族成員(任選vhiiia或vhiiib家族成員)、vhiv基因家族成員、vhiii9.1(vh3-15)、vhiiivh26(vh3-23)、vh3-21、lsg6.1、lsg12.1、dp77(v3-21)、vhh11、vh1grr、ha3h2、vhi-ha1c1、vhiii-vh2-1、vh4.18、ha4h3、hv1051、71-2、hv1f10、vh4.11、71-4、vh251、vh1-69及與其至少80％相同的基因區(qū)段。這可用于使脊椎動物的免疫應答(及因此所得的先導抗體)偏向于預定基因區(qū)段，例如已知常用于針對抗原的天然人體免疫應答中的基因區(qū)段，所述抗原如感染性疾病病原體的抗原。例如，vh1-69通常用于在人體中產生針對流感病毒的抗體(見表1)；因此在本發(fā)明的實施方案(b)(i)中可以使單個vh區(qū)段限于vh1-69。

在一個實施方案中，在(b)(iii)中，輕鏈基因座v基因區(qū)段庫集由僅一種(任選僅兩種、三種或四種)vl基因區(qū)段類型(任選及一或多個其突變體)組成，其中vl基因區(qū)段選自所述一組vl基因區(qū)段。這可用于使脊椎動物的免疫應答(及因此所得的先導抗體)偏向于預定基因區(qū)段，例如已知常用于針對抗原的天然人體免疫應答中的基因區(qū)段，所述抗原如感染性疾病病原體的抗原。

在一個實施方案中，在(a)中所述恒定區(qū)是重鏈內源性非人脊椎動物(任選宿主小鼠或大鼠)恒定區(qū)和/或在(b)中所述恒定區(qū)是輕鏈內源性非人脊椎動物(任選宿主小鼠或大鼠)恒定區(qū)。

在本發(fā)明任何配置的一個實施方案中，所述基因組被修飾為阻止或降低完全內源抗體的表達。為此的合適技術例如可見于pct/gb2010/051122、us7501552、us6673986、us6130364、wo2009/076464、ep1399559和us6586251，所述文獻在此并入本文作參考。在一個實施方案中，非人脊椎動物的內源重鏈免疫球蛋白基因座的vdj區(qū)及任選內源輕鏈免疫球蛋白基因座(λ和/或κ基因座)的vj區(qū)已經被失活。例如，所有或部分非人脊椎動物vdj區(qū)通過在哺乳動物的內源重鏈免疫球蛋白基因座中倒位而失活，任選倒位的區(qū)域移動至內源ig基因座的上游或下游(見例如wo2011004192，所述文獻在此并入本文作參考)。例如，所有或部分非人脊椎動物vj區(qū)通過在哺乳動物的內源κ鏈免疫球蛋白基因座中倒位而被失活，任選倒位的區(qū)域移動至內源ig基因座的上游或下游。例如，所有或部分非人脊椎動物vj區(qū)通過在哺乳動物的內源λ鏈免疫球蛋白基因座中倒位而被失活，任選倒位的區(qū)域移動至內源ig基因座的上游或下游。在一個實施方案中，內源重鏈基因座以內源κ和λ基因座之一或二者的方式被失活。

此外或或者，脊椎動物已經在阻止成熟宿主b和t淋巴細胞產生的遺傳背景中產生，任選rag-1-缺陷的和/或rag-2缺陷的背景。見us5859301所述產生rag-1缺陷動物的技術。

因此，在本發(fā)明任何配置或方面的一個實施方案中，內源重鏈和輕鏈表達已經被失活。

在本發(fā)明的第二種配置中，提供了：

非人脊椎動物(任選小鼠或大鼠)或脊椎動物細胞，其基因組包含：

(a)免疫球蛋白重鏈基因座，其包含位于恒定區(qū)上游的一或多個人v基因區(qū)段(例如多個vh)、一或多個人d基因區(qū)段及一或多個人j基因區(qū)段；及

(b)(i)未重排的免疫球蛋白輕鏈基因座，其包含位于恒定區(qū)上游的一或多個人vh基因區(qū)段及一或多個人j基因區(qū)段，其中每個人vh基因區(qū)段是與用于產生編碼來自抗體表達細胞的人抗體的重鏈可變區(qū)的重排的vdj的人vh基因區(qū)段(例如種系vh基因區(qū)段；例如選自如下列表a1、a2、a1.1、a1.2、a2.1、a2.2、a2.3或a2.4的基因區(qū)段)(或其突變體，例如與所述人基因區(qū)段相比具有至多15或10個核苷酸改變)相同的人基因區(qū)段，其中所述抗體結合感染性疾病病原體的抗原(任選所述抗體的可變區(qū)與來自患有、易感于或者恢復自由攜帶或分泌所述抗原的生物體引起或介導的疾病或病癥的人類個體或者來自攜帶所述生物體的人類個體的抗體相同)；或者

(ii)免疫球蛋白輕鏈基因座，其包含位于恒定區(qū)上游的重排的vj區(qū)或vdj區(qū)，其中重組區(qū)的核苷酸序列與通過人j基因區(qū)段及任選存在的人d基因區(qū)段與人vh基因區(qū)段重組產生的核苷酸序列相同，所述人vh基因區(qū)段與用于產生編碼來自抗體表達細胞的人抗體的重鏈可變區(qū)的重排的vdj的人vh基因區(qū)段(例如種系vh基因區(qū)段，例如選自如下列表a1、a2、a1.1、a1.2、a2.1、a2.2、a2.3或a2.4的基因區(qū)段)(或者其突變體，例如與所述人基因區(qū)段相比具有至多15或10個核苷酸改變)相同，其中所述抗體結合感染性疾病病原體的抗原(任選所述抗體的可變區(qū)與來自患有、易感于或者恢復自由攜帶或分泌所述抗原的生物體引起或介導的疾病或病癥的人類個體或者來自攜帶所述生物體的人類個體的抗體相同)；

(c)其中重鏈基因座中基因區(qū)段與其恒定區(qū)可操縱地連接，及輕鏈基因座中的基因區(qū)段或vj或vdj與其恒定區(qū)可操縱地連接，由此在免疫時，小鼠能產生包含通過所述重鏈基因座的重組產生的重鏈和衍生自所述輕鏈基因座的輕鏈的抗體；

(d)任選地，當應用(b)(i)時，輕鏈基因座中每個所述vh基因區(qū)段選自如下一組中：vhiii基因家族成員(任選vhiiia或vhiiib家族成員)、vhiv基因家族成員、vhiii9.1(vh3-15)、vhiiivh26(vh3-23)、vh3-21、lsg6.1、lsg12.1、dp77(v3-21)、vhh11、vh1grr、ha3h2、vhi-ha1c1、vhiii-vh2-1、vh4.18、ha4h3、hv1051、71-2、hv1f10、vh4.11、71-4、vh251、vh1-69及與其至少80％相同的基因區(qū)段；任選每個vh基因區(qū)段選自如下列表a1、a2、a1.1、a1.2、a2.1、a2.2、a2.3或a2.4。

(e)任選當應用(b)(ii)時，重組區(qū)的核苷酸序列與通過人j基因區(qū)段及任選存在的人d基因區(qū)段與人vh基因區(qū)段重組產生的核苷酸序列相同，所述人vh基因區(qū)段選自如下一組中：vhiii基因家族成員(任選vhiiia或vhiiib家族成員)、vhiv基因家族成員、vhiii9.1(vh3-15)、vhiiivh26(vh3-23)、vh3-21、lsg6.1、lsg12.1、dp77(v3-21)、vhh11、vh1grr、ha3h2、vhi-ha1c1、vhiii-vh2-1、vh4.18、ha4h3、hv1051、71-2、hv1f10、vh4.11、71-4、vh251、vh1-69及與其至少80％相同的基因區(qū)段；任選每個vh基因區(qū)段選自如下列表a1、a2、a1.1、a1.2、a2.1、a2.2、a2.3或a2.4。

在一個實施方案中，所述抗原是由細菌或病毒感染性疾病病原體例如表1中所列任何病原體表達的抗原。例如，所述抗原是選自表1所列抗原的抗原。

在本發(fā)明任何方面、配置或實施方案的一個實施方案中，“攜帶所述生物體的人類個體”是對所述病原體具有天然抗性及產生結合所述病原體或其表達的抗原的抗體的患者。

在本發(fā)明第二種配置的一個實施方案中，輕鏈基因座的j基因區(qū)段是jλ基因區(qū)段，及任選輕鏈基因座的恒定區(qū)是λ恒定區(qū)。或者，所述恒定區(qū)是cκ。

在本發(fā)明第二種配置的一個實施方案中，輕鏈基因座的v基因區(qū)段庫集包含或者由一或多個vh基因區(qū)段組成，所述vh基因區(qū)段選自如下一組中：vhiii基因家族成員(任選vhiiia或vhiiib家族成員)、vhiv基因家族成員、vhiii9.1(vh3-15)、vhiiivh26(vh3-23)、vh3-21、lsg6.1、lsg12.1、dp77(v3-21)、vhh11、vh1grr、ha3h2、vhi-ha1c1、vhiii-vh2-1、vh4.18、ha4h3、hv1051、71-2、hv1f10、vh4.11、71-4、vh251、vh1-69及與其至少80％相同的基因區(qū)段。這些基因區(qū)段是有用的，因為其在體內擴展在對抗原如感染性疾病病原體的抗原的天然人免疫應答中發(fā)現的vh基因區(qū)段的庫集。例如當用感染性疾病病原體的抗原免疫脊椎動物時，這可用于產生和分離抗體以治療和/或預防由所述病原體介導的疾病或病癥。在一個實例中，在(b)(i)中，輕鏈基因座的v基因區(qū)段庫集包含或者僅由vh基因區(qū)段組成，所述vh基因區(qū)段選自如下一組中：vhiii基因家族成員(任選vhiiia或vhiiib家族成員)、vhiv基因家族成員、vhiii9.1(vh3-15)、vhiiivh26(vh3-23)、vh3-21、lsg6.1、lsg12.1、dp77(v3-21)、vhh11、vh1grr、ha3h2、vhi-ha1c1、vhiii-vh2-1、vh4.18、ha4h3、hv1051、71-2、hv1f10、vh4.11、71-4、vh251、vh1-69及與其至少80％相同的基因區(qū)段。這可用于使脊椎動物的免疫應答(及因此所得先導抗體)偏向于預定基因區(qū)段，例如已知常用于對抗原如感染性疾病病原體的抗原的天然人免疫應答中的基因區(qū)段。例如，vh1-69常用于在人體中產生抗流感病毒的抗體(見表1)；因此在本發(fā)明的實施方案(b)(i)中可以使單個vh基因區(qū)段限于vh1-69。

在本發(fā)明第二種配置的一個實施方案中，在(a)中，所述恒定區(qū)是重鏈內源性非人脊椎動物(任選宿主小鼠或大鼠)恒定區(qū)。

在本發(fā)明第二種配置的一個實施方案中，在(b)中，所述恒定區(qū)是輕鏈內源性非人脊椎動物(任選宿主小鼠或大鼠)恒定區(qū)。

在本發(fā)明第二種配置的一個實施方案中，所述脊椎動物或細胞的基因組對于輕鏈基因座(b)(i)或(ii)是純合的；任選其中：

-所述輕鏈基因座的v基因區(qū)段庫集由一或多個人vh基因區(qū)段組成，所述vh基因區(qū)段選自如下一組中：vhiii基因家族成員(任選vhiiia或vhiiib家族成員)、vhiv基因家族成員、vhiii9.1(vh3-15)、vhiiivh26(vh3-23)、vh3-21、lsg6.1、lsg12.1、dp77(v3-21)、vhh11、vh1grr、ha3h2、vhi-ha1c1、vhiii-vh2-1、vh4.18、ha4h3、hv1051、71-2、hv1f10、vh4.11、71-4、vh251、vh1-69及與其至少80％相同的基因區(qū)段；或者

-所述輕鏈基因座的重組vj或vdj庫集由與通過人vh基因區(qū)段與人j基因區(qū)段及任選存在的人d基因區(qū)段重組產生的一或多個核苷酸序列相同的序列組成，所述vh基因區(qū)段選自下組中：vhiii基因家族成員(任選vhiiia或vhiiib家族成員)、vhiv基因家族成員、vhiii9.1(vh3-15)、vhiiivh26(vh3-23)、vh3-21、lsg6.1、lsg12.1、dp77(v3-21)、vhh11、vh1grr、ha3h2、vhi-ha1c1、vhiii-vh2-1、vh4.18、ha4h3、hv1051、71-2、hv1f10、vh4.11、71-4、vh251、vh1-69及與其至少80％相同的基因區(qū)段。在一個實施方案中，所有輕鏈基因座v基因區(qū)段均來自這組。

在本發(fā)明第二種配置的一個實施方案中，內源重鏈和輕鏈表達已經被失活，其中根據第二種配置的輕鏈基因座是所述脊椎動物或細胞基因組中唯一功能性輕鏈基因座。

在本發(fā)明第二種配置的一個實施方案中，所述脊椎動物或細胞的每個免疫球蛋白輕鏈基因座如(b)(i)所述，包含僅一個的人vh基因區(qū)段，所述vh基因區(qū)段選自如下一組中：vhiii基因家族成員(任選vhiiia或vhiiib家族成員)、vhiv基因家族成員、vhiii9.1(vh3-15)、vhiiivh26(vh3-23)、vh3-21、lsg6.1、lsg12.1、dp77(v3-21)、vhh11、vh1grr、ha3h2、vhi-ha1c1、vhiii-vh2-1、vh4.18、ha4h3、hv1051、71-2、hv1f10、vh4.11、71-4、vh251、vh1-69及與其至少80％相同的基因區(qū)段，任選其中脊椎動物或細胞的基因組對于所述輕鏈是純合的，由此所有輕鏈基因座均包含相同的單個人vh基因區(qū)段。在這個實施方案中(及通常在本發(fā)明的其它實施方案、配置和方面中)，限定重鏈和/或輕鏈基因座體系結構可用于偏向或控制抗體及基因庫集，例如以反映如上述人免疫應答。規(guī)定單個輕鏈或重鏈可變區(qū)(及任選d和/或j)基因區(qū)段(或者僅此其密切相關的突變體)-或者在下文實施方案中限定單個重排的v(d)j區(qū)或單個重鏈或輕鏈，對于簡化治療性/預防性抗體的表達和生產是有利的，因為這限制了在下游生產期間產生的抗體物種的數目。一個共同重鏈或輕鏈有利地使得可以在同一表達介質中共表達多個(例如兩個、三個或更多個)不同抗體，例如從同一宿主細胞中表達。見例如ep1523496(merusbv)和wo2011097603(regeneronpharmaceuticals,inc)。

在本發(fā)明第二種配置的一個實施方案中，所述脊椎動物或細胞的每個免疫球蛋白輕鏈基因座如(b)(ii)所述，包含僅一個的重排的vj或vdj區(qū)，任選其中脊椎動物或細胞的基因組對于所述輕鏈是純合的，由此所有輕鏈基因座均包含相同的單個重排的vj或vdj區(qū)。

在本發(fā)明第二種配置的一個實施方案中，每個免疫球蛋白輕鏈基因座進一步包含vh基因區(qū)段或重排區(qū)，其分別是所述選擇的人vh基因區(qū)段或重排區(qū)的突變體(例如與所述vh基因區(qū)段具有至多15或10個核苷酸改變)，任選其中脊椎動物或細胞的基因組對于所述輕鏈突變體vh基因區(qū)段或重排區(qū)是純合的。

在本發(fā)明第二種配置的一個實施方案中，每個免疫球蛋白輕鏈基因座均包含選自所述組的僅兩個或三個人vh基因區(qū)段，任選其中脊椎動物或細胞的基因組對于所述兩或三個輕鏈人vh基因區(qū)段是純合的。

在本發(fā)明第二種配置的一個實施方案中，每個免疫球蛋白輕鏈基因座均包含僅兩個或三個所述重排的vj或vdj區(qū)，任選其中所述脊椎動物或細胞的基因組對于所述兩個或三個輕鏈重排的vj或vdj區(qū)是純合的。

本發(fā)明提供了通過免疫根據本發(fā)明任何配置、方面或實施方案的至少一種脊椎動物(例如小鼠或大鼠)制備的單克隆或多克隆抗體組合物，任選其中所述抗原是感染性疾病病原體的抗原(例如細菌或病毒病原體抗原或者表1中列出的抗原)，任選其中使用相同抗原免疫所有脊椎動物；任選其中所述抗體是igg型的(如igg1)。

本發(fā)明提供了分離結合預定抗原(例如細菌或病毒病原體抗原或表1中列出的抗原)的抗體的第一種方法，所述方法包括：

(a)提供根據本發(fā)明任何配置、方面或實施方案的脊椎動物(任選小鼠或大鼠)；

(b)用所述抗原(任選其中所述抗原是感染性疾病病原體抗原)免疫(使用標準初免-加強方法)所述脊椎動物；

(c)從所述脊椎動物中取b淋巴細胞并選擇表達結合所述抗原的抗體的一或多個b淋巴細胞；

(d)任選使所述選擇的b淋巴細胞或其后代永生化，任選通過從中產生雜交瘤進行永生化；及

(e)分離由所述b淋巴細胞表達的抗體(例如，以及igg型抗體)。

在本發(fā)明第一種方法的第一個實施方案中，所述方法包括從所述b淋巴細胞中分離編碼結合所述抗原的所述抗體的核酸的步驟；任選用編碼人或人源化重鏈恒定區(qū)的核苷酸序列交換抗體的重鏈恒定區(qū)核苷酸序列及任選親和性成熟所述抗體的可變區(qū)；及任選將所述核酸插入表達載體及任選宿主中。技術人員了解使用標準分子生物學技術進行這項操作。例如見harlow,e.&lane,d.1998,5thedition,antibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlab.press,plainview,ny；及pasqualiniandarap,proceedingsofthenationalacademyofsciences(2004)101:257-259關于標準免疫?？贵w的可變區(qū)與人恒定區(qū)的連接可以通過本領域易于利用的技術實現，如使用本領域技術人員熟知的常規(guī)重組dna和rna技術進行。見例如sambrook,jandrussell,d.(2001,3'dedition)molecularcloning:alaboratorymanual(coldspringharborlab.press,plainview,ny)所述。

在本發(fā)明第一種方法的一個實施方案中，所述方法包括進一步產生所述抗體的突變體或衍生物。

本發(fā)明提供了產生多克隆抗體混合物的方法，所述方法包括進行本發(fā)明的第一種方法，通過用抗原單獨免疫第一和第二脊椎動物(任選第一和第二小鼠或者第一和第二大鼠)并組合分離自每個脊椎動物的抗-抗原抗體(或者所述抗體的突變體或衍生物)以產生多克隆抗體混合物；任選其中單獨或組合((i)和(ii)；或者(i)和(iii))應用如下步驟：

(i)將脊椎動物用相同抗原或不同抗原免疫(任選其中所述不同抗原由相同病原性生物體(或者由所述生物體的家族成員或不同品系)表達)；

(ii)在免疫之前，脊椎動物的輕鏈基因座含有相同的vh基因庫集(任選單個vh基因)及任選存在的相同的j庫集；任選哺乳動物的輕鏈基因座在免疫之前是相同的；

(iii)在免疫之前，脊椎動物的輕鏈基因座含有相同的重排的vj或vdj庫集(任選單個vj或vdj)；任選脊椎動物的輕鏈基因座在免疫之前是相同的。

本發(fā)明提供了產生多克隆抗體混合物的方法，所述方法包括進行本發(fā)明的第一種方法，通過用第一和第二抗原免疫一或多個脊椎動物(任選小鼠或大鼠)并組合分離自每個脊椎動物的抗-抗原抗體(或者所述抗體的突變體或衍生物)以產生多克隆抗體混合物；任選其中單獨或組合((i)和(ii)；或者(i)和(iii))應用如下步驟：

(i)所述抗原由相同病原性生物體(或者由所述生物體的家族成員或者不同品系表達)表達；

(ii)在免疫之前，脊椎動物的輕鏈基因座含有相同的vh基因庫集(任選單個vh基因)及任選存在的相同的j庫集；任選哺乳動物的輕鏈基因座在免疫之前是相同的；

(iii)在免疫之前，脊椎動物的輕鏈基因座含有相同的重排的vj或vdj庫集(任選單個vj或vdj)；任選脊椎動物的輕鏈基因座在免疫之前是相同的。

本發(fā)明提供了第二種方法：

本發(fā)明提供了產生能表達多克隆抗體混合物的宿主細胞(例如中國倉鼠卵巢(cho)或hek293細胞)的方法，所述方法在本發(fā)明第一種方法的第一個實施方案的方法中包括：

(a)用第一和第二抗原免疫一或多個脊椎動物(任選小鼠或大鼠)(任選其中不同抗原由相同病原性生物體(或其家族成員)表達)；

(b)從所述脊椎動物的b淋巴細胞分離編碼第一種和第二種抗-抗原抗體的核酸；

(c)確定第一種抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(任選全部重鏈和/或輕鏈序列)；

(d)確定第二種抗體的重鏈可變區(qū)及任選確定輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列；

(e)將每個抗體的重鏈可變區(qū)編碼序列插入重鏈表達載體中；任選其中每個重鏈的恒定區(qū)編碼序列交換為編碼人或人源化恒定區(qū)的核苷酸序列；

(f)將第一種抗體的輕鏈可變區(qū)編碼序列插入輕鏈表達載體中；任選其中第一種抗體輕鏈的恒定區(qū)編碼序列交換為編碼人或人源化恒定區(qū)的核苷酸序列；

(g)任選將第二種抗體的輕鏈可變區(qū)編碼序列插入輕鏈表達載體中，任選其中第二種抗體的輕鏈恒定區(qū)編碼序列交換為編碼人或人源化恒定區(qū)的核苷酸序列；及

(h)將每個表達載體導入宿主細胞中并在所述宿主細胞混合物中共表達抗體鏈以產生抗體，每個抗體均包含所述重鏈可變區(qū)及輕鏈之一或二者；任選其中表達載體被一起導入相同宿主細胞中(例如cho或hek293細胞)以便所述細胞能表達抗體輕鏈和重鏈，由此所述細胞或多個宿主細胞表達抗體(例如兩個、三個、四個或更多個不同抗體)，每個均包含所述重鏈可變區(qū)及輕鏈之一或二者；

(i)任選地，

在免疫之前，脊椎動物的輕鏈基因座含有相同的vh基因庫集(任選單個vh基因區(qū)段)及任選存在的相同的j庫集(任選單個j基因區(qū)段)；任選脊椎動物的輕鏈基因座在免疫之前是相同的；或者

在免疫之前，脊椎動物的輕鏈基因座含有相同的重排的vj或vdj庫集(任選單個vj或vdj)；任選脊椎動物的輕鏈基因座在免疫之前是相同的；

(j)任選地：

通過表達所述抗體的單克隆抗體或多克隆混合物產生單克隆或多克隆抗體混合物；任選隨后分離包含第一種和/或第二種抗體的重鏈可變區(qū)的抗體。

本發(fā)明還提供如此產生的單克隆或多克隆抗體混合物或者其衍生物抗體或混合物，例如其中一或多個恒定區(qū)已經被改變(例如由不同的恒定區(qū)如人恒定區(qū)置換；或者突變?yōu)樵鰪娀虺c效應子功能)(任選全部重鏈和/或輕鏈序列)。

在本發(fā)明的任何方法中，任選用于免疫的每種脊椎動物如下提供：

(a)從人血液或組織(例如b淋巴細胞(pbl)，周圍血單個核細胞(pbmc)，骨髓，脾，扁桃體或淋巴結)樣品中分離表達結合預定抗原的抗體的b淋巴細胞(例如由感染性疾病病原體表達的抗原；任選其中所述血清或組織來自患有、易感于或者恢復自由攜帶或分泌所述抗原的生物體引起或介導的疾病或病癥的人類個體或者來自攜帶所述生物體的人類個體)；

(b)確定哪個人種系vh基因區(qū)段在人體中重組以產生所述b淋巴細胞的編碼所述抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列；

(c)構建轉基因脊椎動物，其中所述人種系vh基因區(qū)段提供在根據本發(fā)明第一種或第二種配置的其輕鏈基因座中；及

(d)提供所述轉基因脊椎動物以在本發(fā)明的第一種方法中進行免疫。

術語“人血液”在此包括減去一或多個非b淋巴細胞群的人血液產品，條件是所述產物保留抗體生產細胞，如pbl。

在本發(fā)明第一種方法的一個實施方案中，用于免疫的每個脊椎動物如下提供：

(a)從人血液或組織(例如b淋巴細胞，pbmc，骨髓，脾，扁桃體或淋巴結)樣品中分離表達結合預定抗原的抗體的b淋巴細胞(例如由感染性疾病病原體表達的抗原；任選其中所述血清或組織來自患有、易感于或者恢復自由攜帶或分泌所述抗原的生物體引起或介導的疾病或病癥的人類個體或者來自攜帶所述生物體的人類個體)；

(b)確定所述b淋巴細胞的編碼所述抗體的重排的vdj或vj區(qū)的核苷酸序列；

(c)構建轉基因脊椎動物，其中所述重排的vdj或vj區(qū)提供于根據本發(fā)明第一種或第二種配置的其輕鏈基因座中；及

(d)提供所述轉基因脊椎動物以在本發(fā)明第一種方法中免疫。

共同輕鏈抗體&雙特異性(例如針對感染性疾病的兩個病原體)

本發(fā)明提供了通過本發(fā)明第二種方法(包括步驟(j))可獲得或者獲得的分離的抗體(例如igg型，如igg1-型抗體)或者其突變體或衍生物抗體，其中(i)分離的抗體包含所述第一種抗體的重鏈可變區(qū)的兩個拷貝，與所述第一種抗體的輕鏈可變區(qū)的兩個拷貝配對；或者(ii)分離的抗體包含所述第二種抗體的重鏈可變區(qū)的兩個拷貝，與所述第一種抗體的輕鏈可變區(qū)的兩個拷貝配對；或者(iii)分離的抗體是雙特異性抗體，其包含所述第一種抗體的重鏈可變區(qū)的一個拷貝，與所述第一抗體的輕鏈可變區(qū)的拷貝配對，及所述抗體的重鏈可變區(qū)的一個拷貝與所述第一種抗體的輕鏈可變區(qū)的拷貝配對，任選其中所述雙特異性抗體結合權利要求24所述第一和第二抗原；任選用于醫(yī)藥學中，任選用于治療和/或預防感染性疾病。

在本發(fā)明的一個方面中，提供了單克隆或多克隆抗體混合物(例如igg型抗體)或者其突變體或衍生物抗體，其中所述單克隆抗體或混合物如本發(fā)明任何配置、方面、實施方案或實例所述，任選用于醫(yī)藥學中，任選用于治療和/或預防感染性疾病，其中任選每個抗體均結合感染性疾病病原體的抗原，優(yōu)選相同抗原。

在本發(fā)明的一個方面中，提供了根據本發(fā)明的任何配置、方面、實施方案或實例所述的分離的單克隆或多克隆抗體或其突變體或衍生物抗體在生產用于治療和/或預防感染性疾病的藥物中的應用，任選其中感染性疾病是由細菌或病毒病原體引起的疾病。

突變體抗體的一個實例是與通過本發(fā)明第二種方法(包括步驟(j))可獲得或獲得的分離的抗體(例如igg型如igg1-型抗體)相比在其可變區(qū)中攜帶至多15或10個氨基酸突變的抗體。衍生物的實例是已經被修飾為恒定區(qū)由不同恒定區(qū)如人恒定區(qū)置換；或者突變?yōu)樵鰪娀蛉コ齠c效應子功能。

感染性疾病的實例是由細菌或病毒病原體例如表1中列出的病原體引起或介導的疾病。抗原的實例是表1中列出的那些。

例如，感染性疾病選自由選自如下一組的病原體引起的一組疾?。毫鞲惺妊獥U菌，大腸桿菌，腦膜炎奈瑟氏菌，皰疹病毒科病毒，巨細胞病毒(cmv)，hiv和流感病毒。

本發(fā)明進一步提供了編碼根據本發(fā)明的任何配置、方面、實施方案或實例的抗體的核苷酸序列，任選其中所述核苷酸序列是載體的一部分。

本發(fā)明進一步提供了藥物組合物，其包含根據本發(fā)明的任何配置、方面、實施方案或實例的一或多個抗體及稀釋劑、賦形劑或載體。

在本發(fā)明的第三種配置中，提供了：

非人脊椎動物(任選小鼠或大鼠)或脊椎動物細胞，其基因組包含：

(a)免疫球蛋白重鏈基因座，其包含：

(i)位于恒定區(qū)上游的一或多個人vl基因區(qū)段、一或多個人d基因區(qū)段及一或多個人j基因區(qū)段(任選重排的vldjhch或vλdjhch)；或者

(ii)位于恒定區(qū)上游的一或多個人vh基因區(qū)段、一或多個人d基因區(qū)段及一或多個人jh基因區(qū)段，所述人vh基因區(qū)段選自如下一組中：vhiii基因家族成員(任選vhiiia或vhiiib家族成員)、vhiv基因家族成員、vhiii9.1(vh3-15)、vhiiivh26(vh3-23)、vh3-21、lsg6.1、lsg12.1、dp77(v3-21)、vhh11、vh1grr、ha3h2、vhi-ha1c1、vhiii-vh2-1、vh4.18、ha4h3、hv1051、71-2、hv1f10、vh4.11、71-4、vh251、vh1-69及至少80％相同的基因區(qū)段；任選每個vh基因區(qū)段(及任選每個d)選自如下列表a1、a2、a1.1、a1.2、a2.1、a2.2、a2.3或a2.4；及

(b)免疫球蛋白輕鏈基因座，其包含位于恒定區(qū)上游的一或多個人v基因區(qū)段(例如多個vl)及一或多個人j基因區(qū)段，任選其中輕鏈基因座如本發(fā)明第一種配置的(b)(i)或(b)(ii)所述；

其中所述重鏈基因座中的基因區(qū)段與其恒定區(qū)可操縱地連接，所述輕鏈基因座中的基因區(qū)段與其恒定區(qū)可操縱地連接，以便在免疫時小鼠能產生包含通過所述重鏈基因座的重組產生的重鏈和通過所述輕鏈基因座的重組產生的輕鏈的抗體。

在一個實例中，在(a)(i)中，所有重鏈基因座v基因區(qū)段均是人vl基因區(qū)段。

在本發(fā)明第三種配置的一個實施方案中，輕鏈基因座的v基因區(qū)段庫集包含或者由一或多個vl基因區(qū)段組成，所述vl基因區(qū)段選自如下一組中：vλii基因家族成員、vλvii4a、vλii2.1、vλvii4a、vλ1基因家族成員、vλ3基因家族成員、iglv1s2、vλ3-cml70、lalh2、lalvl、la3h3、kv325、vκi基因家族成員、κi-15a(kl012)、vκii家族成員、vκiii家族成員、vκi基因家族成員、κi-15a(kl012)、vκiia2(任選a2a等位基因)、vκa27(humkv325)及與其至少80％相同的基因區(qū)段；任選每個vl基因區(qū)段選自如下列表a1、a2、a1.1、a1.2、a2.1、a2.2、a2.3或a2.4；和/或其中或在(a)(ii)中，重鏈基因座v基因區(qū)段庫集由僅一種(或兩種、三種或四種)vh基因區(qū)段類型(任選及其一或多種突變體)組成，其中vh基因區(qū)段選自所述一組vh基因區(qū)段。這可用于使脊椎動物的免疫應答(及因此所得先導抗體)偏向于預定的基因區(qū)段，例如已知常用于對抗原如感染性疾病病原體的抗原的天然人免疫應答中的基因區(qū)段。

在本發(fā)明第三種配置的一個實施方案中，在(a)中所述恒定區(qū)是重鏈內源性非人脊椎動物(任選宿主小鼠或大鼠)恒定區(qū)和/或在(b)中所述恒定區(qū)是輕鏈內源性非人脊椎動物(任選宿主小鼠或大鼠)恒定區(qū)。

在本發(fā)明第三種配置的一個實施方案中，內源性重鏈和輕鏈表達已經被失活。

本發(fā)明的第四種配置提供了：

非人脊椎動物(任選小鼠或大鼠)或者脊椎動物細胞，其基因組包含：

(a)(i)未重排的免疫球蛋白重鏈基因座，其包含位于恒定區(qū)上游的一或多個人vl基因區(qū)段、一或多個人d基因區(qū)段及一或多個jh基因區(qū)段，其中每個人vl基因區(qū)段是與用于產生編碼來自抗體表達細胞的人抗體的輕鏈可變區(qū)的重排的vj的人vl基因區(qū)段(例如種系vl基因區(qū)段，如選自如下列表a1、a2、a1.1、a1.2、a2.1、a2.2、a2.3或a2.4的vl基因區(qū)段)相同的人基因區(qū)段(或其突變體，例如與所述人基因區(qū)段相比具有至多15或10個核苷酸改變)，其中所述抗體結合感染性疾病病原體的抗原(任選所述抗體的可變區(qū)與來自患有、易感于或者恢復自由攜帶或分泌所述抗原的生物體引起或介導的疾病或病癥的人類個體或者來自攜帶所述生物體的人類個體的抗體相同)；或者

(ii)免疫球蛋白重鏈基因座，其包含位于恒定區(qū)上游的重排的vj區(qū)或vdj區(qū)，其中重組區(qū)的核苷酸序列與通過人j基因區(qū)段及任選存在的人d基因區(qū)段與用于產生編碼來自抗體表達細胞的人抗體的輕鏈可變區(qū)的重排的vj的人vl基因區(qū)段(或其突變體，例如與所述人基因區(qū)段相比具有至多15或10個核苷酸改變)相同的人基因區(qū)段(例如種系vl基因區(qū)段；例如選自如下列表a1、a2、a1.1、a1.2、a2.1、a2.2、a2.3或a2.4的vl基因區(qū)段)重組產生的核苷酸序列相同，其中所述抗體結合感染性疾病病原體的抗原(任選所述抗體的可變區(qū)與來自患有、易感于或者恢復自由攜帶或分泌所述抗原的生物體引起或介導的疾病或病癥的人類個體或者來自攜帶所述生物體的人類個體的抗體相同)；

(b)免疫球蛋白輕鏈基因座，其包含位于恒定區(qū)上游的一或多個人v基因區(qū)段(例如多個v)及一或多個人j基因區(qū)段；及

(c)其中輕鏈基因座中的基因區(qū)段與其恒定區(qū)可操縱地連接，及重鏈基因座中的基因區(qū)段或vj或vdj與其恒定區(qū)可操縱地連接，由此在免疫時小鼠能產生包含通過重組輕鏈基因座產生的輕鏈和衍生自重鏈基因座的重鏈的抗體；

(d)任選地，當應用(a)(i)時，重鏈基因座中的每個所述vl基因區(qū)段選自由如下組成的一組中的vl基因區(qū)段：vλii基因家族成員、vλvii4a、vλii2.1、vλvii4a、vλ1基因家族成員、vλ3基因家族成員、iglv1s2、vλ3-cml70、lalh2、lalvl、la3h3、kv325、vki基因家族成員、ki-15a(kl012)、vκii家族成員、vκiii家族成員、vκi基因家族成員、κi-15a(kl012)、vκiia2(任選a2a等位基因)、vκa27(humkv325)及與其至少80％相同的基因區(qū)段；任選每個vl基因區(qū)段選自如下列表a1、a2、a1.1、a1.2、a2.1、a2.2、a2.3或a2.4；

(e)任選地，當應用(a)(ii)時，重組區(qū)的核苷酸序列與通過人j基因區(qū)段及任選存在的人d基因區(qū)段與人vl基因區(qū)段重組產生的核苷酸序列相同，所述人vl基因區(qū)段選自如下一組中：vλii基因家族成員、vλvii4a、vλii2.1、vλvii4a、vλ1基因家族成員、vλ3基因家族成員、iglv1s2、vλ3-cml70、lalh2、lalvl、la3h3、kv325、vki基因家族成員、κi-15a(kl012)、vκii家族成員、vκiii家族成員、vκi基因家族成員、κi-15a(kl012)、vκiia2(任選a2a等位基因)、vκa27(humkv325)及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

所述vl基因區(qū)段組可用于使脊椎動物的免疫應答(及因此所得先導抗體)偏向于預定基因區(qū)段如已知常用于對抗原如感染性疾病病原體抗原的天然人免疫應答的基因區(qū)段。

在本發(fā)明第四種配置的一個實施方案中，重鏈基因座的vl基因區(qū)段是vλ基因區(qū)段。

在本發(fā)明第四種配置的一個實施方案中，在(a)中，所述恒定區(qū)是重鏈內源性非人脊椎動物(任選宿主小鼠或大鼠)恒定區(qū)。

在本發(fā)明第四種配置的一個實施方案中，在(b)中，所述恒定區(qū)是輕鏈內源性非人脊椎動物(任選宿主小鼠或大鼠)恒定區(qū)。

在本發(fā)明第四種配置的一個實施方案中，所述脊椎動物或細胞的基因組對于重鏈基因座(a)(i)或(ii)是純合的，任選其中：

-重鏈基因座的v基因區(qū)段庫集由一或多個(或僅由)人vl基因區(qū)段組成，所述vl基因區(qū)段選自如下一組中的vl基因區(qū)段：vλii基因家族成員、vλvii4a、vλii2.1、vλvii4a、vλ1基因家族成員、vλ3基因家族成員、iglv1s2、vλ3-cml70、lalh2、lalvl、la3h3、kv325、vκi基因家族成員、κi-15a(kl012)、vκii家族成員、vκiii家族成員、vκi基因家族成員、κi-15a(kl012)、vκiia2(任選a2a等位基因)、vκa27(humkv325)及與其至少80％相同的基因區(qū)段；或者

-重鏈基因座的重組vj或vdj庫集由與通過重組人vl基因區(qū)段與人j基因區(qū)段及任選存在的人d基因區(qū)段產生的一或多個核苷酸序列相同的序列組成，所述人vl基因區(qū)段選自如下一組中的vl基因區(qū)段：vλii基因家族成員、vλvii4a、vλii2.1、vλvii4a、vλ1基因家族成員、vλ3基因家族成員、iglv1s2、vλ3-cml70、lalh2、lalvl、la3h3、kv325、vκi基因家族成員、κi-15a(kl012)、vκii家族成員、vκiii家族成員、vκi基因家族成員、κi-15a(kl012)、vκiia2(任選a2a等位基因)、vκa27(humkv325)及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

在本發(fā)明第四種配置的一個實施方案中，內源性重鏈和輕鏈表達已經被失活，其中根據本發(fā)明第四種配置的重鏈基因座是脊椎動物或細胞基因組中唯一的功能性重鏈基因座。

在本發(fā)明第四種配置的一個實施方案中，所述脊椎動物或細胞的每個免疫球蛋白重鏈基因座如(a)(i)所述，包含僅一個人vl基因區(qū)段，所述vl基因區(qū)段選自如下一組中的vl基因區(qū)段：vλii基因家族成員、vλvii4a、vλii2.1、vλvii4a、vλ1基因家族成員、vλ3基因家族成員、iglv1s2、vλ3-cml70、lalh2、lalvl、la3h3、kv325、vκi基因家族成員、κi-15a(kl012)、vκii家族成員、vκiii家族成員、vκi基因家族成員、κi-15a(kl012)、vκiia2(任選a2a等位基因)、vκa27(humkv325)及與其至少80％相同的基因區(qū)段，任選其中脊椎動物或細胞的基因組對于所述重鏈是純合的，由此所有重鏈基因座均包含相同的單個人vl基因區(qū)段。

在本發(fā)明第四種配置的一個實施方案中，所述脊椎動物或細胞的每個免疫球蛋白重鏈基因座如(a)(ii)所述，包含僅一個重排的vj或vdj區(qū)，任選其中脊椎動物或細胞的基因組對于所述重鏈是純合的，由此所有重鏈均包含相同的單個重排的vj或vdj區(qū)。

在本發(fā)明第四種配置的一個實施方案中，每個免疫球蛋白重鏈基因座進一步包含vl基因區(qū)段或者重排區(qū)，其分別是所述選擇的人vl基因區(qū)段或重排區(qū)的突變體，任選其中所述脊椎動物或細胞的基因組對于所述輕鏈突變體vl基因區(qū)段或重排區(qū)是純合的。

在本發(fā)明所有配置、方面、實例和實施方案中，其中提及的“突變體”包括與參考序列(例如參考vh、vl、vj或vdj)相同、但是具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸或氨基酸改變的突變體序列。

在本發(fā)明第四種配置的一個實施方案中，每個免疫球蛋白重鏈基因座包含選自所述組的僅兩個或三個人vl基因區(qū)段，任選其中脊椎動物或細胞的基因組對于所述兩個或三個重鏈人vl基因區(qū)段是純合的。

在本發(fā)明第四種配置的一個實施方案中，每個免疫球蛋白重鏈基因座包含僅兩個或三個所述重排的vj或vdj區(qū)，任選其中脊椎動物或細胞的基因組對于所述兩個或三個重鏈重排的vj或vdj區(qū)是純合的。

本發(fā)明提供了通過用抗原免疫本發(fā)明第三或第四個實施方案所述的至少一種脊椎動物(例如小鼠或大鼠)而制備的單克隆或多克隆抗體組合物，任選其中所述抗原是感染性疾病病原體抗原，任選其中使用相同抗原免疫所有脊椎動物；任選其中所述抗體是igg型的。

本發(fā)明提供了第三種方法：分離結合預定抗原的抗體(如igg型如igg1)的方法，所述方法包括：

(a)提供根據本發(fā)明第三或第四個實施方案的脊椎動物(任選小鼠或大鼠)；

(b)用所述抗原(任選其中所述抗原是感染性疾病病原體抗原)免疫(例如使用標準初免-加強)所述脊椎動物；

(c)從所述脊椎動物中取b淋巴細胞并選擇表達結合所述抗原的抗體的一或多個b淋巴細胞；

(d)任選使所述選擇的b淋巴細胞或其后代永生化，任選通過從中產生雜交瘤進行；及

(e)分離由b淋巴細胞表達的抗體(例如，以及igg型抗體)；

(f)任選地，本發(fā)明第三種方法包括從所述b淋巴細胞中分離編碼結合所述抗原的所述抗體的核酸的步驟；任選用編碼人或人源化重鏈恒定區(qū)的核苷酸序列交換所述抗體的重鏈恒定區(qū)核苷酸序列及任選親和性成熟所述抗體可變區(qū)，及任選將所述核酸插入表達載體及任選宿主中。

任選地，本發(fā)明第三種方法進一步包括產生所述抗體的突變體或衍生物。

本發(fā)明提供了第四種方法：產生多克隆抗體混合物的方法，所述方法包括進行所述第三種方法，通過用抗原(例如本文揭示的任何抗原)單獨免疫第一和第二脊椎動物(任選第一和第二小鼠或者第一和第二大鼠)并組合分離自每個脊椎動物的抗-抗原抗體(或者所述抗體的突變體或衍生物)以產生多克隆抗體混合物；任選其中單獨或組合((i)和(ii)；或者(i)和(iii))應用如下步驟：

(i)將所述脊椎動物用相同抗原或不同抗原免疫(任選其中不同抗原由相同病原性生物體(或者其不同的家族成員或者不同品系的生物體)表達)；

(ii)在免疫之前，所述脊椎動物的重鏈基因座含有相同的vl基因庫集(任選單個vl基因)及任選存在的相同的d和/或j庫集；任選哺乳動物的重鏈基因座在免疫之前是相同的；

(iii)在免疫之前，脊椎動物的重鏈基因座含有相同的重排的vj或vdj庫集(任選單個vj或vdj)；任選脊椎動物的重鏈基因座在免疫之前是相同的。

本發(fā)明提供了第五種方法：產生多克隆抗體混合物的方法，所述方法包括進行所述第三種方法，通過用第一和第二抗原免疫一或多個脊椎動物(任選小鼠或大鼠)并組合分離自每個脊椎動物的抗-抗原抗體(或者所述抗體的突變體或衍生物)以產生多克隆抗體混合物；任選其中單獨或組合((i)和(ii)；或者(i)和(iii))進行如下步驟：

(i)所述抗原由相同病原性生物體(或其不同的家族成員或者不同品系的生物體)表達；

(ii)在免疫之前，脊椎動物的重鏈基因座含有相同的vl基因庫集(任選單個vl基因)及任選存在的相同的d和/或j庫集；任選哺乳動物的重鏈基因座在免疫之前是相同的；

(iii)在免疫之前，脊椎動物的重鏈基因座含有相同的重排的vj或vdj庫集(任選單個vj或vdj)；任選脊椎動物的重鏈基因座在免疫之前是相同的。

本發(fā)明提供了第六種方法：產生能表達多克隆抗體混合物的宿主細胞的方法，所述方法包括在第三種方法中進行步驟(f)：

(a)用第一和第二抗原免疫一或多個脊椎動物(任選小鼠或大鼠)(任選其中不同抗原由相同病原性生物體(或其家族成員)表達)；

(b)從所述脊椎動物的b淋巴細胞分離編碼第一種和第二種抗-抗原抗體的核酸；

(c)確定第一種抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(任選全部重鏈和/或輕鏈序列)；

(d)確定第二種抗體的輕鏈可變區(qū)及任選確定重鏈可變區(qū)的核苷酸序列；

(e)將每個抗體的輕鏈可變區(qū)編碼序列插入輕鏈表達載體中；任選其中每個輕鏈的恒定區(qū)編碼序列被交換為編碼人或人源化恒定區(qū)的核苷酸序列；

(f)將第一種抗體的重鏈可變區(qū)編碼序列插入重鏈表達載體中；任選其中第一種抗體的重鏈恒定區(qū)編碼序列被交換為編碼人或人源化恒定區(qū)的核苷酸序列；

(g)任選地，將第二種抗體的重鏈可變區(qū)編碼序列插入重鏈表達載體中；任選其中第二種抗體的重鏈恒定區(qū)編碼序列被交換為編碼人或人源化恒定區(qū)的核苷酸序列；及

(h)將每個表達載體導入宿主細胞中并在所述宿主細胞混合物中共表達抗體鏈以產生抗體，每個抗體包含所述輕鏈可變區(qū)和重鏈之一或二者；任選其中表達載體一起被導入相同宿主細胞中(例如cho或hek293細胞)以便所述細胞能表達抗體輕鏈及重鏈，由此所述細胞或多個宿主細胞表達抗體(例如兩個、三個或四個不同抗體)，每個均包含所述輕鏈可變區(qū)和重鏈之一或二者；

(i)任選地：

在免疫之前，脊椎動物的重鏈基因座含有相同的vl基因庫集(任選單個vl基因區(qū)段)及任選存在的相同的d和/或j庫集(任選單個d和j基因區(qū)段)；任選脊椎動物的重鏈基因座在免疫之前是相同的；或者

在免疫之前，脊椎動物的重鏈基因座含有相同的重排的vj或vdj庫集(任選單個vj或vdj)；任選脊椎動物的重鏈基因座在免疫之前是相同的。

本發(fā)明還提供了如此產生的單克隆或多克隆抗體混合物或者其衍生物抗體或混合物，例如其中一或多個恒定區(qū)已經被改變(例如由不同的恒定區(qū)如人恒定區(qū)置換，或者突變?yōu)樵鰪娀蛳齠c效應子功能)。

本發(fā)明提供了第七種方法：產生單克隆抗體或多克隆抗體混合物的方法，所述方法包括進行第六種方法及表達所述抗體的單克隆抗體或多克隆混合物；任選隨后分離包含第一種和/或第二種抗體的輕鏈可變區(qū)的抗體。

任選地，用于免疫的每個脊椎動物如下提供：

(a)從人血液或組織(例如b淋巴細胞、pbmc、骨髓、脾、扁桃體或淋巴結)樣品中分離表達結合預定抗原的抗體的b淋巴細胞(例如由感染性疾病病原體表達的抗原；任選其中所述血清或組織來自患有、易感于或者恢復自由攜帶或分泌所述抗原的生物體引起或介導的疾病或病癥的人類個體或者來自攜帶所述生物體的人類個體)；

(b)確定哪個人種系vl基因區(qū)段在人體中重組以產生編碼所述抗體輕鏈可變區(qū)的所述b淋巴細胞的核苷酸序列；

(c)構建轉基因脊椎動物，其中所述人種系vl基因區(qū)段提供于根據本發(fā)明第三或第四種配置的其重鏈基因座中；及

(d)提供所述轉基因脊椎動物以在本發(fā)明的第四種、第五種或第六種方法中免疫。

在另一個實施方案中，用于免疫的每個脊椎動物如下提供：

(a)從人血液或組織(例如b淋巴細胞、pbmc、骨髓、脾、扁桃體或淋巴結)樣品中分離表達結合預定抗原的抗體的b淋巴細胞(例如由感染性疾病病原體表達的抗原；任選其中所述血清或組織來自患有、易感于或者恢復自由攜帶或分泌所述抗原的生物體引起或介導的疾病或病癥的人類個體或者來自攜帶所述生物體的人類個體)；

(b)確定編碼所述抗體的重排的vdj或vj區(qū)的所述b淋巴細胞的核苷酸序列；

(c)構建轉基因脊椎動物，其中所述重排的vdj或vj區(qū)提供于根據本發(fā)明第三或第四種配置的其重鏈基因座中；及

(d)提供所述轉基因脊椎動物以在本發(fā)明的第四種、第五種或第六種方法中免疫。

共同重鏈抗體&雙特異性(例如針對感染性疾病的兩個病原體抗原)

本發(fā)明提供了通過本發(fā)明第七種方法可獲得或者獲得的分離的抗體(例如igg型抗體)或者其突變體或衍生物，其中(i)所述分離的抗體包含所述第一種抗體的重鏈可變區(qū)的兩個拷貝，與所述第一種抗體的輕鏈可變區(qū)的兩個拷貝配對；或者(ii)所述分離的抗體包含所述第二種抗體的重鏈可變區(qū)的兩個拷貝，與所述第一種抗體的輕鏈可變區(qū)的兩個拷貝配對；或者(iii)所述分離的抗體是雙特異性抗體，其包含所述第一種抗體的重鏈可變區(qū)的一個拷貝，與所述第一種抗體的輕鏈可變區(qū)的拷貝配對，及所述抗體的重鏈可變區(qū)的一個拷貝，與所述第一種抗體的輕鏈可變區(qū)的拷貝配對，任選其中雙特異性抗體結合上述第一及第二抗原；任選用于醫(yī)藥學中，任選用于治療和/或預防感染性疾病。

本發(fā)明提供了單克隆或多克隆抗體混合物(例如igg型抗體)，其中所述單克隆抗體或混合物包含或由通過本發(fā)明的第四種、第五種、第六種或第七種方法產生的抗體或者其突變體或衍生物抗體組成，任選用于醫(yī)藥學中，任選用于治療和/或預防感染性疾病，其中任選每個抗體均結合感染性疾病病原體的抗原，優(yōu)選相同抗原。

如下實施方案涉及通過本發(fā)明的任何前述配置或方法獲得或可獲得的抗體、宿主細胞、核酸及組合物以及這些元件的應用：

本發(fā)明提供分離的嵌合抗體用以治療和/或預防感染性疾病或病癥，所述抗體包含非人脊椎動物(任選小鼠或大鼠)重鏈恒定區(qū)和結合感染性疾病病原體的抗原的人可變區(qū)，其中所述抗體在包括用所述抗原免疫根據本發(fā)明第一種至第七種方法中任一種方法的脊椎動物的方法中可獲得或獲得。所述抗原例如是如上述任何抗原。所述疾病或病癥例如是上述任何疾病或病癥。

本發(fā)明提供了分離的人抗體以治療和/或預防感染性疾病或病癥，所述抗體包含人重鏈恒定區(qū)和結合感染性疾病病原體抗原的人可變區(qū)，其中所述抗體，在當所述可變區(qū)與所述脊椎動物的重鏈恒定區(qū)(例如小鼠或大鼠重鏈恒定區(qū))可操縱地連接時，在轉基因非人脊椎動物(例如小鼠或大鼠)中在包括體內親和性成熟抗體可變區(qū)的方法中可獲得或獲得，通過(a)用所述抗原免疫本發(fā)明任何配置的脊椎動物，(b)分離編碼如上述嵌合抗體的核酸，(c)用編碼人重鏈恒定區(qū)的核苷酸序列置換編碼非人脊椎動物重鏈恒定區(qū)的核酸的核苷酸序列以產生編碼人抗體的核酸；(d)在體外表達所述人抗體(任選從攜帶所述人核酸的cho或hek293細胞表達)及(e)分離所述人抗體(任選進一步親和性成熟所述抗體和/或產生其衍生物)。本發(fā)明提供了第一種和第二種這種人抗體(任選還有第三種及任選第四種抗體)的混合物，每種抗體均能結合感染性疾病病原體的抗原(任選其中第一種抗體結合第一抗原，第二種抗體結合第二抗原，所述抗原來自相同病原體；或者其中所述抗原是相同的)。任選地，第一種抗體的輕鏈氨基酸序列與第二種抗體的輕鏈氨基酸序列是相同的，或者具有至多15個氨基酸改變。這種共同(或密切相關的)鏈的優(yōu)勢在上文闡述，并包括相對便于生產。

所述抗原例如是上述任何抗原。所述疾病或病癥是例如上述任何疾病或病癥。所述病原體是例如上述任何病原體。

本發(fā)明提供了包含結合預定抗原(例如由細菌或病毒病原體表達的抗原)的人可變結構域的抗體，其中所述可變結構域序列由重排的vdj和vj區(qū)編碼，每個vdj和/或vj均是通過在體內重排人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段(v和j及任選存在的d區(qū)段)產生的雜交區(qū)；任選其中所述抗體包含人恒定區(qū)。

本發(fā)明提供一種產生治療和/或預防感染性疾病或病癥的分離的人抗體的方法，所述抗體包含人重鏈恒定區(qū)及結合感染性疾病病原體抗原的人可變區(qū)，其中所述方法包括當所述可變區(qū)與所述脊椎動物的重鏈恒定區(qū)(例如小鼠或大鼠重鏈恒定區(qū))可操縱地連接時，在轉基因非人脊椎動物(例如小鼠或大鼠)中在體內親和性成熟抗體可變區(qū)，通過(a)用所述抗原免疫本發(fā)明任何配置的脊椎動物；(b)分離編碼如上述嵌合抗體的核酸；(c)用編碼人重鏈恒定區(qū)的核苷酸序列置換編碼非人脊椎動物重鏈恒定區(qū)的核酸的核苷酸序列以產生編碼人抗體的核酸；(d)在體外表達所述人抗體(任選從攜帶所述人核酸的cho或hek293細胞中表達)及(e)分離所述人抗體(任選進一步親和性成熟所述抗體和/或產生其衍生物)。所述抗原例如是如上述任何抗原。所述疾病或病癥例如是如上述任何疾病或病癥。所述病原體是例如上述任何病原體。

本發(fā)明提供了如上述任何分離的單克隆或多克隆抗體或混合物在生產治療和/或預防感染性疾病的藥物中的應用，任選其中感染性疾病是由細菌或病毒病原體引起的疾病。所述疾病或病癥是例如上述任何疾病或病癥。所述病原體是例如上述任何病原體。例如，所述感染性疾病選自由選自如下病原體引起的疾?。毫鞲惺妊獥U菌，大腸桿菌，腦膜炎奈瑟氏菌，皰疹病毒科病毒，巨細胞病毒(cmv)，hiv和流感病毒。

本發(fā)明提供了編碼根據本發(fā)明任何配置、方面、實例或實施方案的抗體的重鏈和輕鏈或者至少其可變區(qū)的第一個和第二個核苷酸序列(例如dna、rna、mrna、cdna)，任選其中每個核苷酸序列是載體的一部分。

本發(fā)明提供了包含編碼上述第一種和第二種抗體的重鏈及上述第一種抗體的輕鏈(及任選第二種抗體的輕鏈)的一或多個表達載體的宿主。而且，參考上述關于具有共同抗體鏈對于生產抗體混合物的優(yōu)勢的討論。

本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含根據本發(fā)明任何配置、方面、實例或實施方案的一或多個抗體及稀釋劑、賦形劑或載體；任選其中所述組合物提供于與iv針頭或注射器連接的容器中或者于iv包中。技術人員已知適于藥物應用的標準稀釋劑、賦形劑和載體。

在本說明書中個，在提及“至少80％相同”時，是指涵蓋如下可選的相同性：至少85％、90、95、96、97、98或99％相同，文中涵蓋的一或多個這些相同性在權利要求書中可代替“至少80％相同”。

定制v(d)j摻入免疫球蛋白基因座以生產抗感染性疾病的抗體

在上述各個配置、方面、實施方案和實例中，本發(fā)明提供了技術人員以定制或偏向所述庫集的方式選擇免疫球蛋白基因區(qū)段的可能性用于產生治療和/或預防感染性疾病的抗體。本發(fā)明人已經將下組的用于本發(fā)明中的基因區(qū)段根據所得抗體的希望應用而加以歸類。

列表a:

針對結合由病原體表達的抗原的抗體的免疫球蛋白基因區(qū)段

(a)vl基因區(qū)段，選自：vλii基因家族成員、vλvii4a、vλii2.1、vλvii4a、vλ1基因家族成員、vλ3基因家族成員、iglv1s2、vλ3-cml70、lalh2、lalvl、la3h3、kv325、vκi基因家族成員、κi-15a(kl012)、vκii家族成員、vκiii家族成員、vκi基因家族成員、κi-15a(kl012)、vκiia2(任選a2a等位基因)、vκa27(humkv325)及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

(b)vλ基因區(qū)段，選自：vλii基因家族成員、vλvii4a、vλii2.1、vλvii4a、vλ1基因家族成員、vλ3基因家族成員、iglv1s2、vλ3-cml70、lalh2、lalvl、la3h3及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

(c)vκ基因區(qū)段，選自：kv325、vκi基因家族成員、κi-15a(kl012)、vκii家族成員、vκiii家族成員、vκi基因家族成員、κi-15a(kl012)、vκiia2(任選a2a等位基因)、vκa27(humkv325)及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

(d)vh基因區(qū)段，選自：vhiii基因家族成員(任選vhiiia或vhiiib家族成員)、vhiv基因家族成員、vhiii9.1(vh3-15)、vhiiivh26(vh3-23)、vh3-21、lsg6.1、lsg12.1、dp77(v3-21)、vhh11、vh1grr、ha3h2、vhi-ha1c1、vhiii-vh2-1、vh4.18、ha4h3、hv1051、71-2、hv1f10、vh4.11、71-4、vh251、vh1-69及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

(e)jλ基因區(qū)段，選自jλ2、jλ3及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

(f)d基因區(qū)段，選自dk1、dxp'1、dn4r、d2r及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

列表a1:

針對結合由細菌病原體表達的抗原的抗體的免疫球蛋白基因區(qū)段

(a)vλ基因區(qū)段，選自vλii基因家族成員、vλvii4a、vλii2.1、vλvii4a及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

(b)vκ基因區(qū)段，選自：vκi基因家族成員、κi-15a(kl012)、vκii家族成員、vκiii家族成員、vκi基因家族成員、κi-15a(kl012)、vκiia2(任選a2a等位基因)、vκa27(humkv325)及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

(c)vh基因區(qū)段，選自：vh3基因家族成員(任選vhiiia或vhiiib家族成員)、vhiii9.1(vh3-15)、vhiiivh26(vh3-23)、vh3-21、lsg6.1、lsg12.1、dp77(v3-21)、vhh11及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

(d)jλ基因區(qū)段，選自jλ2、jλ3及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

(e)jh基因區(qū)段，選自jh2、jh3、jh4及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

列表a1.1:

針對結合由流感嗜血桿菌表達的抗原的抗體的免疫球蛋白基因區(qū)段

(a)vλ基因區(qū)段，選自vλii基因家族成員、vλvii4a、vλii2.1、vλvii4a及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

(b)vκ基因區(qū)段，選自vκii家族成員、vκiii家族成員、vκi基因家族成員、κi-15a(kl012)、vκiia2(任選a2a等位基因)、vκa27(humkv325)及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

(c)vh基因區(qū)段，選自vh3基因家族成員(任選vhiiib家族成員)、vhiii9.1(vh3-15)、vhiiivh26(vh3-23)、vh3-21、lsg6.1、lsg12.1、dp77(v3-21)及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

(d)jλ基因區(qū)段，選自jλ2、jλ3及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

列表a1.2:

針對結合由大腸桿菌或腦膜炎奈瑟氏菌表達的抗原的抗體的免疫球蛋白基因區(qū)段

(a)vh基因區(qū)段，選自vh3基因家族成員(任選vhiiia或vhiiib成員)、vhiii9.1(vh3-15)、vhh11、vhiiivh26(vh3-23)、與其至少80％相同的基因區(qū)段，例如vhiii9.1+jh3；或者vhh11+jh4；或者vhiiivh26+jh2。

(b)vκ基因區(qū)段，選自vκi基因家族成員、κi-15a(kl012)及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

(c)vλ基因區(qū)段，選自vλii基因家族成員、vλii2.1及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

(d)jh基因區(qū)段，選自jh2、jh3、jh4及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

a2:

結合由病毒病原體表達的抗原的抗體的免疫球蛋白基因區(qū)段

(a)vh基因區(qū)段，選自vhiii基因家族成員、vhiv基因家族成員、vhiii-vh26(vh3-23)、vh1grr、ha3h2、vhi-ha1c1、vhiii-vh2-1、vh4.18、ha4h3、hv1051、71-2、hv1f10、vh4.11、71-4、vh251、vh1-69及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

(b)vλ基因區(qū)段，其選自vλ1基因家族成員、vλ3基因家族成員、iglv1s2、vλ3-cml70、lalh2、lalvl、la3h3及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

(c)vk基因區(qū)段，選自kv325及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

(d)jh基因區(qū)段，選自jh3、jh5、jh6及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

(e)d基因區(qū)段，選自dk1、dxp'1、dn4r、d2r及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

(f)jλ基因區(qū)段，選自jλ2、jλ3及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

a2.1：

結合由皰疹病毒家族(例如vzv或hsv)表達的抗原的抗體的免疫球蛋白基因區(qū)段

(a)vh基因區(qū)段，選自vhiii基因家族成員、vhiv基因家族成員、vhiii-vh26(vh3-23)、vh1grr、ha3h2、vhi-ha1c1、vhiii-vh2-1、vh4.18、ha4h3、及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

(b)vλ基因區(qū)段，選自vλ1基因家族成員、vλ3基因家族成員、iglv1s2、vλ3-cml70、lalh2、lalvl、la3h3及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

(c)jh基因區(qū)段，選自jh3、jh5、jh6及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

(d)d基因區(qū)段，選自dk1、dxp'1、dn4r、d2r及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

(e)jλ基因區(qū)段，選自jλ2、jλ3及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

a2.2:

結合由cmv表達的抗原的抗體的免疫球蛋白基因區(qū)段

(a)vh基因區(qū)段，選自hv1051及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

(b)vκ基因區(qū)段，選自kv325及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

a2.3:

結合由hiv表達的抗原的抗體的免疫球蛋白基因區(qū)段

(a)vh基因區(qū)段，選自71-2、hv1f10、vh4.11、71-4、vh251、vh1-69及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

a2.4:

結合由流感病毒表達的抗原的抗體的免疫球蛋白基因區(qū)段

(a)vh基因區(qū)段，選自vh1-69及與其至少80％相同的基因區(qū)段。

因此，

在希望產生抗體或抗體混合物以治療和/或預防感染性疾病時，可以從列表a1中選擇用于本發(fā)明任何配置、方面、方法、實例或實施方案中的一或多個v、d和/或一或多個或所有j基因區(qū)段。因此，例如在本發(fā)明第一種配置的(a)中，所列出的重鏈v基因區(qū)段選自列表a中的vh基因區(qū)段，任選具有該目錄中的d。

在希望產生抗體或抗體混合物以治療和/或預防由細菌病原體引起或介導的感染性疾病時，用于本發(fā)明的任何配置、方面、方法、實例或實施方案中的一或多個或所有v、d和/或j基因區(qū)段可選自列表a1。

在希望產生抗體或抗體混合物以治療和/或預防由病毒病原體引起或介導的感染性疾病時，用于本發(fā)明的任何配置、方面、方法、實例或實施方案中的一或多個或所有v、d和/或j基因區(qū)段可選自列表a2。

在希望產生抗體或抗體混合物以治療和/或預防由流感嗜血桿菌引起或介導的感染性疾病時，用于本發(fā)明的任何配置、方面、方法、實例或實施方案中的一或多個或所有v、d和/或j基因區(qū)段可選自列表a1.1。

在希望產生抗體或抗體混合物以治療和/或預防由大腸桿菌或腦膜炎奈瑟氏菌引起或介導的感染性疾病時，用于本發(fā)明的任何配置、方面、方法、實例或實施方案中的一或多個或所有v、d和/或j基因區(qū)段可選自列表a1.2。

在希望產生抗體或抗體混合物以治療和/或預防由皰疹病毒家族(如vzv或hsv)引起或介導的感染性疾病時，用于本發(fā)明的任何配置、方面、方法、實例或實施方案中的一或多個或所有v、d和/或j基因區(qū)段可選自列表a2.1。

在希望產生抗體或抗體混合物以治療和/或預防由cmv引起或介導的感染性疾病時，用于本發(fā)明的任何配置、方面、方法、實例或實施方案中的一或多個或所有v、d和/或j基因區(qū)段可選自列表a2.2。

在希望產生抗體或抗體混合物以治療和/或預防由hiv引起或介導的感染性疾病時，用于本發(fā)明的任何配置、方面、方法、實例或實施方案中的一或多個或所有v、d和/或j基因區(qū)段可選自列表a2.3。

在希望產生抗體或抗體混合物以治療和/或預防由流感病毒引起或介導的感染性疾病時，用于本發(fā)明的任何配置、方面、方法、實例或實施方案中的一或多個或所有v、d和/或j基因區(qū)段可選自列表a2.4。

任選本發(fā)明基因座中的每個vh區(qū)段均選自列表a1、a2、a1.1、a1.2、a2.1、a2.2、a2.3或a2.4。

任選本發(fā)明基因座中每個vl區(qū)段均選自列表a1、a2、a1.1、a1.2、a2.1、a2.2、a2.3或a2.4。

任選本發(fā)明基因座中每個d區(qū)段均選自列表a1、a2、a1.1、a1.2、a2.1、a2.2、a2.3或a2.4。

任選本發(fā)明基因座中每個jl區(qū)段均選自列表a1、a2、a1.1、a1.2、a2.1、a2.2、a2.3或a2.4。

對病原體及其它抗原的長hcdr3結合位點及定制基因區(qū)段

本發(fā)明的這個方面涉及脊椎動物、細胞、方法及具有相對較長hcdr3結合位點的抗體的開發(fā)。本發(fā)明還提供了其中基因組和抗體在其基因區(qū)段使用方面是定制的實施方案，以針對感染性疾病病原體抗原或者用較長hcdr3有利針對的其它抗原以結合或中和?？贵w可以在脊椎動物中通過用非病原體靶抗原如攜帶在裂縫中的需要長cdr以接觸的表位的抗原或者來自引起或涉及有害的人體疾病或病癥的病原體的抗原免疫而產生。例如是細菌或病毒病原體，靶抗原可以是細菌細胞表面抗原或者病毒表面暴露的抗原(例如包被蛋白)。此外或或者，抗原可以是從病原性細菌或病毒中釋出(例如分泌)的抗原。本發(fā)明不限于針對病原體抗原，但是也可用于針對其中長cdr3有益于結合的情況中的其它抗原(例如酶活性位點或受體裂縫)。

具有長hcdr3(根據imgt命名法具有至少20個氨基酸)的抗體已經示出有效中和各種病原體，包括hiv、流感病毒、瘧疾和非洲錐體蟲。還可以提及的是天然發(fā)生的駱駝(例如美洲鴕或駱駝)僅重鏈抗體，其攜帶長hcdr3以達到相對不能接近的表位(見例如ep0937140)。長hcdr3可形成獨特的穩(wěn)定亞結構域，具有擴展的環(huán)結構，高于抗體表面以賦予良好特異性。在一些情況中，長hcdr3自身對于表位結合和中和是足夠的(liu,letal；journalofvirology.2011.85:8467-8476，在此并入本文作參考)。長hcdr3的獨特結構使其可以結合位于病原體表面上不能接近的結構或廣泛的糖基化內的關聯(lián)(cognate)表位。在人周圍血中，有大約3.5％的幼稚b抗體或者1.9％的記憶bigg抗體含有長度超過24個氨基酸的hcdr3(briney,bsetal，參見下文所述)(briney,bsetal的圖1)。使用分析表明這些抗體優(yōu)先使用人vh1-69、d2-2、d3-3、d2-15和jh6區(qū)段(briney,bsetal的圖2-5)。所有hcdr3長度抗體中有大約20％使用jh6。然而，在具有超過24個氨基酸的hcdr3的這些抗體中，有70％使用jh6(briney,bsetal的圖2)。人vh5-51也常用于抗-hiv抗體(見gornyetal,plosone.2011；6(12):e27780.epub2011dec2。

由vh5-51/vlλ基因編碼的人抗-v3hiv-1單克隆抗體限定了保守抗原性結構，所述文獻并入本文作參考)。

補充這些觀測結果，本發(fā)明人發(fā)現(見實施例)其它選擇的人重鏈可變區(qū)基因區(qū)段(v、d、j)在轉基因非人脊椎動物中重組，產生長hcdr3(至少20個氨基酸)。

因此，如在實施例中進一步闡述，本發(fā)明人在es細胞中構建了轉基因igh基因座，其中所述基因座有意地包含選擇的人重鏈可變區(qū)基因區(qū)段(v、d、j)，其重組產生長hcdr3(至少20個氨基酸)。從所述es細胞中，本發(fā)明人產生轉基因非人脊椎動物(首次用于實驗的及用各種不同靶抗原類型-疾病病原體和人抗原性物種免疫的)，分離基于選擇的基因區(qū)段的抗體及重鏈序列以及表達這些抗體的b細胞并且產生表達基于選擇的基因區(qū)段的抗原特異性抗體的雜交瘤。

本領域需要遺傳修飾的非人動物，優(yōu)選其產生具有長hcdr3的人抗體，以及在所述抗體可針對更易于由長hcdr3針對的靶表位的情況中，可以自這種動物中選擇的抗體。長cdrh3也可以用于貫穿(penetrating)高度聚糖覆蓋的表位位點(例如病毒表位或者任何糖蛋白靶，例如見nature.2011dec14；480(7377):324-5.doi:10.1038/480324a；vaccinology:"asweetcleftinhiv'sarmour",sattentauqj，所述文獻在此并入本文作參考)，以及所述靶抗原可包含這種靶表位。

本發(fā)明提供了脊椎動物，其可人工模擬那些天然發(fā)生的人長hcdr3抗體并且可以提供抗體、重鏈和可變結構域庫集，從中可以選擇具有長hcdr3(具有長度為20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個氨基酸(根據imgt)的hcdr3)的抗體、重鏈或可變結構域。本發(fā)明提供了位于脊椎動物基因座包含的重鏈基因座中非人脊椎動物(例如小鼠或大鼠，例如內源性小鼠或大鼠)恒定區(qū)上游的人vh、d和j基因庫集的組合。這使得人基因區(qū)段在內源性或其它非脊椎動物恒定區(qū)中重組、成熟和選擇，提高了良好大小的抗體、重鏈和可變結構域庫集的開發(fā)，從中選擇長hcdr3-型結合位點。因此，在本發(fā)明的任何配置的實例中，人基因區(qū)段提供在位于非人脊椎動物(例如內源性)恒定區(qū)上游的重鏈基因座中。相似地，本發(fā)明的任何抗體均包含人可變結構域及非人脊椎動物(例如內源性)結構域。后者在選擇和分離之后可以由人恒定結構域置換。

例如，期望如下本發(fā)明的抗體(例如在本發(fā)明這個方面的脊椎動物中通過本文揭示的方法產生的)或者如此產生的抗體的拷貝或衍生物：

分離的、合成的或重組抗體，其包含具有長度為20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個氨基酸(根據imgt)的hcdr3的人重鏈可變結構域，重鏈可變結構域衍生自選自本文所述vh組的人vh基因區(qū)段與人d基因區(qū)段和人jh基因區(qū)段(任選jh6)的重組，其中所述抗體結合靶抗原；其中當與相應人種系v、d和j序列相比時所述重鏈可變結構域具有非人脊椎動物aid-模式體細胞超變(例如小鼠或大鼠aid-模式突變)和/或當與相應人種系v、d和j序列相比時具有非人(例如小鼠或大鼠)末端脫氧核苷酸轉移酶(tdt)-模式連接突變。在一個實例中，本發(fā)明的抗體具有長度為20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個氨基酸(根據imgt)的hcdr3。在一個實例中，所述抗原是引起或者參與人感染性疾病或病癥的病原體抗原，例如表1中列出的病原體。在一個實例中，所述抗體特異性結合抗原的活性位點或裂縫(例如酶活性位點或受體裂縫)。這可以例如使用技術人員已知的抗體(或者重鏈或vh結構域)與相關抗原的復合物的標準x-線晶體學確定。

可以提供小鼠aid-模式體細胞超變和/或小鼠dtd-模式突變，例如其中vh結構域是在包含小鼠aid和/或小鼠tdt(例如內源性aid或tdt)的小鼠中產生。見annu.rev.biochem.2007.76:1-22；javierm.dinoiaandmichaels.neuberger,"molecularmechanismsofantibodysomatichypermutation"(特別是圖1及在小鼠中對aid熱點的相關討論)；及curropinimmunol.1995apr；7(2):248-54,"somatichypermutation",neubergermsandmilsteinc(特別是在小鼠中關于熱點的討論)，所述文獻在此并入本文作參考。這種小鼠可以使用相應小鼠es細胞技術產生。

在一個實例中，所述抗體特異性結合hiv抗原。已知一些天然發(fā)生的人抗體中和hiv，具有相當長的hcdr3(20個氨基酸或更多個氨基酸，根據imgt；見bredenetal,plosone.2011mar30；6(3):e16857；"comparisonofantibodyrepertoiresproducedbyhiv-1infection,otherchronicandacuteinfections,andsystemicautoimmunedisease"(并入本文作參考)-vh1-69優(yōu)選用于長hcdr3)。也見plosone.2012；7(5):e36750.epub2012may9；"humanperipheralbloodantibodieswithlonghcdr3sareestablishedprimarilyatoriginalrecombinationusingalimitedsubsetofgermlinegenes"；brineybseal(并入本文作參考)。因此，希望提供本發(fā)明的抗體，其具有相似長度的hcdr3長度。在一個實例中，提供本發(fā)明的抗體治療和/或預防人體中hiv感染例如慢性hiv感染。本發(fā)明還提供了治療和/或預防人體中hiv感染例如慢性hiv感染的方法，所述方法包括給予藥物可接受劑量的本發(fā)明抗體。所述劑量可以分成一或多個給予等份，例如在一段時間內根據醫(yī)學確定的方案給予，這些為技術人員所能確定。

在一個實例中，所述抗體特異性結合流感嗜血桿菌b型多糖。在一個實例中，提供本發(fā)明的抗體治療和/或預防人體中流感嗜血桿菌感染例如慢性流感嗜血桿菌感染。本發(fā)明還提供了治療和/或預防人體中流感嗜血桿菌感染如慢性流感嗜血桿菌感染的方法，所述方法包括給予藥物可接受劑量的本發(fā)明抗體。所述劑量可以分成一或多個給予等份，例如在一段時間內根據醫(yī)學確定的方案給予，這些為技術人員所能確定。

在一個實例中，所述抗體特異性結合輪狀病毒抗原(例如蛋白6或7)。在一個實例中，提供本發(fā)明的抗體治療和/或預防人體中輪狀病毒感染例如慢性輪狀病毒感染。本發(fā)明還提供了治療和/或預防人體中輪狀病毒感染如慢性輪狀病毒感染的方法，所述方法包括給予藥物可接受劑量的本發(fā)明抗體。所述劑量可以分成一或多個給予等份，例如在一段時間內根據醫(yī)學確定的方案給予，這些為技術人員所能確定。

在一個實例中，所述抗體特異性結合巨細胞病毒抗原(例如巨細胞病毒gb抗原)。在一個實例中，提供本發(fā)明的抗體治療和/或預防人體中巨細胞病毒感染如慢性巨細胞病毒感染。本發(fā)明還提供了治療和/或預防人體中巨細胞病毒感染如慢性巨細胞病毒感染的方法，所述方法包括給予藥物可接受劑量的本發(fā)明抗體。所述劑量可以分成一或多個給予等份，例如在一段時間內根據醫(yī)學確定的方案給予，這些為技術人員所能確定。

本發(fā)明還提供了表達這種抗體的脊椎動物或細胞；因此本發(fā)明提供了非人脊椎動物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎動物細胞(例如小鼠細胞或大鼠細胞)，其基因組包含人免疫球蛋白vh基因區(qū)段庫集，其偏向于選自本文所述vh組的一個、多個或所有人vh基因區(qū)段。

本發(fā)明還提供了分離結合hiv抗原、流感嗜血桿菌b型多糖、巨細胞病毒抗原或者輪狀病毒抗原的抗體的方法，所述方法包括：

(a)提供本發(fā)明的人vh偏向的脊椎動物；

(b)用所述hiv抗原、流感嗜血桿菌b型多糖、巨細胞病毒抗原或輪狀病毒抗原免疫所述脊椎動物；

(c)從所述脊椎動物取b淋巴細胞，選擇表達結合所述抗原的抗體的一或多個b淋巴細胞；

(d)任選使所述選擇的b淋巴細胞或其后代永生化，任選通過從中產生雜交瘤而進行；及

(e)分離由所述b淋巴細胞表達的抗體(例如，以及igg型抗體)，其中所述抗體具有長度為20個或更多個氨基酸的hcdr3。

任選地，所述方法進一步包括從所述b淋巴細胞分離編碼結合所述抗原的所述抗體的核酸的步驟；任選用編碼人或人源化重鏈恒定區(qū)的核苷酸序列交換所述抗體的重鏈恒定區(qū)核苷酸序列及任選親和性成熟所述抗體的可變區(qū)；及任選將所述核酸插入表達載體及任選宿主中。

任選地，所述方法進一步包括制備通過所述方法產生的抗體的拷貝、突變體或衍生物(例如人源化形式)。

本發(fā)明的這個方面還提供了：

包含抗-hiv抗體的藥物組合物，用以治療和/或預防人體中(例如在嬰兒中)hiv。

包含抗-流感嗜血桿菌b型多糖抗體的藥物組合物，用于治療和/或預防人體中(例如在嬰兒中)流感嗜血桿菌。

包含抗-輪狀病毒抗體的藥物組合物，用于治療和/或預防人體中(例如在嬰兒中)輪狀病毒。

包含抗-巨細胞病毒抗體的藥物組合物，用于治療和/或預防人體中(例如在嬰兒中)巨細胞病毒。

本發(fā)明還提供了產生這種抗體的方法(例如上述(i)及下列任一實施方案)，通過用靶抗原免疫本發(fā)明的脊椎動物及從所述脊椎動物分離抗體而進行，任選也產生所述抗體的拷貝或衍生物。在進一步的步驟中，從所述脊椎動物分離能表達所述抗體的b細胞。在進一步的步驟中，從所述脊椎動物分離編碼所述抗體(或其vh結構域)的核酸(例如從分離自所述脊椎動物的b細胞中pcr克隆的核酸)。

在一個實例中，本發(fā)明的抗體是中和抗體。在一個實例中，本發(fā)明的抗體具有長度為20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個或更多個氨基酸的hcdr3(根據imgt)。在一個實例中，本發(fā)明的抗體具有長度為20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個氨基酸的hcdr3(根據imgt)。在一個實例中，本發(fā)明的抗體分離自非人脊椎動物(例如小鼠或大鼠)，例如本發(fā)明的脊椎動物；或者所述抗體是其拷貝或衍生物(例如人源化形式)。在一個實例中，本發(fā)明的抗體具有非人脊椎動物恒定區(qū)(例如小鼠或大鼠恒定區(qū))；這些可以使用標準重組dna技術用人恒定區(qū)置換，因此本發(fā)明還提供了人形式的上述抗體，其中所述人抗體包含人可變區(qū)和恒定區(qū)，其中所述可變區(qū)結合所述抗原。在一個實例中，本發(fā)明的抗體具有λ-型人輕鏈可變結構域。在另一實例中，本發(fā)明的抗體具有κ-型人輕鏈可變結構域。

抗體競爭可以通過例如標準的elisa或表面等離子共振(spr；例如通過競爭性biacore^tm或proteon)技術確定。

本發(fā)明還提供了如下實施方案(以編號條款列舉)：

d偏向(bias)

1.非人脊椎動物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎動物細胞(例如小鼠細胞或大鼠細胞)，其基因組包含人免疫球蛋白d基因區(qū)段庫集，其偏向于人d2和/或d3家族或者偏向于選自d1-26、d2-2、d3-9、d3-10、d3-22、d4-17、d6-13和d6-19的一個、多個或者所有人d基因區(qū)段。

例如，所述庫集僅由選自d2和/或d3家族的人d基因區(qū)段組成。

任選地，所述庫集偏向于一或多個人d2-2、d2-15、d3-3、d3-9、d3-10和d3-22，或者所述庫集由一個、多個或者所有這些d基因區(qū)段組成。這些基因區(qū)段產生長hcdr3長度(例如見表2及本文引用的參考文獻)。

例如，所述庫集偏向于一或多個人d2-2*02、d3-9*01、d3-10*01和d3-22*01，或者所述庫集由一個、多個或所有這些d基因區(qū)段組成。

例如，所述庫集偏向于一或多個人d2-2*02、d3-9*01和d3-10*01，或者所述庫集由一個、多個或所有這些d基因區(qū)段組成。

例如，所述庫集偏向于d3-9*01和d3-10*01，或者由一個、多個或所有這些d基因區(qū)段組成。

任選地，所述庫集由一個、多個或所有人d1-26、d2-2、d3-9、d3-10、d3-22、d4-17、d6-13和d6-19組成。這些基因區(qū)段產生長hcdr3長度(例如見表2)。

任選地，所述庫集偏向于一或多個人d1-26*01、d2-2*02、d3-9*01、d3-10*01、d3-22*01、d4-17*01、d6-13*01和d6-19*01，或者所述庫集由一個、多個或所有這些d基因區(qū)段組成。

任選地，庫集偏向于一或多個人d2-2、d3-9、d3-10、d3-22、d4-17、d6-13和d6-19，或者所述庫集由一個、多個或所有這些d基因區(qū)段組成。任選地，所述庫集偏向于一或多個人d2-2*02、d3-9*01、d3-10*01、d3-22*01、d4-17*01、d6-13*01和d6-19*01，或者所述庫集由一個、多個或所有這些d基因區(qū)段組成。這些基因區(qū)段在首次用于實驗的庫集中產生長hcdr3長度(例如見表2)。

任選地，所述庫集偏向于一或多個人d1-26、d2-2、d3-10和d6-19，或者所述庫集由一個、多個或所有這些d基因區(qū)段組成。任選地，所述庫集偏向于一或多個人d1-26*01、d2-2*02、d3-10*01和d6-19*01，或者所述庫集由一個、多個或所有這些d基因區(qū)段組成。這些基因區(qū)段在免疫的庫集中產生長hcdr3長度(例如見表2)。

任選地，所述庫集偏向于一或多個人d2-2、d3-9和d3-10，或者所述庫集由一個、多個或所有這些d基因區(qū)段組成。任選地，所述庫集偏向于一或多個人d2-2*02、d3-9*01和d3-10*01，或者所述庫集由一個、多個或所有這些d基因區(qū)段組成。這些基因區(qū)段在抗原特異性庫集中產生長hcdr3長度(例如見表2)。

imgt命名法用于所有基因區(qū)段。

在本說明書中，genbank是指genbank版本號185.0或191.0；1000genomes數據庫是phase1,releasev3,16^thmarch2012；ensembl數據庫是集合的grch37.p8(10/04/2012)；imgt數據庫可在www.imgt.org獲得。本文明確提及的所有vh基因區(qū)段的序列以其整體在本文揭示(可能包括在條款中組合條款所述的本發(fā)明的任何方面)，這種序列是在imgt和1000genomes數據庫中的那些序列。

在一個實施方案中，所述基因組包含igh基因座，其包含靶向插入的所述人d基因區(qū)段。在一個實例中，igh基因座包含(5’至3’方向)一或多個人vh基因區(qū)段、所述d基因區(qū)段庫集、一或多個人jh基因區(qū)段及恒定區(qū)(例如其中恒定區(qū)是人恒定區(qū)或者非人(例如內源性如小鼠或大鼠)恒定區(qū))。

在另一個實施方案中，所述基因組包含隨機插入其中的所述人d基因區(qū)段。這可以例如通過yacs將人dna荷載(borne)摻入es細胞的基因組中而實現(隨后任選根據標準方法從中產生非人脊椎動物)。

任選地，所述人d基因區(qū)段庫集進一步包含不超過5個額外的人d基因區(qū)段，例如所述庫集包括1、2、3、4或5個額外的人d基因區(qū)段。

2.條款1的脊椎動物或細胞，其中所述d基因區(qū)段庫集由或者基本由選自d1-26、d2-2、d3-9、d3-10、d3-22、d4-17、d6-13和d6-19的1個、2個或者3個人基因區(qū)段組成。

3.條款1或2的脊椎動物或細胞，其中所述基因組包含未重排的免疫球蛋白重鏈基因座，其包含(5’至3’方向)人vh、d和jh基因區(qū)段，及條款1所述人d基因區(qū)段與所述vh基因區(qū)段由不超過4個其它d基因區(qū)段(例如無d基因區(qū)段)間隔開。

這提供了偏向，其中近端d基因區(qū)段(那些更3’端的，即更接近恒定區(qū))與遠端那些區(qū)段(即5’端或更遠離恒定區(qū))相比可能是更頻繁使用的。

4.前述任何條款的脊椎動物或細胞，其中所述基因組包含未重排的免疫球蛋白重鏈基因座，其包含所述人d基因區(qū)段，及在所述基因座中所述人d基因區(qū)段之間無其它d基因區(qū)段。

這是偏向d基因區(qū)段庫集的另一種方式。因此，希望的d以串聯(lián)形式提供，目的在于促進重組使用。

5.前述任何條款的脊椎動物或細胞，其中所述基因組包含選自d1-26、d2-2、d2-15、d3-3、d3-9、d3-10、d3-22、d4-17、d6-13和d6-19的人d基因區(qū)段的三個或更多個拷貝。

例如，所述基因組包含選自d1-26、d2-2、d3-9、d3-10、d3-22、d4-17、d6-13和d6-19的人d基因區(qū)段的三個或更多個拷貝。

這是偏向d基因區(qū)段的庫集的另一方式。

6.條款5的脊椎動物或細胞，其中所述基因組包含選自d1-26、d2-2、d2-15、d3-3、d3-9、d3-10、d3-22、d4-17、d6-13和d6-19的第一個和第二個人d基因區(qū)段，其中第一個d基因區(qū)段以三或更多個拷貝存在，及其中第二個d基因區(qū)段以三或更多個拷貝存在。

例如，第一個和第二個基因區(qū)段選自d1-26、d2-2、d3-9、d3-10、d3-22、d4-17、d6-13和d6-19。

可進行本文描述的各種基因區(qū)段偏向技術，使用常規(guī)dna操縱技術，構建本發(fā)明的轉基因脊椎動物或細胞，所述技術(例如重組工程和重組dna技術)為技術人員已知。例如，可以使用這些技術構建bac，其中提供希望的人基因區(qū)段組合，這些bac可導入es細胞以將所述人基因區(qū)段摻入其基因組(例如通過靶向插入ig基因座中)。es細胞可用于根據標準方法產生轉基因脊椎動物，細胞(例如b細胞)可以分離自其中基因組如本發(fā)明所述的這些脊椎動物。

在一個實施方案中，偏向的d基因區(qū)段選自變體的imgt數據庫或者1000genomes數據庫。

7.前述任何條款的脊椎動物或細胞，其中d基因區(qū)段選自d2-2*02、d3-9*01、d3-10*01和d3-22*01，或者選自d1-26*01、d2-2*02、d3-9*01、d3-10*01、d3-22*01、d4-17*01、d6-13*01和d6-19*01。

vh偏向

8.非人脊椎動物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎動物細胞(例如小鼠細胞或大鼠細胞)，任選根據前述任何條款，其基因組包含人免疫球蛋白vh基因區(qū)段庫集，其偏向于選自如下一組中的一個、多個或所有基因區(qū)段：vh1-2、vh1-3、vh1-8、vh1-18、vh5-51、vh1-69、vh2-5、vh3-7、vh3-9、vh3-11、vh3-13、vh3-20、vh3-21、vh3-23、vh4-4、vh6-1和vh7-4-1。

這些基因區(qū)段產生長hcdr3長度(見表2及本文引用的參考文獻)。

例如，vh庫集偏向于一個、多個或所有vh1-2、vh1-3、vh1-8、vh1-18、vh2-5、vh3-7、vh3-9、vh3-11、vh3-13、vh3-20、vh3-21、vh3-23、vh4-4、vh6-1和vh7-4-1。這些基因區(qū)段產生長hcdr3長度(見表2)，或者所述庫集由一個、多個或所有這些vh基因區(qū)段組成。例如，所述vh庫集偏向于一個、多個或所有vh1-2*02、vh1-3*01、vh1-8*01、vh1-18*01、vh2-5*10、vh3-7*01、vh3-9*01、vh3-11*01、vh3-13*01、vh3-21*03、vh3-23*04、vh4-4*02、vh6-1*01和vh7-4-1*01，或者所述庫集由一個、多個或所有這些vh基因區(qū)段組成。

例如，所述vh庫集偏向于一個、多個或所有vh1-2*02、vh1-8*01、vh1-18*01、vh1-3*01、vh2-5*10、vh3-7*01、vh3-9*01、vh3-13*01、vh3-21*03、vh3-23*04、vh4-4*02、vh6-1*01和vh7-4-1*01，或者所述庫集由一個、多個或所有這些vh基因區(qū)段組成。這些基因區(qū)段在首次用于實驗的庫集中產生長hcdr3長度(見表2)。

例如，所述vh庫集偏向于一個、多個或所有vh4-4*02、vh3-11*01和vh3-7*01，或者所述庫集由一個、多個或所有這些vh基因區(qū)段組成。這些基因區(qū)段在免疫的庫集中產生長hcdr3長度(見表2)。

例如，所述vh庫集偏向于一個、多個或所有vh1-3*01、vh1-8*01、vh3-7*01、vh3-9*01、vh3-11*01和vh4-4*02，或者所述庫集由一個、多個或所有這些vh基因區(qū)段組成。這些基因區(qū)段在抗原特異性庫集中產生長hcdr3長度(見表2)。

任選地，人vh基因區(qū)段庫集進一步包含不超過5個額外的人vh基因區(qū)段，例如所述庫集包括1、2、3、4或5個額外的人vh基因區(qū)段。

在一個實施方案中，所述基因組包含igh基因座，其包含靶向插入的所述人vh基因區(qū)段。在一個實例中，所述igh基因座包含(5’至3’方向)所述vh基因區(qū)段、一或多個人d基因區(qū)段、一或多個人jh基因區(qū)段及恒定區(qū)(例如其中所述恒定區(qū)是人恒定區(qū)或者非人(例如內源性如小鼠或大鼠)恒定區(qū))。

在另一個實施方案中，所述基因組包含隨機插入其中的所述人vh基因區(qū)段。這可以通過例如通過yacs將人dna荷載摻入es細胞的基因組中而實現(隨后任選通過標準方法從中產生非人脊椎動物)。

9.條款8的脊椎動物或細胞，其中所述vh基因區(qū)段庫集基本上由選自如下一組中的一個、兩個或三個人基因區(qū)段組成：vh1-2、vh1-3、vh1-8、vh1-18、vh5-51、vh1-69、vh2-5、vh3-7、vh3-9、vh3-11、vh3-13、vh3-20、vh3-21、vh3-23、vh4-4、vh6-1和vh7-4-1。

例如，所述vh基因區(qū)段庫集基本上由選自如下一組的一個、兩個或三個人基因區(qū)段組成：vh1-2*02、vh1-3*01、vh1-8*01、vh1-18*01、vh2-5*10、vh3-7*01、vh3-9*01、vh3-11*01、vh3-13*01、vh3-21*03、vh3-23*04、vh4-4*02、vh6-1*01和vh7-4-1*01。

10.條款8或9的脊椎動物或細胞，其中所述基因組包含未重排的免疫球蛋白重鏈基因座，其包含(5’至3’方向)人vh、d和jh基因區(qū)段，所述人vh基因區(qū)段與d基因區(qū)段由不超過4個其它vh基因區(qū)段(例如無vh基因區(qū)段)間隔開。

這提供了偏向，其中近端vh基因區(qū)段(更3’端的那些區(qū)段，即更接近恒定區(qū))與遠端那些區(qū)段(即5’端或者進一步遠離恒定區(qū))相比更可能頻繁使用。

11.條款8-10任一項的脊椎動物或細胞，其中所述基因組包含未重排的免疫球蛋白重鏈基因座，其包含所述人vh基因區(qū)段，及在所述基因座中所述人vh基因區(qū)段之間無其它vh基因區(qū)段。

這是偏向vh基因區(qū)段的庫集的另一方式。

12.條款8-11任一項的脊椎動物或細胞，其中所述基因組包含選自如下一組的人vh基因區(qū)段的三個或更多個拷貝：vh1-2、vh1-3、vh1-8、vh1-18、vh5-51、vh1-69、vh2-5、vh3-7、vh3-9、vh3-11、vh3-13、vh3-20、vh3-21、vh3-23、vh4-4、vh6-1和vh7-4-1。

例如，所述基因組包含選自如下一組的人vh基因區(qū)段的三個或更多個拷貝：vh1-2*02、vh1-3*01、vh1-8*01、vh1-18*01、vh2-5*10、vh3-7*01、vh3-9*01、vh3-11*01、vh3-13*01、vh3-21*03、vh3-23*04、vh4-4*02、vh6-1*01和vh7-4-1*01。

這是偏向vh基因區(qū)段的庫集的另一方式。

13.條款12的脊椎動物或細胞，其中所述基因組包含選自vh1-2、vh1-3、vh1-8、vh1-18、vh5-51、vh1-69、vh2-5、vh3-7、vh3-9、vh3-11、vh3-13、vh3-20、vh3-21、vh3-23、vh4-4、vh6-1和vh7-4-1的第一個和第二個人vh基因區(qū)段，當第一個vh基因區(qū)段以三個或更多個拷貝存在時，及其中第二個vh基因區(qū)段以三個或更多個拷貝存在。

例如，所述基因組包含選自如下一組的第一個和第二個人vh基因區(qū)段：vh1-2*02、vh1-3*01、vh1-8*01、vh1-18*01、vh2-5*10、vh3-7*01、vh3-9*01、vh3-11*01、vh3-13*01、vh3-21*03、vh3-23*04、vh4-4*02、vh6-1*01和vh7-4-1*01，當第一個vh基因區(qū)段以三個或更多個拷貝存在時，其中第二個vh基因區(qū)段以三個或更多個拷貝存在。

在一個實施方案中，所有或者基本所有的vh基因區(qū)段均以三個或更多個拷貝存在。

可以進行本文描述的各種基因區(qū)段偏向技術，使用常規(guī)dna操縱技術構建本發(fā)明的轉基因脊椎動物或細胞，所述技術(例如重組工程和重組dna技術)為技術人員已知。例如，bac可以使用這些技術構建，其中提供希望的人基因區(qū)段組合，這些bac可以導入es細胞中以將人基因區(qū)段摻入其基因組中(例如通過靶向插入ig基因座中)。所述es細胞可用于根據標準方法產生轉基因脊椎動物，細胞(例如b細胞)可分離自其中所述基因組如本發(fā)明所述的這些動物。

在一個實施方案中，偏向的d基因區(qū)段選自變體的imgt數據庫或者1000genomes數據庫。

14.條款8-13任一項的脊椎動物或細胞，其中vh基因區(qū)段選自如下一組中：vh1-2*02、vh1-3*01、vh1-8*01、vh1-18*01、vh2-5*10、vh3-7*01、vh3-9*01、vh3-11*01、vh3-13*01、vh3-21*03、vh3-23*04、vh4-4*02、vh6-1*01和vh7-4-1*01。

在一個實施方案中，所述基因組包含人免疫球蛋白vh基因區(qū)段庫集，其偏向于vh1-69。

在一個實施方案中，所述人免疫球蛋白vh基因區(qū)段庫集基本上由一或多個人vh1-69基因區(qū)段組成。

所述基因區(qū)段提供在一或多個免疫球蛋白基因座中。例如，所述基因區(qū)段庫集(d和/或vh)提供在這兩個igh基因座中(即在純合狀態(tài))。

15.條款8-16任一項的脊椎動物或細胞，其包含具有選自上述組中的vh基因區(qū)段的兩或更多個拷貝的免疫球蛋白重鏈基因座。

因此，至少一個所述拷貝與在人體中與人恒定區(qū)的種系距離相比更接近該基因座的恒定區(qū)。目的是通過偏向在同一基因座上提供多于一個拷貝。至少一個拷貝也更靠近(更近端于)恒定區(qū)及j-c內含子(其包含調節(jié)元件如emu增強子區(qū))，這可有利于所述基因區(qū)段的使用，因此有助于希望的偏向。

任選地，所述基因組對于所述重鏈基因座是純合的。

任選地，基因區(qū)段的兩或更多個拷貝是相同的(例如所有vh1-69*01，使用imgt命名法)。在另一實施例中，拷貝是彼此的變體，例如天然發(fā)生的人變體?；蛘撸铣傻淖凅w可以與或不與天然發(fā)生的變體一起使用。

在本發(fā)明的任何實施方案中，所述脊椎動物是首次用于實驗的或者用靶抗原免疫的。

16.任何條款的脊椎動物或細胞，其中所述基因組包含由一或多個人jh6基因區(qū)段組成的人jh基因區(qū)段庫集。

這偏向jh庫集以產生長hcdr3，因為這是最長的天然發(fā)生的人jh基因區(qū)段類型，通常見于具有長hcdr3的天然發(fā)生的人抗體中。

例如，所述庫集包含兩個或更多個不同的jh6變體。在一個實例中，所述庫集包含兩個或更多個jh6*02變體(imgt命名法)。

17.前述任何條款的脊椎動物和細胞，其中所述基因組包含人免疫球蛋白jh基因區(qū)段庫集，其偏向于jh6，任選jh6*02。

18.條款17的脊椎動物或細胞，其中所述jh基因區(qū)段庫集由或者基本上由三個或更多個人jh6基因區(qū)段組成。

19.前述任何條款的脊椎動物或細胞，其中每個所述人基因區(qū)段的序列均是人種系基因區(qū)段序列。

20.前述任何條款的脊椎動物或細胞，其中一個、多個或所有選擇的基因區(qū)段在基因組中作為兩個或更多個拷貝存在，所述拷貝是彼此的變體。

因此所述基因組的一個、多個或所有人v、d和jh基因區(qū)段以兩或更多個變體形式存在，如天然發(fā)生的人變體，例如見于1000genomes數據庫和/或imgt數據庫中的變體。在另一實例中，一或多個變體可以是合成變體。

21.前述任何條款的脊椎動物或細胞，其中所述人基因區(qū)段是由純合的免疫球蛋白重鏈基因座提供。

在一個實例中，無其它(非人)活性重鏈vh、d或jh基因區(qū)段存在于基因組的重鏈基因座中。此外，在一個實例中，無活性非人輕鏈vl或jl基因區(qū)段存在于基因組中。

這可用于保證內源性(非人)可變區(qū)表達被失活。因此，由所述脊椎動物或細胞產生的所有重鏈將具有人可變區(qū)，其可用于產生給予人體的藥物。

22.非人脊椎動物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎動物細胞(例如小鼠細胞或大鼠細胞)，其基因組包含人免疫球蛋白vh基因區(qū)段庫集、一或多個人d基因區(qū)段及一或多個人jh基因區(qū)段，其中所述vh庫集不包含選自如下一組的一個、多個或所有vh基因區(qū)段：vh1-2、vh1-3、vh1-8、vh1-18、vh5-51、vh1-69、vh2-5、vh3-7、vh3-9、vh3-11、vh3-13、vh3-20、vh3-21、vh3-23、vh4-4、vh6-1和vh7-4-1。

23.非人脊椎動物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎動物細胞(例如小鼠細胞或大鼠細胞)，其基因組包含人免疫球蛋白d基因區(qū)段庫集、一或多個人vh基因區(qū)段及一或多個人jh基因區(qū)段，其中所述d庫集不包含選自如下一組的一個、多個或所有d基因區(qū)段：d1-26、d2-2、d3-9、d3-10、d3-22、d4-17、d6-13和d6-19。

例如本領域已經觀測到某些人基因使用可以控制對感染性疾病病原體抗原或者其它抗原的免疫應答。雖然這可產生許多特異性抗體，典型地這些抗體不是中和抗體，及因此免疫應答相對無效。這可以例如在抗原是由病原體表達的誘捕抗原的情況中發(fā)生。本發(fā)明的其中特異性基因區(qū)段被省略的實施方案可用于避免某些人基因區(qū)段如從基因組中省略那些基因區(qū)段的優(yōu)勢支配。以此方式，所述基因組人基因區(qū)段庫集被偏向遠離優(yōu)勢支配，這使得剩余的人基因區(qū)段序列空間的更好使用和取樣，從而提供產生在天然狀態(tài)未正常產生的抗體的機會。抗原特異性抗體可以選自具有這種基因組的脊椎動物和細胞。在一些實例中，這可產生中和抗體。

有利地是包括多個不同的人vh基因區(qū)段，組成人vh基因區(qū)段庫集。這提供了重排的人可變區(qū)的良好多樣性，從中選擇先導抗體。例如可以包括其他的人vh基因區(qū)段的完整的功能性庫集。為此，在一個實例中，所述人vh基因區(qū)段庫集包含多個人vh基因區(qū)段，例如至少7、10、15、20、15、30、35、40或45個不同的人vh基因區(qū)段。這可以例如使用攜帶包含vh基因區(qū)段的未重排的人可變區(qū)dna的序列的bac通過同源重組實現和/或使用srmce將來自系列bac的一些這種dna序列插入位于非人脊椎動物es細胞(例如小鼠或大鼠es細胞)的基因組中恒定區(qū)上游的內源性重鏈基因座中，隨后從這種細胞產生一或多個后代脊椎動物(及任選繁殖為重鏈基因座純合性)。在一個實施方案中，插入人dna，其包括位于上游和下游的第一人vh(例如vh1-69和/或vh1-2)及側翼vh基因區(qū)段。在第二種es細胞基因組操縱中，第一vh自基因組中缺失，例如使用本領域已知的標準同源重組技術進行。以此方式，在野生型人種系基因組中通常位于缺失的基因區(qū)段的上游和/或下游的一或多個vh基因區(qū)段被保留，以便其可以用于有助于隨后的重排的人v區(qū)庫集，用于選擇先導抗體。在另一實例中，使用已經省略(例如通過在大腸桿菌中使用bac的重組工程缺失這種序列，如本領域已知)第一vh的dna序列進行人dna的初始插入?？梢允褂孟嗨萍夹g(及合適的bac)省略人d和/或j基因區(qū)段。

因此，在一個實施方案中，通常在野生型種系人基因組中省略的人vh基因區(qū)段(或者根據其它實施方案省略的d或j)的上游和/或下游的vh基因區(qū)段包含在本發(fā)明的脊椎動物或細胞中。例如，本發(fā)明中基因組的人vh基因區(qū)段庫集不包含vh1-69，但是包含選自vh2-10、vh3-72、vh3-73和vh3-74的一個、兩個、三個或四個人vh基因區(qū)段。這些是緊鄰位于野生型人種系重鏈基因座中vh1-69的上游的基因區(qū)段(見imgt)。例如，另外或或者，本發(fā)明基因組中人vh基因區(qū)段庫集不包含vh1-69，但是包含選自vh3-66、vh3-64、vh4-61、vh4-59、vh1-58、vh3-53、vh3-49、vh3-48、vh1-46和vh1-45的一個、兩個、三個、四個或更多個(或所有)人vh基因區(qū)段。這些是在野生型人種系重鏈基因座中vh1-69緊鄰上游的基因區(qū)段(見imgt)。此外或或者，本發(fā)明基因組中人vh基因區(qū)段庫集不包含vh1-69，但是包含選自vh2-5、7-41、4-4、1-3、1-2和6-1的一個、兩個、三個、四個或更多個(或者所有)人vh基因區(qū)段。此外或或者，本發(fā)明基因組中人vh基因區(qū)段庫集不包含vh1-69，但是包含選自vh2-5、7-41、4-4、1-3、1-2、6-1、3-7、1-8、3-9、3-11和3-13的1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多個(或者所有)人vh基因區(qū)段。此外或或者，本發(fā)明基因組中人vh基因區(qū)段庫集不包含vh1-69，但是包含選自vh2-5、7-41、4-4、13、1-2、6-1、3-7、1-8、3-9、3-11、3-13、3-15、1-18、3-20、3-21、3-23、1-24和2-26的1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個或更多個(或者所有)人vh基因區(qū)段。此外或或者，本發(fā)明基因組中人vh基因區(qū)段庫集不包含vh1-69，但是包含vh6-1(其常用于人免疫應答，在野生型人種系重鏈基因座中vh6-1最接近恒定區(qū))和/或vh3-23(其常用于人免疫應答)。在實施方案中(例如產生vh、重鏈或抗體以治療和/或預防人體中感染性疾病如hiv感染)，h1-2在基因組或基因座中被省略。在這種情況中，在野生型種系人igh基因座(例如見imgt)中vh1-2的緊鄰5’和3’端的一個、兩個、三個或所有人vh基因區(qū)段包含在所述基因組中，如由位于人d和jh基因區(qū)段和恒定區(qū)上游的相同igh基因座包含。

24.條款22或23的脊椎動物或細胞，其中所述基因組包含人jh基因區(qū)段庫集，其不包含jh6。

jh偏向

25.非人脊椎動物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎動物細胞(例如小鼠細胞或大鼠細胞)，其基因組包含人免疫球蛋白jh基因區(qū)段庫集，其偏向于人jh6。

在一個實例中，所述庫集偏向于人jh6*02(imgt命名法)。

因此，本發(fā)明人基于如下選擇人jh6*02：

(i)含有yyg和yygxdx基序，其在幾個脊椎動物物種中是保守的；

(ii)提供比其它人jh6變體少一個tac密碼子(使終止密碼子危險的aid熱點)及選擇代替保持yyg和yygxdx基序的密碼子；

(iii)在hcdr3/fw4連接中避免ggcaaid熱點；及

(iv)jh6*02變體在人中共同出現(及因此保守和可接受性)。

26.條款25的脊椎動物或細胞，其中所述基因組包含未重排的免疫球蛋白重鏈基因座，其包含多個人jh6基因區(qū)段；任選其中所述基因組對于所述基因座是純合的。

在一個實例中，所述多個包括或者由多個jh6*02基因區(qū)段組成。

27.條款26的脊椎動物或細胞，其中所述重鏈基因座包含(5’至3’順序)人vh、d和jh基因區(qū)段，所述jh6基因區(qū)段與d基因區(qū)段由不超過兩個其它jh基因區(qū)段間隔開。

28.條款25、26或27的脊椎動物或細胞，其中在所述基因座中所述人jh6基因區(qū)段之間無其它jh基因區(qū)段。

29.非人脊椎動物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎動物細胞(例如小鼠細胞或大鼠細胞)，其基因組包含人免疫球蛋白jh基因區(qū)段庫集，其由一或多個人jh6基因區(qū)段組成。

在一個實例中，所有基因區(qū)段均是jh6*02基因區(qū)段。

30.條款25-29任一項的脊椎動物或細胞，其中所有所述基因區(qū)段均是人種系基因區(qū)段。

31.條款25-30任一項的脊椎動物或細胞，其包含不同的變體jh6基因區(qū)段。

在一個實例中，所述變體均是天然發(fā)生的(例如呈現在imgt或1000genome數據庫中)。在另一實例中，一或多個變體是合成的。

32.條款25-31任一項的脊椎動物或細胞，其中所述基因區(qū)段是由純合的免疫球蛋白重鏈基因座提供。

在一個實施方案中，偏向的jh基因區(qū)段選自變體的imgt數據庫或者1000genomes數據庫。

33.單克隆或多克隆抗體組合物或者產生這種組合物的抗體生產細胞群，其中所述組合物或細胞群是通過用抗原免疫任何前述條款的至少一種脊椎動物而制備的，其中所述抗體具有人重鏈可變區(qū)，當與相應人種系v、d和j序列相比時其包含非人脊椎動物aid-模式體細胞超變(例如小鼠或大鼠aid-模式突變)和/或當與相應人種系v、d和j序列相比時其包含非人(例如小鼠或大鼠)末端脫氧核苷酸轉移酶(tdt)-模式連接突變；其中所述組合物包含至少一種抗原特異性抗體，其具有長度為至少20個氨基酸的hcdr3(根據imgt)。

正如本領域技術人員所顯而易見，aid和tdt突變可以使用生物信息學分析確定，以發(fā)現相應于指定可變結構域序列的最接近匹配的人種系基因區(qū)段，排列序列并確定差異。aid具有已知的突變熱點(例如見annu.rev.biochem.2007.76:1-22；javierm.dinoiaandmichaels.neuberger,"molecularmechanismsofantibodysomatichypermutation"(特別是圖1及在小鼠中相關于aid熱點的相關論述)；及curropinimmunol.1995apr；7(2):248-54,"somatichypermutation",neubergermsandmilsteinc(特別是在小鼠中關于熱點的論述)，所述文獻在此并入本文作參考)。通過進行標準生物信息學分析，可以確定tdt突變(例如提供連接突變和多樣性)，這些為技術人員所熟知。

相應的人種系v、d和j序列可根據例如imgt數據庫或1000genomes數據庫。

例如，hcdr3長度為至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或者30個氨基酸。

例如，hcdr3長度為20-23或者24-30個氨基酸，例如28-30個氨基酸。

例如，所述細胞是b細胞(例如永生化b細胞)或者雜交瘤。

任選地，本發(fā)明任何方面的抗體均包含人輕鏈可變區(qū)。例如，當與相應人種系v、d和j序列相比時人輕鏈可變區(qū)具有非人脊椎動物aid模式體細胞超變(例如小鼠或大鼠aid-模式突變)和/或當與相應人種系v、d和j序列相比時其包含非人(例如小鼠或大鼠)末端脫氧核苷酸轉移酶(tdt)-模式連接突變。

34.特異性結合抗原的分離的抗體，所述抗體包含人重鏈可變區(qū)和非人恒定區(qū)，其中可變區(qū)衍生自(i)選自條款8中列舉的組中的人vh基因區(qū)段與(ii)選自條款1中列舉的組中的人d基因區(qū)段及與人jh基因區(qū)段(任選jh6)在非人脊椎動物中的重組；其中所述抗體具有長度為至少20個氨基酸的hcdr3(根據imgt)；當與相應人種系v、d和j序列相比時其包含非人脊椎動物aid-模式體細胞超變(例如小鼠或大鼠aid-模式突變)和/或當與相應人種系v、d和j序列相比時其包含非人(例如小鼠或大鼠)末端脫氧核苷酸轉移酶(tdt)-模式連接突變。

例如，所述vh選自如下一組中：vh1-2*02、vh1-3*01、vh1-8*01、vh1-18*01、vh2-5*10、vh3-7*01、vh3-9*01、vh3-11*01、vh3-13*01、vh3-21*03、vh3-23*04、vh4-4*02、vh6-1*01和vh7-4-1*01，和/或

d選自如下一組中：

d2-2*02、d3-9*01、d3-10*01和d3-22*01，或者

d2-2*02、d3-9*01和d3-10*01，或者

d3-9*01和d3-10*01，或者

d1-26、d2-2、d3-9、d3-10、d3-22、d4-17、d6-13和d6-19，或者

d1-26*01、d2-2*02、d3-9*01、d3-10*01、d3-22*01、d4-17*01、d6-13*01和d6-19*01，或者

d2-2、d3-9、d3-10、d3-22、d4-17、d6-13和d6-19，或者d2-2*02、d3-9*01、d3-10*01、d3-22*01、d4-17*01、d6-13*01和d6-19*01，或者

d1-26、d2-2、d3-10和d6-19，或者

d2-2、d3-9和d3-10。

35.條款34的抗體，其中所述抗體從根據條款1-32任一項的脊椎動物中可獲得或者獲得。

在一個實施方案中，所述抗體得自所述脊椎動物，或者是這種抗體的拷貝。

36.分離結合預定抗原的抗體的方法，所述方法包括：

(a)提供條款1-32任一項的脊椎動物(任選小鼠或大鼠)；

(b)用所述抗原免疫所述脊椎動物；

(c)從所述脊椎動物取b淋巴細胞，選擇表達結合所述抗原的抗體的一或多個b淋巴細胞；

(d)任選使所述選擇的b淋巴細胞或者其后代永生化，任選通過從中產生雜交瘤而永生化；及

(e)分離由所述b淋巴細胞表達的抗體(例如，以及igg型抗體)。

37.條款36的方法，其中在步驟(e)中，所述抗體具有長度為至少20個氨基酸的hcdr3(根據imgt)。

所述長度可以是20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個氨基酸(根據imgt)，例如20-23個氨基酸(在實施例中產生)。

38.條款36或37的方法，包括從所述b淋巴細胞分離編碼結合所述抗原的所述抗體的核酸的步驟；任選地用編碼人或人源化重鏈恒定區(qū)的核苷酸序列交換所述抗體的重鏈恒定區(qū)核苷酸序列及任選親和性成熟所述抗體的可變區(qū)；以及任選將所述核酸插入表達載體及任選宿主中。

39.條款36、37或38的方法，進一步包括準備通過所述方法產生的抗體的拷貝、突變體或衍生物(例如人源化形式)。

人源化可以制備恒定區(qū)是人的。

40.條款33-39任一項的抗體組合物、細胞群、抗體或方法，其中所述抗原是感染性疾病病原體的抗原，任選其中所述病原體是病毒或細菌。

41.條款40的抗體組合物、細胞群、抗體或方法，其中所述病原體選自流感嗜血桿菌、大腸桿菌、腦膜炎奈瑟氏菌、皰疹病毒科病毒、巨細胞病毒(cmv)、hiv和流感病毒。

42.條款33-41任一項的抗體組合物、細胞群、抗體或方法，其中所述抗原是hivgp120抗原或者hivgp41抗原。

43.條款33-40任一項的抗體組合物、細胞群、抗體或方法，其中所述抗原包含活性位點或裂縫，其中所述抗體具有特異性結合所述抗原的活性位點或裂縫的長度為至少20個氨基酸的hcdr3。

44.包含條款33-35及40-43任一項的抗體或抗體組合物或者由條款36-38任一項的方法產生的抗體的藥物組合物，用以治療和/或預防人感染性疾病(例如其中所述感染性疾病是由選自如下一組中的病原體所致：流感嗜血桿菌，大腸桿菌，腦膜炎奈瑟氏菌，皰疹病毒科病毒，巨細胞病毒(cmv)，hiv和流感病毒)。

45.抗體重鏈的庫集(例如由抗體提供)，其包含一或多個重鏈，其可變結構域hcdr3的長度為至少20個氨基酸(根據imgt)及衍生自人vh、d和jh的重組，其中

vh選自如下一組中：

vh1-2*02、vh1-3*01、vh1-8*01、vh1-18*01、vh2-5*10、vh3-7*01、vh3-9*01、vh3-11*01、vh3-13*01、vh3-21*03、vh3-23*04、vh4-4*02、vh6-1*01和vh7-4-1*01，及

d選自如下一組中：

d2-2*02、d3-9*01、d3-10*01和d3-22*01，或者

d2-2*02、d3-9*01和d3-10*01，或者

d3-9*01和d3-10*01，或者

d1-26、d2-2、d3-9、d3-10、d3-22、d4-17、d6-13和d6-19，或者

d1-26*01、d2-2*02、d3-9*01、d3-10*01、d3-22*01、d4-17*01、d6-13*01和d6-19*01，或者

d2-2、d3-9、d3-10、d3-22、d4-17、d6-13和d6-19，或者d2-2*02、d3-9*01、d3-10*01、d3-22*01、d4-17*01、d6-13*01和d6-19*01，或者

d1-26、d2-2、d3-10和d6-19，或者

d2-2、d3-9和d3-10；

任選地jh是jh6(例如jh6*02)；

其中

(a)重鏈可變結構域已經在非人脊椎動物(例如小鼠或大鼠)中在體內產生；和/或

(b)重鏈可變結構域當與相應人種系v、d和j序列相比時包含非人脊椎動物aid-模式體細胞超變和/或當與相應人種系v、d和j序列相比時包含非人(例如小鼠或大鼠)末端脫氧核苷酸轉移酶(tdt)-模式連接突變。

在一個實例中，重鏈(或者所有重鏈庫集)包含非人脊椎動物恒定區(qū)(例如小鼠或大鼠恒定區(qū))。例如，所述恒定區(qū)是γ-類型恒定區(qū)(例如γ-1、γ-2或者γ-4型)。

在一個實例中，所述庫集是首次用于實驗的庫集。這在本文實施例章節(jié)中示出。

在一個實例中，所述庫集是免疫的庫集。這在本文的實施例章節(jié)中示出。

在一個實例中，所述庫集是抗原特異性庫集(例如由多個雜交瘤提供)。這在本文的實施例章節(jié)中示出。

所述庫集可以由b細胞提供(例如永生化的b細胞)。

所述庫集可以由雜交瘤提供。

在一個實例中，載體由宿主細胞攜帶(例如cho或hek293細胞或酵母細胞)。

hcdr3的長度可以是20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個氨基酸(根據imgt)，例如20-23個氨基酸(在實施例中產生)。

在一個實例中，在(a)中的脊椎動物是如本發(fā)明所述的脊椎動物。

46.編碼條款45的重鏈庫集的核酸集合。

在一個實例中，所述核酸在各自的載體中提供(例如表達載體，如大腸桿菌或cho或hek293載體)。

47.獲得抗原特異性重鏈(例如由抗體提供)的方法，所述方法包括將條款45的庫集暴露于預定抗原，選擇特異性結合所述抗原的一或多個重鏈，其中分離一或多個重鏈，其具有長度為至少20個氨基酸的hcdr3。

任選地，當重鏈具有非人恒定區(qū)時，其被交換為人恒定區(qū)，這是本領域常規(guī)技術。因此，本發(fā)明提供了如此產生的人抗體重鏈(例如組合人輕鏈以產生人抗體，其可用于人的治療h和/或預防應用，例如治療和/或預防人患者中感染性疾病)。

在本發(fā)明任何方面的脊椎動物或細胞的實例中，所述基因組包含免疫球蛋白輕鏈基因座，其包含位于恒定區(qū)(例如人或小鼠λ或κ恒定區(qū))上游的一或多個人v基因區(qū)段和一或多個人j基因區(qū)段。

對于重鏈的重排和表達，所述基因座包含控制元件，如技術人員已知的在j基因區(qū)段與恒定區(qū)之間的eμ與sμ。在一個實例中，小鼠eμ和sμ包含在jh庫集與恒定區(qū)之間的重鏈基因座中(即5’至3’順序，所述基因座包含jh基因區(qū)段、eμ和sμ及恒定區(qū))。在一個實例中，eμ和sμ是小鼠129-衍生的基因組的eμ和sμ(例如129sv-衍生的基因組，如129sv/ev(如129s7sv/ev(如來自可得自baylorcollegeofmedicine,texas,usa的ab2.1或ab2.2細胞)或者129s6sv/ev)))；在另一實例中，eμ和sμ是小鼠c57bl/6衍生的基因組的eμ和sμ。在這方面，所述基因座可以在選自ab2.1、ab2.2、vgf1、cj7和fh14的細胞基因組的igh基因座中構建。vgf1細胞在auerbachw,dunmorejh,fairchild-huntressv,etal；establishmentandchimeraanalysisof129/svev-andc57bl/6-derivedmouseembryonicstemcelllines.biotechniques2000；29:1024-8,30,32中確立和描述，所述文獻在此并入本文作參考。

此外或或者，所述恒定區(qū)(或者至少cμ；或者cμ及其γ恒定區(qū))是在上述段落中描述的基因組的恒定區(qū)(或者cμ；或者cμ及其γ恒定區(qū))。

人dna序列或基因區(qū)段的合適來源為技術人員熟知。例如，可以從準許的人供體中收集dna樣品(例如在本文實施例中的臉頰擦拭樣品)，從中可以獲得合適的dna序列用于構建本發(fā)明的基因座。人dna的其它來源可商購，如本領域技術人員已知。或者，技術人員通過參考本文所述人ig基因區(qū)段序列的一或多個數據庫能構建基因區(qū)段序列。

在一個實例中，所述基因組包含如下全部或一些人vh基因區(qū)段：

ighv6-1

ighv3-7

ighv1-8

ighv3-9

ighv3-11

ighv3-13

ighv1-18

ighv3-30

ighv4-31

ighv4-39

ighv4-59

任選還有(i)和/或(ii)

(i)

ighv1-2

ighv2-5及

ighv3-21

(ii)

ighv1-2

ighv2-5

ighv3-21

ighv1-24

例如，所述基因組包含如下全部或一些人vh基因區(qū)段變體：

ighv6-1*01

ighv3-7*01

ighv1-8*01

ighv3-9*01

ighv3-11*01

ighv3-13*01

ighv1-18*01

ighv3-30*18

ighv4-31*03

ighv4-39*01及

ighv4-59*01；

任選還有(iii)或(iv)

(ii)

ighv1-2*04

ighv2-5*10及

ighv3-21*03

(iv)

ighv1-2*02

ighv2-5*01

ighv3-21*01及

ighv1-24*01

例如，所述基因組包含如下全部或一些人jh基因區(qū)段變體：

ighj2*01

ighj3*02

ighj4*02

ighj5*02及

ighj6*02

例如，所述基因組包含如下全部或一些人d基因區(qū)段：

ighd1-1

ighd2-2

ighd3-9

ighd3-10

ighd5-12

ighd6-13

ighd1-14

ighd2-15

ighd3-16

ighd4-17

ighd6-19

ighd2-21

ighd5-24

ighd1-26及

ighd7-27

及任選還有(v)或(vi)

(v)

ighd3-3

(vi)

ighd3-3

ighd4-4

ighd5-5

ighd6-6

ighd1-7

ighd2-8及

ighd2-8

應理解本文描述的特定實施方案只是舉例說明本發(fā)明而無限制本發(fā)明之意。本發(fā)明的主要特征在不偏離本發(fā)明范圍的條件下可用于各個實施方案中。技術人員使用不超過常規(guī)的研究能夠意識到或者能確定本文描述的特定程序的各種等價物。這種等價物被認為在本發(fā)明范圍內并由權利要求書涵蓋。本說明書中提及的所有出版物和專利申請均表示本發(fā)明所屬領域技術人員的技術水平。所有出版物和專利申請在此均并入本文作參考，就像每個出版物或專利申請?zhí)厥饧爸饌€指出并入參考。當與權利要求書和/或說明書中的術語“包含”結合使用時，“一個”可以意味著“一個”，但是也符合“一或多個”、“至少一個”和“一個或多于一個”的意思。權利要求書中術語“或者”的使用是指“和/或”，除非明確表明是指僅擇一或者選擇是互相排斥的，盡管說明書支持僅擇一和“和/或”的定義。在本申請中，術語“大約”是指數值包括裝置、確定數值所采用的方法的固有誤差變化，或者在研究對象中存在的變化。

如本說明書和權利要求書所用，術語“包含”、“具有”、“包括”或者“含有”是包括性的或開放式的，不排除額外的未敘述的元件或方法步驟。

本文所用術語“或其組合”是指該術語前列出的項目的所有排列和組合。例如，“a,b,c或其組合意在包括至少如下之一：a,b,c,ab,ac,bc,或abc，如果在特定上下文中順序是重要的，也包括ba,ca,cb,cba,bca,acb,bac或cab。繼續(xù)使用這個例子，明確包括的是含有一或多個項目或術語的重復的組合，如bb,aaa,mb,bbc,aaabcccc,cbbaaa,cababb等。技術人員理解，除非根據上下文很明顯，典型地對任何組合中的項目或條款數目無限制。

除非根據上下文很明顯，本發(fā)明的任何部分均可以組合任何其它部分一起閱讀。

根據本文教導，本文揭示的和權利要求請求保護的所有組合物和/或方法均可以不用過度實驗而產生和執(zhí)行。雖然本發(fā)明的組合物和方法已經在優(yōu)選的實施方案中描述，但是本領域技術人員顯然了解在不偏離本發(fā)明的觀點、精神和范圍的條件下可以對所述組合物和/或方法及所述方法中的步驟或步驟順序進行變化。技術人員顯而易見的所有這種相似的替代和修改均被認為在所附權利要求書限定的本發(fā)明的精神、范圍和觀點內。

本發(fā)明在如下非限制性實施例中更詳盡描述(實施例1-3是假想實施例)。實施例4是實際進行的實施例。

實施例

實施例1

“重組工程的bac載體用于將多態(tài)性v區(qū)加入小鼠基因組中”

圖1-3描述了重組工程方法(參見上文)，其可用于將多態(tài)性v基因區(qū)導入基因組dna中。在一個實施方案中，通過標準技術將來自人重鏈區(qū)的基因組片段插入細菌人工染色體(bac)載體中。優(yōu)選地，這種bac的大小范圍可以是20-kb至200-kb或更多，通過標準技術包括商購文庫的序列搜索可以分離自bac文庫，或者通過與含有bac的細菌菌落雜交以鑒別具有感興趣bac的那些。

選擇具有一些vh基因區(qū)段的bac；在圖1中，這些一般被鑒別為例如vh[a]至vh[z]。本領域技術人員易于鑒別合適的基因組片段，例如來自人vh5-78至vh1-68的大約120-kb片段，其包括5個內源性活性vh基因區(qū)段和7個vh假基因。使用重組工程技術，內源性vh基因區(qū)段可以由多態(tài)性vh或vl基因區(qū)段置換。在這個實施例中，需要兩個步驟。第一個步驟用陽性-陰性選擇操縱子置換內源性vh基因區(qū)段的v-區(qū)編碼外顯子，在這個實施例中，所述操縱子是編碼氨芐青霉素抗性基因(amp)和鏈霉素敏化核糖體蛋白(rpsl)的操縱子。在不存在rpsl基因情況下通過對鏈霉素抗性選擇某些細菌菌株。將與在內源性vh基因外顯子側翼的序列同源的短dna序列置于rpsl-amp操縱子的5’和3’端。在存在合適的重組因子的條件下，根據標準的重組工程技術(見上述)，在操縱子片段與bac之間的重組將導致內源性vh基因外顯子由通過氨芐青霉素抗性選擇的操縱子置換(圖1a)。第二個步驟使用相同的同源序列以用希望的多態(tài)性vh基因區(qū)段置換插入的操縱子。在這個實施例中，插入人vh1-69基因(圖1b和1c)。特別地，使用vh1-69的*02等位基因[參見imgt和圖5]。在細菌中選擇成功整合的多態(tài)性vh基因區(qū)段，其由于缺失操縱子、特別是rpsl部分而變得對鏈霉素抗性。

在這個實施例中，所描述的兩步驟方法對于每個內源性vh基因區(qū)段或者對于多個希望用多態(tài)性v基因區(qū)段置換的內源基因區(qū)段可以重復進行(圖1d)。

顯然，以此方式可以插入任何多態(tài)性v基因區(qū)段，任何內源性v基因區(qū)段包括假基因均可作為靶。使用這種技術可以用作為bac插入體的合適的基因組片段置換每個重鏈和兩個輕鏈基因座中的v基因區(qū)段。

圖2描述了產生編碼多態(tài)性v基因區(qū)段的基因組片段的另一方法。在這個實施例中，將多態(tài)性v基因區(qū)段插入沒有其它基因、控制元件或其它功能的基因組dna區(qū)域中?？梢曰谛蛄蟹治鲆约翱寺∵Mbac的或者在現有bac文庫中鑒別的相應dna片段選擇這種“沙漠(desert)”區(qū)域。使用這種基因組片段開始，重組工程技術可用于將多態(tài)性v基因區(qū)段以間隔例如10-kb插入。在這個實施例中，150-kb基因組片段可容納插入多達15個多態(tài)性v基因區(qū)段。所述區(qū)段的插入是兩步方法。第一個重組工程步驟是在特定位點插入rpsl-amp操縱子。使用與特定位點同源的序列位于所述操縱子的側翼。這些是通過重組工程系統(tǒng)將所述元件特定插入bac基因組片段中，通過氨芐青霉素抗性選擇陽性事件(圖2a)。第二個步驟使用相同序列同源性通過相似的重組工程步驟用多態(tài)性v基因區(qū)段置換所述基因組片段中的操縱子(圖2b)。在這個實施例中，多態(tài)性vh基因區(qū)段的外顯子和啟動子元件均被插入，導致rpsl-amp操縱子的置換及因此對鏈霉素的抗性(圖2c)。

將多態(tài)性v基因區(qū)段插入基因組片段中特定位點的兩步驟技術可以重復多次，使得bac基因組片段具有一些多態(tài)性基因區(qū)段，包括其啟動子元件。顯然，圖1和2中示出的實施例可以組合，其中可使用插入技術以將額外的多態(tài)性v基因區(qū)段加入如圖1所示bac基因組片段中?？梢赃x擇將這些額外的區(qū)段加入ig基因組片段中，因為一旦插入非人哺乳動物基因組中，這種片段更適合正確的ig基因表達。已知基因組片段可具有如增強子等元件或者有助于某些染色質構象的元件，這二者在野生型基因表達中均是重要的。

圖3描述了產生具有多態(tài)性v基因區(qū)段的基因組片段的另一方法。這個方法依賴于使用重組工程使短(大約50-150個堿基，優(yōu)選100個堿基)單鏈dna片段與同源序列重組的效率(natrevgenet.2001oct；2(10):769-79；recombineering:apowerfulnewtoolformousefunctionalgenomics；copelandng,jenkinsna,courtdl)。重組工程中使用的重組酶優(yōu)先結合并使用這種短單鏈dna片段作為底物以起始同源重組。所述效率可以是高如10^-2，即在得自重組工程的大約100個隨機挑選(未選擇)的克隆中可發(fā)現一個陽性事件。這個實施例中的陽性事件發(fā)生在導入單鏈片段中的一或多個單核苷酸改變被轉移至含有v基因區(qū)段及圍繞基因組dna的bac插入體中時，所述一或多個核苷酸改變發(fā)生在bac上的同源序列中。

多態(tài)性v基因區(qū)段與內源性vh基因區(qū)段的不同可以是例如僅1或2個、或者至多10或15個核苷酸改變。這種核苷酸多態(tài)性的實例在圖5中示出。涵蓋多態(tài)性核苷酸改變的短單鏈區(qū)可以使用標準技術化學合成。所得單鏈dna片段被導入細菌中，通過重組工程技術，大約100個bac片段中有1個將具有通過單鏈片段的同源摻入而摻入了多態(tài)性核苷酸(圖3a)。具有希望的核苷酸改變的bac可以通過標準的聚合酶鏈反應(pcr)擴增和測序篩選例如幾百個個體克隆而鑒別。在所述實施例中，兩個核苷酸改變將使vh1-69*01基因區(qū)段轉變?yōu)関h1-69*02基因區(qū)段(圖3b)。

顯然這種方法對于單個bac基因組片段上包含的多個內源性v基因區(qū)段可以重復進行。此外，通過插入現有v基因區(qū)段之間的區(qū)域，圖2中描述的技術可用于加入額外的多態(tài)性v基因區(qū)段。正如本領域技術人員所顯而易見，這些技術的組合可用于產生多態(tài)性和內源性人v基因區(qū)段二者的多種變化。顯然，可以組合具有工程化的多態(tài)性v基因區(qū)段和內源性人v基因區(qū)段的一些不同的基因組片段以產生更多變化。

實施例2

“使用修飾的bac的srmce將多態(tài)性v-區(qū)加入基因組”

使用實施例1描述的方法產生的具有多態(tài)性v基因區(qū)段的修飾的bac可用于改變非人哺乳動物的基因組。這些改變可獲得一個包括人v基因區(qū)段的完整的ig基因座，其中正常的免疫球蛋白區(qū)重組導致vdj或vj組合。產生這種動物的一個實例是使用如圖4所示策略通改變例如小鼠胚胎干(es)細胞的基因組而進行。

將具有多態(tài)性v基因區(qū)段的修飾的bac整合進基因組中的一項技術是順序重組酶介導的盒交換(sequentialrecombinasemediatedcassetteexchange，srmce)。這項技術在wo2011004192(genomeresearchlimited)中描述，所述文獻在此以其全部內容并入本文作參考。

srmce提供了具有插入在特定位置的“著陸墊(landingpad)”的修飾的基因座。這種插入可以通過同源重組從頭開始或者作為先前bac插入的結果。在這個實施例中，所述著陸墊插入在最3’端的j基因區(qū)段與cμ基因區(qū)段之間的小鼠igh基因座中，通過srmce技術的先前bac插入導致加入5個人v基因區(qū)段和2個v區(qū)假基因。所述著陸墊具有如圖4所示元件，使得可以選擇第二個靶向bac片段的正確插入。這種插入的特異性通過在容許lox位點之間的cre重組酶介導的交換提供。lox位點僅與相容lox位點重組。在這個實施例中，loxp位點僅與loxp重組，lox2272僅與lox2272重組。這提供了插入bac片段的方向性，如圖4b和4c所示。

具有正確插入的es細胞克隆通過嘌呤霉素抗性選自不具有插入或者具有非生產性插入的一個克隆集合。對嘌呤霉素的抗性得自活性啟動子元件、pgk與purotk編碼區(qū)的并置。正確的插入通過標準技術證實，包括連接點的pcr、中間元件的pcr、southern印跡、比較基因組雜交(cgh)、測序等。在所述實施例中，正確的lox2272-lox2272和loxp-loxp重組也導致兩個完整系列piggybac元件，其在插入之前不存在。完整的piggybac元件由一系列反向重復組成，其在圖中以pb5和pb3標示。適當方向的piggybac元件系列是piggybac轉座酶的底物，其可以催化元件之間的重組，導致間插序列以及這兩個元件的缺失。在piggybac轉座之后剩余的dna是完整的并且沒有piggybac元件的任何剩余。在所述實施例中，具有成功piggybac轉座的es細胞克隆通過活性purotk元件的喪失而選擇，所述元件導致細胞對藥物fiau的抗性(圖4c和4d)。

這個實施例中srmce方法的終產物是具有一些多態(tài)性v基因區(qū)段的igh基因座，其沿著在5’側小鼠基因組序列與3’側小鼠igh恒定區(qū)基因區(qū)段之間一系列內源性未修飾的vh基因區(qū)段插入。所述多態(tài)性v基因區(qū)段被定位，由此其可參與與b細胞成熟產生vdj基因區(qū)段相關的重組事件。然后這些基因區(qū)段可以被轉錄及剪接至小鼠恒定區(qū)。這些轉錄物的翻譯將產生由多態(tài)性v基因區(qū)段、人dh基因區(qū)段、人jh基因區(qū)段及小鼠恒定區(qū)重鏈基因區(qū)段編碼的抗體重鏈。

如本領域技術人員所熟知，es細胞克隆可用于產生遺傳修飾的小鼠品系，通過將所述細胞注射進小鼠胚泡胚胎中，將注射的胚胎轉移至合適的接受體并繁殖產生的嵌合后代進行。修飾的基因座可以通過繁殖而增殖，根據遺傳雜交而產生雜合或純合基因座。

從這個實施例提供的igh基因座的結構及通過b細胞受體(bcr)和抗體基因重排中包含的機制中可以看出，將獲得多態(tài)性v基因區(qū)段與各種dh和jh基因區(qū)段的大量不同組合，這些可有助于在遺傳修飾的動物的b細胞群中功能性抗體基因的大量庫集。在這個實施例中，摻入一些不同的人vh1-69多態(tài)性以提供超人vh多樣性。已知這個特殊的vh基因區(qū)段在結合感染性疾病病原體(例如流感病毒)的抗體中是普遍的，因此這個實施例的具有遺傳修飾的小鼠的抗體庫集預期產生具有有利于結合感染性疾病病原體的那些抗體的偏向的抗體。換句話說，所述庫集具有更大的抗體子集，其具有對于病原體抗原的優(yōu)異親和性。舉例的這種病原體包括流感病毒、丙型肝炎病毒(hcv)及人免疫缺陷病毒-1(hiv-1)(也見上表所示)。

實施例3

“13個vh1-69等位基因的比對”

通過摻入額外的v基因區(qū)段多態(tài)性建造更多樣的抗體庫集需要v基因區(qū)段的多態(tài)性等位基因的可用性。這種等位基因的一個來源包括序列數據庫。在這個實施例中，提供了vh1-69基因區(qū)段的13個明確的等位基因。這些等位基因序列和對比得自“immunogenetics”imgtinformationsystem(www.imgt.com)數據庫。圖5是等位基因*02至*13與*01等位基因的比對圖示。vh1-69*01核苷酸和氨基酸序列在該圖上方提供。在其余的等位基因與*01等位基因序列是相同的情況中，在序列的下面加插破折號。核苷酸差異沿著適當的等位基因標示，如果序列改變導致蛋白質編碼改變，氨基酸改變在三聯(lián)體上方標示。

圖5示出與*01等位基因對比中每個等位基因的1-4個氨基酸改變。所有氨基酸改變均發(fā)生在編碼互補決定區(qū)(cdr)的重鏈蛋白部分。這些區(qū)域負責抗原特異性及抗體與抗原的親和性。顯然在抗體的庫集中提供額外的多態(tài)性cdr將提高存在對不同抗原具有優(yōu)異結合特性的抗體的可能性。在一些報道中，已經觀測到重鏈的vh1-69-編碼的可變區(qū)通常見于結合流感病毒、hcv和hiv-1抗原的抗體中(見上表)。因此，使用實施例1和2的方法將這個實施例的多態(tài)性v基因區(qū)段摻入轉基因動物模型中可能導致在所述轉基因動物中抗體庫集中具有更多的結合與這些及其它病原體相關抗原的抗體。如本領域所已知，更大的庫集增加發(fā)現與希望的抗原以高親和性和特異性結合的單克隆抗體的可能性，使用例如雜交瘤技術進行。

因此本發(fā)明在這些實施例中描述了一種轉基因小鼠模型，其可以用病原體或其它抗原免疫。來自這種免疫的小鼠的血漿b細胞可用于產生雜交瘤文庫，對其進行篩選以產生結合病原體抗原的抗體。鑒于在所述轉基因小鼠的igh基因座中加入多態(tài)性vh1-69基因區(qū)段，這個文庫在發(fā)現這種抗體方面優(yōu)于來自傳統(tǒng)轉基因小鼠的文庫。

這些實施例不限制可以選擇的人多態(tài)性v基因區(qū)段或者用于將其導入動物模型中的方法。所述方法可用于構建具有免疫球蛋白d和/或j區(qū)段的轉基因基因座。所述v、d、j區(qū)段可來自多個人類來源(任選一個以上的人類種族群體)。

實施例4：

“基于人jh6*02的轉基因小鼠，b細胞，雜交瘤，抗體及重鏈”

本發(fā)明人對功能性人基因區(qū)段庫集(從vh2-26至jh6，見關于人igh基因座結構的imgt數據庫；http://www.imgt.org/imgtrepertoire/index.php？section＝locusgenes&repertoire＝locus&species＝human&group＝igk)進行了分區(qū)(sectored)，產生了兩個不同的轉基因重鏈等位基因(以s2f和s3f表示)及相應小鼠。轉基因等位基因在小鼠中表達，在rna轉錄水平評估重鏈庫集。使用生物信息學方法進行深度序列分析以評估v、d和jh基因使用，包括在具有長度為至少20個氨基酸的hcdr3的可變結構域序列中進行分析。內源性小鼠可變區(qū)基因區(qū)段通過倒位而失活(如wo2011004192中所述方法，這個文獻在此并入本文作參考)。

人供體dna樣品的測序：鑒別保守的jh6*02變體

通過頰拭子獲得來自9個無記名同意的人供體的dna樣品。

根據qiaampdnaminikit(cat.no.51304,qiagen)方案對樣品進行處理及提取dna樣品。

設定pcr反應以擴增jh6區(qū)并對pcr產物測序(pcr寡聚物序列：正向5'-aggccagcagagggttccatg-3'(seqidno:444)，反向5'-ggctcccagatcctcaaggcac-3'(seqidno:445))。

通過與來自imgt注釋數據庫(http://www.imgt.org/)的jh6參考序列對比進行序列分析，這樣鑒別了所有9個供體基因組均含有人jh6*02變體，這個變體在9個供體中的7個供體中是純合狀態(tài)。本發(fā)明人還查閱了可從ensembl人基因組數據庫的jimwatsonandcraigventer[http://www.ensembl.org/]中公開獲得的基因組序列。這些也含有人jh6*02變體。本發(fā)明人確認人jh6*02在人體中是一個共有保守變體，因此是根據本發(fā)明構建轉基因igh基因座的良好候選物。

鑒別合適的人dna序列bac

從ensemble(http://www.ensembl.org/index.html)或ucsc(http://genome.ucsc.edu/)人數據庫中基于搜索基因名稱(igh)或位置(染色體14:106026574-107346185)鑒別一系列人細菌人工染色體(bac)克隆。選擇7個人rp11bac克隆，rp11-1065n8bac攜帶人jh6*02?？傊b別如下bac作為人igh基因座dna的來源：rp11-1065n8、rp11-659b19、rp11-141i7、rp-112h5、rp11-101g24、rp11-12f16和rp11-47p23。

使用相似方法，選擇不同的bac克隆(例如不同的rp11克隆id或者rp11的不同來源)或者遺傳工程化的bac以插入小鼠igh基因座中，提供轉基因小鼠中不同系列的人庫集。

構建轉基因igh基因座

將來自第一個ighbac(rp11-1065n8)的人重鏈基因區(qū)段插入小鼠ab2.1es細胞(baylorcollegeofmedicine)的igh基因座中以產生標示為s1等位基因的重鏈等位基因。插入的人序列相應于人染色體14的從位置106494908至位置106328951的序列，包含功能性重鏈基因區(qū)段vh2-5、vh7-4-1、vh4-4、vh1-3、vh1-2、vh6-1、d1-1、d2-2、d3-9、d3-10、d4-11、d5-12、d6-13、d1-14、d2-15、d3-16、d4-17、d5-18、d6-19、d1-20、d2-21、d3-22、d4-23、d5-24、d6-25、d1-26、d7-27、jh1、jh2、jh3、jh4、jh5及jh6(5’至3’順序)，其中選擇jh6作為人jh6*02變體。所述插入在小鼠染色體12的位置114666435與114666436之間產生，其在小鼠cμ區(qū)的上游。小鼠vh、d和jh基因區(qū)段保留在基因座中，緊鄰插入的人重鏈dna(5’端)的上游。

通過順序插入來自第二個bac(bac2)的人dna，構建第二個等位基因s2，其中更多的人功能性vh基因區(qū)段插入在s1等位基因中插入的最5’vh的上游(5’)。來自bac2的插入的人序列相應于人染色體14從位置106601551至106494909的序列，包含功能性重鏈基因區(qū)段vh3-13、vh3-11、vh3-9、vh1-8、vh3-7。小鼠vh、d和jh基因區(qū)段保留在基因座中，緊鄰插入的人重鏈dna(5’)的上游。在隨后的步驟中，將這些基因區(qū)段倒轉以失活，從而產生其中僅人重鏈可變區(qū)基因區(qū)段是活性的s2f小鼠。

通過順序插入來自第三個bac(bac3)的人dna，構建第三個等位基因s3，其中更多的人功能性vh基因區(qū)段插入在s2等位基因中插入的最5’vh的上游(5’)。插入的序列相應于人染色體14的位置106759988至106609301的序列，包含功能性重鏈基因區(qū)段vh2-26、vh1-24、vh3-23、vh3-21、vh3-20、vh1-18和vh3-15。小鼠vh、d和jh基因區(qū)段保留在基因座中，緊鄰插入的人重鏈dna(5’)的上游。在隨后的步驟中，將這些基因區(qū)段倒轉以失活，從而產生其中僅人重鏈可變區(qū)基因區(qū)段是活性的s3f小鼠。

使用標準程序，從es細胞中產生攜帶插入內源性重鏈基因座中的s2f或s3f的小鼠。小鼠中其它內源性重鏈基因座通過將包含neo^r的失活序列插入小鼠jh-cμ內含子中而失活(產生ha等位基因)。

特別地，包括如下等位基因：

vh1-2*02，vh1-3*01，vh1-8*01，vh1-18*01，vh2-5*10，vh3-7*01，vh3-9*01，vh3-11*01，vh3-13*01，vh3-21*03，vh3-23*04，vh4-4*02，vh6-1*01和vh7-4-1*01

d1-26*01，d2-2*02，d3-9*01，d3-10*01，d3-22*01，d4-17*01，d6-13*01和d6-19*01。

免疫程序

將s2f或s3f基因型的轉基因小鼠通過ip途徑在完全弗氏佐劑(sigmaf5881)中用商購的或者自產的抗原1(ova(sigmaa7641)、抗原2(人感染性疾病病原體抗原)和抗原3(人抗原)的20-40μg重組蛋白和10μg/動物cpg(cpgoligo；invivogen,sandiego,california,usa)初始免疫，然后以大約兩周間隔用在不完全弗氏佐劑(sigmaf5506)中的大約半量抗原和10μg/動物cpg進行加強兩次。最后的加強在2周后iv給予，不用任何佐劑，包含在pbs中的5-10μg蛋白。

雜交瘤融合程序

在最終加強之后3天取出脾，將脾細胞用cpg(25μm終濃度)處理并保持直至第二天。然后將細胞與sp0/2ag14骨髓瘤細胞(hpaculturescatno85072401)融合，使用btxecm2001電融合儀器進行。將融合的細胞放置恢復20分鐘，然后種植在t75培養(yǎng)瓶中直至第二天清晨。然后將細胞旋轉并通過系列稀釋鋪板于96孔培養(yǎng)平板上，放置大約10天，之后進行篩選。在此期間更換培養(yǎng)基1-3次。

篩選

使用europiumcryptate標記的抗小鼠igg(cisbioanti-mouseigeuropiumcryptate)和生物素標記的靶抗原及商購的鏈霉抗生物素綴合的供體(cisbio；鏈霉抗生物素綴合的d2)或者通過igg-特異性384孔elisa，使用均相時間分辨熒光測定(htrf)篩選上述雜交瘤孔的培養(yǎng)上清。通過htrf鑒別的陽性孔放大到24孔平板中或者使用igg-特異性檢測elisa方法立即反篩選。通過初次elisa篩選鑒別的陽性細胞立即擴增至24孔平板。一旦培養(yǎng)物擴增至24孔階段并達到鋪滿，將上清重新用htrf或igg-特異性elisa檢測以證實與靶抗原結合。然后也通過表面等離子共振分析這種證實的培養(yǎng)物上清，使用bioradproteonxpr36儀器。為此，將在雜交瘤培養(yǎng)物中表達的抗體捕獲在生物傳感器glm芯片(biorad176-512)上，其具有與所述生物傳感器芯片表面共價偶聯(lián)的抗小鼠igg(gehealthcarebr-1008-38))。然后所述抗原用作分析物并穿經捕獲的雜交瘤抗體表面。對于抗原2和抗原3，典型使用的濃度為256nm、64nm、16nm、4nm和1nm，對于抗原1，典型使用的濃度為1028nm、256nm、64nm、16nm和4nm，結合曲線是兩倍參考，使用0nm注射(即僅緩沖液)。動力學和整體親和性使用bioradproteonxpr36分析軟件本身的1:1模型確定。

具有證實的結合活性的任何克隆用于制備總rna及隨后的pcr以恢復重鏈可變區(qū)序列。進行標準5’-race以分析來自s2f和s3f小鼠中轉基因重鏈基因座的rna轉錄物。此外，對由所述小鼠產生的幾乎2000個序列進行深度序列分析。

生物信息學分析

進行分析的序列得自兩種不同方法：

·第一種是得自從脾中提取的rna：首先使用基于小鼠igh基因座的cmu區(qū)的寡聚物作為pcr模板合成cdna鏈。使用這個寡聚物及oligodt-錨引物進行pcr。然后將pcr產物克隆進pdrive載體(qiagen)并測序。

·第二種是得自通過電融合產生的雜交瘤：使用標準trizol方法從感興趣的雜交瘤系提取總rna，在-80℃冷凍以長期貯存。使用標準superscriptiii逆轉錄酶和結合所有小鼠igg同種型的重鏈的基因特異性反向引物及進行輕鏈擴增的小鼠κ恒定區(qū)引物，從100ng總rna產生cdna。然后將2-3μl的cdna在pcr反應中用作模板，使用pfudna聚合酶及與人免疫球蛋白可變結構域的前導序列退火的一組簡并正向引物，以及一種小鼠pan-igg反向引物。將pcr產物在1％瓊脂糖凝膠上電泳，提取大約350-450個堿基對的條帶并純化。然后對dna進行測序。

來自第一種方法的序列可以是來自首次用于實驗小鼠的igm或者來自免疫小鼠的igg。來自第二種方法的樣品均來自免疫小鼠的igg，并特異于免疫抗原。分析了幾乎2000個序列。

序列作為一對正向和反向讀取獲得。將這些序列首先修整以從讀取末端除去低質量的堿基調用(從兩端修整直至19個核苷酸的窗口的平均質量得分為25或更高)。將所述讀取與反向讀取的反向互補組合一起，根據正向讀取排列。所述排列得分是匹配5，錯配-4，缺口開放罰分10及缺口延伸罰分1。然后通過排列和對比堿基逐步產生共有序列。當存在分歧時，使用具有測序最高質量值的堿基。

然后使用blast+(basiclocalalignmentsearchtool)(camachoc.,coulourisg.,avagyanv.,man.,papadopoulosj.,bealerk.,&maddent.l.(2008)"blast+:architectureandapplications."bmcbioinformatics10:421http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20003500)程序“blastn”發(fā)現每個序列中使用的種系j和v區(qū)段。字長為30用于v匹配，15用于j匹配。從用于產生kymouse的bac的ngs測序中構建搜索數據庫。

如果序列的v和j區(qū)段均匹配，則將這兩個區(qū)段之間的序列與小鼠中的種系d區(qū)段數據庫對比，使用“blastn”，字長為4及選項“blastn-short”和“ungapped”。如果可能，這用于賦值d區(qū)段。cdr3通過搜索v區(qū)段中保守的“tattactgt”序列及j區(qū)段中的“ctgggg”而鑒別。如果未發(fā)現這些基序，則允許至多4個錯配。使用cdr3的imgt定義，由此cdr3長度從v中tgt之后至j中tgg之前計算。排除具有異讀框連接(不具有長度可被3除盡的cdr3核苷酸長度的那些)或含有終止密碼子(taa，tag或tga)的序列。

然后來自這種賦值的匹配v、j和d區(qū)段的名稱以及cdr3長度做表以進行下游分析。從首次用于實驗至免疫的小鼠中使用的ighj6*02比率增加，以及在具有長hcdr3(定義為由20個或更多個氨基酸組成)的序列亞群中富集。

這個結果示出通過免疫選擇jh6*02基因區(qū)段，因為jh6*02使用的比例在免疫之后增加。jh6*02也用于具有長hcdr3長度的大多數抗體中，這是hcdr3長度由長抗體特異性結合的靶位所需的。

此外，分析表明某些vh和d基因區(qū)段通常產生長hcdr3(在所有首次用于實驗的、免疫的及抗原特異性的重鏈庫集中)。見表2所示。

表2a:來自首次用于實驗庫集的長hcdr3

表2b:來自免疫的庫集的長hcdr3

表2c:來自抗原特異性庫集的長hcdr3