一種固液結合制備利拉魯肽的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及多肽藥物制備方法領域，特別涉及一種固相和液相結合制備利拉魯肽 的方法。
【背景技術】
[0002] 利拉魯肽（Liraglutide)，商品名Victoza，由丹麥諾和諾德公司研發(fā)，于2010年 1月25日在美國上市，2011年3月4日獲SFDA批準，進入中國市場；用于成人2型糖尿病 患者控制血糖，適用于單用二甲雙胍或磺脲類藥物最大可耐受劑量治療后血糖仍控制不佳 的患者，與二甲雙胍或磺脲類藥物聯(lián)合應用。2014年12月23日，諾和諾德公司又推出用于 治療肥胖的Saxenda(商品名），劑量為3mg/天。
[0003] 利拉魯肽是一種GLP-1類似物，與人GLP-1具有97%的序列同源性，人GLP-1可以 結合并激活GLP-1受體。GLP-1受體為天然GLP-1的靶點，GLP-1是一種內(nèi)源性腸促胰島素 激素，能夠促進胰腺0細胞葡萄糖濃度依賴性地分泌胰島素。與天然GLP-1不同的是，利 拉魯肽在人體中的藥代動力學和藥效動力學特點均適合每天一次的給藥方案。皮下注射給 藥后，其作用時間延長的機理包括：使吸收減慢的自聯(lián)作用；與白蛋白結合；對二肽基肽酶 IV(DPP-IV)和中性內(nèi)肽酶（NEP)具有更高的酶穩(wěn)定性，從而具有較長的血漿半衰期。
[0004]利拉魯肽化學表述為Arg34Lys26_[N_e- (y_Glu(N_a-十六?；-GLP_l7 37,分 子式為C172H265N43051，相對分子質(zhì)量為3751. 2,CAS號為204656-20-2,序列信息如下：
目前，諾和諾德公司（US6458924和US6268343)主要通過基因重組技術，利用酵母生 產(chǎn)利拉魯肽；但由于采用基因重組技術只能生產(chǎn)主鏈Arg34-GLP_17 37,還需要和N-a-十六 酰基-Glu(OSu) -OtBu反應，利用化學方法在Lys26接上側鏈；由于Arg34-GLP-l7 37的側鏈均 未保護，存在多個活性位點，所以此過程會產(chǎn)生較多雜質(zhì)，損失較大。
[0005] 還有報道采用固相化學法制備利拉魯肽，主要集中在側鏈修飾的連接策略上：如 專利CN102286092A采用Fmoc-Lys(Alloc)-〇H參與接肽反應，Pd(PPh)J^Alloc，然后連 接側鏈；CN103087181A采用Fmoc-Lys(Mtt)-〇H或Fmoc-Lys(Mmt)-〇H參與接肽反應，用 1%TFA/5%TIS/DCM脫側鏈保護基，連接側鏈；CN103145828A采用Fmoc-Lys(ivDde)-〇H參 與接肽反應，水合肼脫側鏈保護基，然后接側鏈反應；CN103980358A采用先液相合成單體 Fmoc-Lys(N-e- (y-Glu(N-a-十六?；?OtBu) -0H,然后參與接肽反應；CN103275209A 采用先合成N端保護的利拉魯肽主鏈，然后在液相條件下，用Na -Pal-y-Glu(OtBu) -OSu與 之發(fā)生偶聯(lián)反應，然后經(jīng)酸TFA脫叔丁基，堿性條件下脫Fmoc或Dde(或ivDde)兩步后處 理，再經(jīng)純化得到利拉魯肽。
[0006] 本發(fā)明人用現(xiàn)有的合成方法，制備利拉魯肽，發(fā)現(xiàn)純度和收率均不高，不適于工業(yè) 規(guī)模生產(chǎn)。鑒于以上問題，本發(fā)明人對利拉魯肽的合成方法進行了研究，從而得到本發(fā)明的 技術方案。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供一種利拉魯肽的固相和液相相結合的制備 方法。
[0008]本發(fā)明中利用合成的二肽單體Fmoc-Lys (N-e- (y-Glu (N_Boc)-OtBu)-OH和 Fmoc-Ala-Ala-OH參與制備利拉魯肽，并采用三氟乙?；睦旊模ㄎ葱揎棧┠Ｊ?，極大 的提高了終產(chǎn)品的收率；本發(fā)明降低合成難度和生產(chǎn)成本，提高了精肽的純度和收率，有利 于規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)。本發(fā)明一種固液結合制備利拉魯肽方法的技書方案包括如下步驟： (a) Boc-Glu (OSu)-OtBu和Fmoc-Lys-OH在喊性溶液下偶聯(lián)生成二肽單體Fmoc-Lys (N-e-(y-Glu(N-a -Boc)-OtBu)-OH ; (b) 以Wang樹脂或CTC樹脂為固相載體，采用Fmoc化學保護策略，按照利拉魯肽肽序， 依次與Fmoc保護氨基酸合成N端三氟乙酰化的全保護肽樹脂，其中Fmoc保護氨基酸26位 Lys采用的是單體Fmoc-Lys(N-e- (y-Glu(N-a-Boc) -OtBu) -0H，24 位和 25 位采用二肽單 體Fmoc-Ala-Ala-〇H;N端三氟乙?；娜Ｗo肽樹脂結構如下：Tfa-His(Trt) -Ala-Glu(0 tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu) -Val-Ser(tBu) -Ser(tBu)-Tyr( tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(N_e-(丫 -Glu(N_a-Boc) -OtBu)-Glu (OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)_Gly-樹脂； (c) 用裂解試劑裂解肽樹脂得到三氟乙?；睦旊模ㄎ葱揎棧?，并經(jīng)純化，得到 精肽：Tfa-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln -Ala- Ala -Lys(y-Glu - OH)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg- Gly-〇H； (d) 在堿性條件下，Pal-OSu與步驟（c)所得三氟乙酰化的利拉魯肽（未修飾）精肽 發(fā)生偶聯(lián)反應，得到棕櫚酸修飾的產(chǎn)物； (e) 經(jīng)堿解、純化、凍干得到利拉魯肽。
[0009]其中以上步驟（a)中Fmoc-Lys(N-e_(y-Glu(N-a-Boc)-OtBu)-0H的具體合成 方法為： 將Fmoc-Lys-〇H或其鹽與堿A按照摩爾比1:1~2的比例溶解在水中，加入5~20% 體積的有機溶劑B助溶，待完全溶解后，攪拌下滴加入1~1. 2倍摩爾量（以Fmoc-Lys-OH 的量計）Boc-Glu(OSu)-OtBu的有機溶劑B溶液；TLC監(jiān)測反應終點，待反應結束減壓蒸 發(fā)去掉有機溶劑后，再加入10%檸檬酸水溶液調(diào)溶液pH值至2~3,乙酸乙酯萃取，析晶得 Fmoc-Lys(N-e-(y-Glu(N-a-Boc)-OtBu)-〇H〇
[0010] 以上步驟中堿A為碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸鉀、三乙胺、二乙胺、N-乙基 二異丙基胺、N，N-二異丙基乙胺等中的一種； 有機溶劑B為四氫呋喃、二氧六環(huán)、N，N-二甲基甲酰胺、丙酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、乙 腈中的一種或幾種。
[0011] 以上技術方案步驟（b)中N端三氟乙?；娜Ｗo肽樹脂的具體制備方法為：以 Wang樹脂或CTC樹脂為固相載體，以2-5倍的投料比（以合成規(guī)模的物質(zhì)量計)，加入相應 的Fmoc保護氨基酸進行偶聯(lián)反應，每一個偶聯(lián)反應均是在縮合劑的存在下進行的固相接 肽反應，反應完畢后用脫保護試劑脫除Fmoc，再與下一個Fmoc保護氨基酸進行偶聯(lián)反應； 重復操作直至合成至1位His后，用三氟乙酸酐封端，得到N端三氟乙?；娜Ｗo肽樹 脂Tfa-His(Trt)-Ala_Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)_Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt) -Ala-Ala-Lys(N_e- (丫 _Glu(N_a-Boc)-〇tBu) -Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val_Arg (Pbf)-Gly-Arg(Pbf)_Gly-樹脂。其中26位Lys采用的Fmoc保護氨基酸為步驟（a)制得 的Fmoc-Lys(N-e- (y-Glu(N-a-Boc) -OtBu) -〇H，24 位和 25 位Ala米用Fmoc保護氨基 酸為二肽單體Fmoc-Ala-Ala-〇H;其他位點均采用常規(guī)的Fmoc保護氨基酸偶聯(lián)。優(yōu)選的， 步驟（b)中所述的Wang樹脂或CTC樹脂的替代度為0. 3-0. 5mmol/g;所述縮合劑為DIC/ HOBT、DIC/HOAT、TBTU/HOBT/DIPEA、HBTU/HOBT/DIPEA、HATU/HOAT/DIPEA的一種；脫保護 試劑為15~25% (體積含量）哌啶/DMF溶液。
[0012] 上述技術方案中步驟（c)中所述裂解試劑為加入體積比1-5%清除劑的TFA溶液， 所述清除劑為苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、巰基乙醇、苯酚、水和三異丙基硅烷中的一種或 幾種。
[0013] 上述技術方案中步驟（d)的具體操作步驟為： 取步驟（c)所得精肽與堿A按照摩爾比1:4~6的比例溶解在水中，加入體積比5~ 20%的有機溶劑B助溶，待完全溶解后，攪拌下滴加入1~2. 0倍摩爾量（以精肽的量計） Pal-〇Su的有機溶劑B溶液；繼續(xù)攪拌反應，TLC監(jiān)測反應終點；反應達到終點后，加入1~ 2. 0倍摩爾量的甘氨酸（以精肽的量計)，終止反應。
[0014] 其中步驟（d)中所述的堿A為碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸鉀、三乙胺、二乙 胺、N-乙基二異丙基胺、N，N-二異丙基乙胺等中的一種；所述有機溶劑B為四氫呋喃、二氧 六環(huán)、N，N-二甲基甲酰胺、丙酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、乙腈中的一種或幾種。
[0015] 技術方案中步驟（e)中堿解的具體操作方法為：量取體積比10-12%的哌啶（以步 驟（d)所得的溶液體積計)，加入步驟（d)所得的溶液中，配制成濃度為1M的哌啶溶液，攪 拌反應至三氟乙酰基堿解完全；然后經(jīng)超濾裝置脫鹽，不斷加入純水稀釋肽溶液，保持溶液 體積不變；當溶液pH值降至12~10時，采用0. 2-1. 0%醋酸水溶液稀釋肽溶液，至pH值降 至5~6時，停止抽濾。
[0016] 相對于現(xiàn)有技術，本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明首次合成二肽單體Fmoc-Lys (N-e-(y-Glu (N-Boc)-OtBu)-OH，并將其用于 利拉魯肽的制備，其合成過程和純化過程簡單易行，便于中控檢測，易于放大生產(chǎn)；同時采 用Fmoc-Ala-Ala-OH參與制備利拉魯肽，避免了24位或25位缺失Ala雜質(zhì)肽的生成，降低 了純化難度，提高了收率；三氟乙酰化的利拉魯肽（未修飾）水溶性較好，利于反相色譜 純化制備，同時還保護了N端的氨基在棕櫚酸修飾過程中不發(fā)生副反應，極大的提高了終 產(chǎn)品的收率；本發(fā)明的實施，解決了化學合成利拉魯肽過程中終產(chǎn)品相關雜質(zhì)肽超標、總收 率低的難題，終產(chǎn)品的純度提高到99. 5%以上，單雜控制在0.