本發(fā)明涉及多肽的合成，尤其涉及一種利拉魯肽的制備方法。
背景技術(shù)：
：目前，隨著生活水平的提高，患糖尿病的人數(shù)逐漸增加，而利拉魯肽是一種人胰高糖素樣肽-1(glp-1)類似物，用于治療糖尿病。利拉魯肽的結(jié)構(gòu)是：his-ala-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-val-ser-ser-tyr-leu-glu-gly-gln-ala-ala-lys(na-pal-γ-glu)-glu-phe-ile-ala-trp-leu-val-arg-gly-arg-gly-oh。所以市場上對于利拉魯肽的需求量大?，F(xiàn)有的合成方法較多?；蚬こ痰姆椒y度大，技術(shù)難度大；在合成過過程中，主鏈合成過程中最易折疊氨基位點(diǎn)(第20-22位和第12-14位)容易造成氨基折疊現(xiàn)象，從而產(chǎn)生副產(chǎn)物以及其他雜質(zhì)，影響產(chǎn)物的產(chǎn)率以及純度；而很多合成方法主鏈通過逐一合成，這樣就會造成最易折疊氨基位點(diǎn)容易折疊或者氨基酸需要多次偶聯(lián)，進(jìn)一步造成產(chǎn)物生產(chǎn)率低或增加合成步驟。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于：針對上述由于合成過程因氨基折疊導(dǎo)致的氨基酸需要多次偶聯(lián)且接入率低進(jìn)一步降低產(chǎn)率以及產(chǎn)物純度問題，本發(fā)明提供了一種高收率、低成本、反應(yīng)條件溫和、有利于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化利拉魯肽制備方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：(1)用脫保護(hù)試劑對fmoc-gly-wang樹脂脫保護(hù)，去fmoc保護(hù)基團(tuán)；所述脫保護(hù)試劑為哌啶/dmf溶液，哌啶占所述脫保護(hù)試劑的體積百分比為30～50％；所述脫保護(hù)的反應(yīng)溫度為10～25℃；(2)將所述去保護(hù)的fmoc-gly-wang樹脂與保護(hù)氨基酸逐一偶聯(lián)獲得利拉魯肽主鏈樹脂；其中第12位～第14位三個保護(hù)氨基酸是以保護(hù)肽片段x進(jìn)行偶聯(lián)；第20位～第22位三個保護(hù)氨基酸是以保護(hù)肽片段y進(jìn)行偶聯(lián)；第31位以boc-his(trt)-oh保護(hù)形式進(jìn)行偶聯(lián)；其偶聯(lián)氨基酸片段為：boc-his(trt)-ala-glu(otbu)-gly-thr(tbu)-phe-thr(tbu)-ser(tbu)-asp(otbu)-y(tbu)-tyr(tbu)-leu-glu(otbu)-gly-gln(trt)-x(alloc)-glu(otbu)-phe-ile-ala-trp(boc)-leu-val-arg(pbf)-gly-arg(pbf)-gly-wang樹脂，其中x為ala-ala-lys；y為val-ser-ser；(3)將利拉魯肽主鏈肽樹脂脫除賴氨酸側(cè)鏈的alloc保護(hù)，逐一偶聯(lián)側(cè)鏈，得到利拉魯肽肽樹脂；(4)將利拉魯肽肽樹脂在裂解液中裂解，得到利拉魯肽粗品；(5)將利拉魯肽粗品純化，得到利拉魯肽精品。優(yōu)選的，fmoc-gly-wang樹脂的取代值≤0.35mmol/g。最優(yōu)選，fmoc-gly-wang樹脂的取代值為0.25mmol/g。本發(fā)明中，是以fmoc-gly-wang樹脂中g(shù)ly氨基酸為第1位氨基酸，依次倒推計(jì)算位數(shù)序號，并以his氨基酸為第31位氨基酸。優(yōu)選的，步驟(2)的偶聯(lián)反應(yīng)中加入活化劑，所述活化劑為1-羥基苯并三唑或n-羥基-7-氮雜苯并三氮唑。優(yōu)選的，步驟(2)中選用的縮合劑為n,n-二異丙基碳二亞胺、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、2-(7-氮雜-1h-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸鹽或o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸酯中的一種；縮合劑的摩爾用量為fmoc-gly-wang樹脂總摩爾數(shù)的1.2倍～6倍，優(yōu)選為2.5～4.5倍。優(yōu)選的，步驟(2)中選用的去fmoc保護(hù)試劑為哌啶/n,n-二甲基甲酰胺混合溶液，混合溶液中含哌啶為10％～50％(v/v)?；罨噭┑挠昧繛閒moc-gly-wang樹脂總摩爾數(shù)的1.2倍～6倍，優(yōu)選的為2.5～4.5倍。優(yōu)選的，步驟(2)中，接入x對應(yīng)的保護(hù)肽片段為fmoc-ala-ala-lys(alloc)-oh；接入y對應(yīng)的保護(hù)肽片段為fmoc-val-ser(tbu)-ser(tbu)-oh；接入組氨酸對應(yīng)的保護(hù)形式為boc-his(trt)-oh；優(yōu)選的，保護(hù)氨基酸或保護(hù)肽片段的用量為樹脂總摩爾量的2倍～6倍；更優(yōu)選為2～4倍。優(yōu)選的，偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)間為2-6小時(shí)。優(yōu)選的，步驟(2)中，fmoc-gly-wang樹脂與保護(hù)氨基酸和保護(hù)肽片段偶聯(lián)時(shí)，先反應(yīng)得到的保護(hù)氨基酸樹脂脫去fmoc保護(hù)基后再與下一個保護(hù)氨基酸偶聯(lián)反應(yīng)；耦聯(lián)反應(yīng)結(jié)束和脫去fmoc保護(hù)后經(jīng)過kaisertest檢測。優(yōu)選的，步驟(3)中，利拉魯肽主鏈肽樹脂脫除賴氨酸側(cè)鏈的alloc保護(hù)試劑為四三苯甲磷鈀和嗎啉/thf混合溶液；四三苯甲磷鈀的用量為肽樹脂摩爾數(shù)的0.3～0.5倍；嗎啉用量為肽樹脂摩爾數(shù)的5～10倍；脫保護(hù)在氮?dú)鈼l件下進(jìn)行；脫保護(hù)時(shí)間為5～10小時(shí)。優(yōu)選的，步驟(3)中，脫除alloc保護(hù)的利拉魯肽主鏈，逐一耦聯(lián)側(cè)鏈，得到利拉魯肽肽樹脂，側(cè)鏈分別以fmoc-glu(oh)-otbu和棕櫚酸形式應(yīng)用；優(yōu)選的，側(cè)鏈耦聯(lián)反應(yīng)，利拉魯肽主鏈樹脂：側(cè)鏈：耦聯(lián)試劑的摩爾比為1:4:6；所述耦聯(lián)條件同步驟(2)；所述耦聯(lián)反應(yīng)時(shí)間為6-8小時(shí)。所述逐一耦聯(lián)反應(yīng)結(jié)束和脫去fmoc保護(hù)后經(jīng)過kaisertest檢測。優(yōu)選的，步驟(4)中，裂解液含有三氟醋酸80％～95％(v/v)、1,2-乙二硫醇1％～10％(v/v)、三異丙基硅烷1％～5％(v/v)，溶劑為水；更優(yōu)選的混合溶劑的體積配比為：tfa為90％、edt為4％，tis為2％，余量為水。優(yōu)選的，步驟(5)中，純化的色譜柱為直徑10cm、填料為粒徑10um的十八烷基鍵合硅膠、孔徑為的c18柱，流動相分別為稀氨水溶液和乙腈，流速為120ml/min，上樣量為5～10g，色譜儀的檢測波長為230nm。經(jīng)純化后，所得產(chǎn)品純度大于99.0％。綜上所述，由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是：1.本申請通過對利拉魯肽主鏈合成過程中采用最易折疊氨基位點(diǎn)(第12-14位和第20-22位)進(jìn)行片段偶聯(lián)，主鏈合成過程就將容易折疊點(diǎn)偶聯(lián)，這樣避免合成過程因折疊導(dǎo)致的氨基酸需要多次偶聯(lián)且接入率低的問題，本申請的方法縮短了利拉魯肽的生產(chǎn)周期，降低純化難度，提高了利拉魯肽的合成收率。兩個短小的保護(hù)氨基酸片段易制備合成，且純度高，制備成本低，進(jìn)而降低了利拉魯肽的生產(chǎn)成本；2.采用合適的脫保護(hù)條件，使得脫保護(hù)反應(yīng)更加徹底；3.fmoc-gly-wang樹脂的取代度≤0.35mmol/g，因?yàn)閒moc-gly-wang樹脂的取代度過高，造成后期產(chǎn)物的空間結(jié)構(gòu)不可控，容易造成產(chǎn)物不純。4.在偶聯(lián)反應(yīng)中加入活化劑，增加偶聯(lián)反應(yīng)的速度，保護(hù)氨基酸的收率更高；5.合理控制好反應(yīng)物的用量，避免因雜質(zhì)過多；6.合理的反應(yīng)順序，避免不必要的副產(chǎn)物出現(xiàn)；7.采用三氟醋酸，1,2-乙二硫醇和水組成的裂解液，使得裂解更加徹底。本發(fā)明所使用的縮寫的含義列于下表中：本發(fā)明使用的氨基酸相對應(yīng)的保護(hù)氨基酸對照表：縮寫保護(hù)氨基酸形式glyfmoc-gly-ohargfmoc-arg(pbf)-ohvalfmoc-val-ohleufmoc-leu-ohtrpfmoc-trp(boc)-ohalafmoc-ala-ohilefmoc-ile-ohphefmoc-phe-ohglufmoc-glu(otbu)-ohala-ala-lysfmoc-ala-ala-lys(alloc)-ohglnfmoc-gln(trt)-ohtyrfmoc-tyr(tbu)-ohval-ser-serfmoc-val-ser(tbu)-ser(tbu)-ohaspfmoc-asp(otbu)-ohserfmoc-ser(tbu)-ohthrfmoc-thr(tbu)-ohhisboc-his(trt)-oh側(cè)鏈glufmoc-glu(oh)-otbu本說明書中公開的所有特征，除了互相排斥的特征和/或步驟以外，均可以以任何方式組合。具體實(shí)施方式實(shí)施例1制備利拉魯肽肽主鏈樹脂：以fmoc-gly-wang樹脂為開始載體，通過去fmoc保護(hù)和偶聯(lián)反應(yīng)，依次偶聯(lián)保護(hù)氨基酸，制得利拉魯肽肽主鏈樹脂，以gly作為第1個偶聯(lián)氨基酸，his作為第31個偶聯(lián)氨基酸排序，偶聯(lián)氨基酸片段為：boc-his(trt)-ala-glu(otbu)-gly-thr(tbu)-phe-thr(tbu)-ser(tbu)-asp(otbu)-y(tbu)-tyr(tbu)-leu-glu(otbu)-gly-gln(trt)-x(alloc)-glu(otbu)-phe-ile-ala-trp(boc)-leu-val-arg(pbf)-gly-arg(pbf)-gly-wang樹脂，其中x為ala-ala-lys，y為val-ser-ser；接入x時(shí)，對應(yīng)的保護(hù)氨基酸為fmoc-ala-ala-lys(alloc)-oh；接入y時(shí)，對應(yīng)的保護(hù)氨基酸為fmoc-val-ser(tbu)-ser(tbu)-oh；接入his時(shí)，對應(yīng)的保護(hù)氨基酸為boc-his(trt)-oh。具體步驟如下：(1)、在fmoc-gly-wang樹脂上偶聯(lián)arg取0.15mol第2個保護(hù)氨基酸fmoc-arg(pbf)-oh和0.15molhobt，用適量dmf溶解；另取0.15moldic，攪拌下慢慢加入含有保護(hù)氨基酸的dmf溶液中，于室溫環(huán)境中攪拌反應(yīng)30分鐘，得到活化后的保護(hù)氨基酸溶液，備用。取fmoc-gly-wang樹脂200g，取代值為0.25mmol/g，用2000ml30％pip/dmf溶液去保護(hù)30分鐘，洗滌抽濾得到去fmoc的樹脂。將活化后的第2個保護(hù)氨基酸溶液加入到已去fmoc的樹脂中，偶聯(lián)反應(yīng)4小時(shí)，抽濾洗滌，得含2個保護(hù)氨基酸的樹脂。(2)、接入第3～11個保護(hù)氨基酸使用步驟(1)中的方法，將第3～11個氨基酸偶聯(lián)在樹脂上。(3)、接入第12～14個保護(hù)氨基酸片段取0.2mol保護(hù)氨基酸片段即fmoc-ala-ala-lys(alloc)-oh和0.2molhobt，用適量dmf溶解；另取0.2moldic，攪拌下慢慢加入至保護(hù)氨基酸dmf溶液中，于室溫環(huán)境中攪拌反應(yīng)30分鐘，得到活化后的fmoc-ala-ala-lys(alloc)-oh片段溶液。將加入活化后的fmoc-ala-ala-lys(alloc)-oh片段溶液加入到已去fmoc的11肽樹脂，偶聯(lián)反應(yīng)3～5小時(shí)，過濾洗滌，得含第14個保護(hù)氨基酸的樹脂。(4)、接入第15～19個保護(hù)氨基酸采用接入第2個保護(hù)氨基酸相同方法，依次接入上述對應(yīng)的第15～19個保護(hù)氨基酸。(5)、接入第20～22個保護(hù)氨基酸片段取0.2mol保護(hù)氨基酸片段即fmoc-val-ser(tbu)-ser(tbu)-oh和0.2molhoat，用適量dmf溶解；另取0.2moldic，攪拌下慢慢加入至保護(hù)氨基酸dmf溶液中，于室溫環(huán)境中攪拌反應(yīng)30分鐘，得到活化后的fmoc-val-ser(tbu)-ser(tbu)-oh片段溶液。將加入活化后的fmoc-val-ser(tbu)-ser(tbu)-oh片段溶液加入到已去fmoc的19肽樹脂，偶聯(lián)反應(yīng)3～5小時(shí)，過濾洗滌，得含第22個保護(hù)氨基酸的樹脂。本發(fā)明中hoat/dic作為活化劑，可以將保護(hù)氨基酸活化，使其可以與樹脂進(jìn)行偶聯(lián)時(shí)更容易進(jìn)行，反應(yīng)速率快，收率也較高。通過對比試驗(yàn)可以得知，在加入步驟(5)的活化劑后，保護(hù)氨基酸的收率更高。(6)、接入第23～29個保護(hù)氨基酸采用接入第2個保護(hù)氨基酸相同方法，依次接入上述對應(yīng)的第23～29個保護(hù)氨基酸。(7)、接入第30～31個保護(hù)氨基酸采用接入保護(hù)氨基酸片段的相同方法，依次接入上述對應(yīng)的第30～31個保護(hù)氨基酸。得到利拉魯肽主鏈肽樹脂。(8)利拉魯肽主鏈肽樹脂的脫alloc保護(hù)取0.02mol四三苯基磷鈀和0.3mol嗎啉溶解在3000mlthf溶液中，制成脫保護(hù)試劑備用。利拉魯肽主鏈肽樹脂，分別用適量的15％三乙胺/dcm洗滌3次，thf/dcm洗滌3次抽干備用；將脫保護(hù)試劑加入到利拉魯肽主鏈肽樹脂中，通入氮?dú)?，進(jìn)行脫除alloc保護(hù)反應(yīng)。脫保護(hù)時(shí)間為5-10小時(shí)，進(jìn)過kaisertest檢測是否脫除alloc保護(hù)。(9)接入側(cè)鏈glu和pal采用接入保護(hù)氨基酸片段的相同方法，依次接入上述對應(yīng)的側(cè)鏈glu和pal。得到利拉魯肽肽樹脂。實(shí)施例2在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上，制備利拉魯肽粗品：取利拉魯肽肽樹脂，加入體積比為tfa︰edt：tis︰水＝90︰4︰2：4的裂解液，裂解液用量為5ml/g樹脂，攪拌均勻。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3小時(shí)，反應(yīng)混合物使用砂芯漏斗過濾，收集濾液，樹脂再用少量tfa洗滌3次，合并濾液后減壓濃縮，加入無水乙醚沉淀，再用無水乙醚洗沉淀3次，抽干得類白色粉末即為利拉魯肽粗品。實(shí)施例3在實(shí)施例2的基礎(chǔ)上，利拉魯肽粗品的純化工藝：利拉魯肽粗品用氨水調(diào)ph值為10的20％乙腈水溶液溶解，用0.45μm混合微孔濾膜過濾，純化備用；采用高效液相色譜法進(jìn)行純化，純化的色譜柱為直徑10cm、填料為粒徑10um的十八烷基鍵合硅膠、孔徑的c18柱，流動相分別為稀氨水溶液和乙腈溶液，流速為120ml/min，上樣量為5～10g，色譜儀的檢測波長為230nm。進(jìn)過多次純化，收集合格的主峰，分析液相檢測其純度，減壓濃縮，得到利拉魯肽的稀氨水溶液，冷凍干燥，得利拉魯肽18.8g，總收率為10.1％。單同位數(shù)分子量：3750.98(100％m+h)；純度：99.01％。在實(shí)施上述實(shí)施例時(shí)，縮合劑為n,n-二異丙基碳二亞胺、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、2-(7-氮雜-1h-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸鹽或o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸酯中的一種；選用的去fmoc保護(hù)試劑為哌啶/n,n-二甲基甲酰胺混合溶液，混合溶液中含哌啶為10％～50％(v/v)。具有廣泛的實(shí)用價(jià)值和應(yīng)用前景。采用上述實(shí)施例能較好實(shí)施本申請，但是本申請并不局限與上述實(shí)施例。當(dāng)前第1頁12