本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是一種青環(huán)海蛇蛇毒來源的選擇性tnfr1拮抗肽hydrostatin-sn10及其在炎癥性腸病中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

炎癥性腸病(ibd)是一組特發(fā)性、慢性、炎癥性腸道疾病，具有終生復(fù)發(fā)傾向，包括兩種主要類型：克羅恩病(cd)和潰瘍性結(jié)腸炎(uc)，臨床表現(xiàn)為反復(fù)慢性腹瀉、粘液血便、腹痛、腹部包塊、腸梗阻、穿孔、體質(zhì)量減輕等，并有惡變的危險。ibd過去常見于發(fā)達(dá)國家，是北美和歐洲的常見病，歐洲和北美uc的發(fā)病率為10/10⁵～20/10⁵、患病率達(dá)100/10⁵～200/10⁵，cd的發(fā)病率為5/10⁵～10/10⁵、患病率達(dá)50/10⁵～100/10⁵(參見文獻(xiàn)：boirivantm,cossua.inflammatoryboweldisease[j].oraldis.2012,18(1):1-15.)。近年來ibd發(fā)病率亦呈逐步增高的趨勢，基于多家醫(yī)院病例統(tǒng)計推測，uc與cd的患病率分別為11.6/10⁵和1.4/10⁵，且有被低估之虞。目前該病已成為消化系統(tǒng)常見疾病和慢性腹瀉的主要病因，患者多為青壯年，給社會生產(chǎn)力和個人生活質(zhì)量帶來極大影響，引起了各界的高度重視，但迄今為止尚無有效的方法和藥物治療該病。

tnf-α(腫瘤壞死因子)是一種具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，涉及免疫調(diào)節(jié)、炎癥、感染性休克、細(xì)胞凋亡和自身免疫等生理和病理過程。tnf-α與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、哮喘、糖尿病等多種炎癥性和自身免疫性疾病有關(guān)。研究表明，在活動期潰瘍性結(jié)腸炎患者中，tnf-α的陽性表達(dá)升高，其可作為炎性介質(zhì)介導(dǎo)結(jié)腸粘膜的病理損傷，且tnf-α的升高與病變范圍和病變嚴(yán)重程度有關(guān)(參見文獻(xiàn)：murchsh,braeggercp,walker-smithja,macdonaldtt.locationoftumornecrosisfactoralphabyimmunohistochemistryinchronicinflammatoryboweldisease[j].gut,1993,34:1705-1709.)。

當(dāng)前治療tnf-α相關(guān)疾病的幾種單抗類藥物能很好的緩解其癥狀，然而，這類抗tnf-α單抗藥物因完全封閉了tnf-α的生物學(xué)功能，導(dǎo)致影響機體的免疫自穩(wěn)、免疫監(jiān)視功能，給很多患者帶來了易發(fā)生結(jié)核病感染、產(chǎn)生新的自身免疫疾病甚至誘發(fā)腫瘤的毒副作用。tnf-α作用于兩種受體，tnfr1和tnfr2。隨著對疾病發(fā)病機制的深入研究，當(dāng)前更多的研究是把治療的靶點轉(zhuǎn)向tnfrs?？傮w上從抗炎角度來說，tnfr1主要傳遞促炎、凋亡信號，通過選擇性地阻斷tnfr1傳遞的信號通路來封閉tnf-α的生物學(xué)功能，已成為該類藥物研發(fā)的熱點。目前，尚無專一選擇性拮抗tnfr1的ibd治療藥物報道。

中國專利文獻(xiàn)cn103030687a中公開了sn1能夠治療與tnf-α相關(guān)的疾病，還公開了其能夠治療結(jié)腸炎并給出了葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型(同本案實施例5)，但是：原公開sn1(22aa)靶點不專一，可以與tnf-α、tnfr1以及tnfr2結(jié)合，與tnfr1的結(jié)合能力最大，約為32μm；而sn10(10aa)靶點特異，具有選擇性，只與tnfr1結(jié)合，而不與tnf-α、tnfr2結(jié)合；與tnfr1結(jié)合能力約為2.8μm，并能競爭性抑制tnfr1與tnf-α的結(jié)合。本發(fā)明分別通過葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型和噁唑酮誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型，證明sn10具有治療炎癥性腸病(克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎)的用途。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種青環(huán)海蛇蛇毒來源的選擇性tnfr1拮抗肽hydrostatin-sn10及其在炎癥性腸病中的應(yīng)用，本發(fā)明的另一目的在于提供一種基于mpeg2000(單甲氧基聚乙二醇2000)修飾的選擇性tnfr1拮抗肽hydrostatin-sn10，即peg-sn10在炎癥性腸病中的應(yīng)用。

本發(fā)明人所在課題組(江海龍，中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)2015年碩士學(xué)位論文，海蛇蛇毒抗炎活性肽hydrostatin-sn1的結(jié)構(gòu)優(yōu)化和抗炎機制研究)通過將hydrostatin-sn1(22aa)截短，得到hydrostatin-sn10(10aa)，利用表面等離子共振技術(shù)(spr)發(fā)現(xiàn)其能與tnfr1結(jié)合，結(jié)合能力約為kd＝2.8μm，高于hydrostatin-sn1與tnfr1的結(jié)合能力(kd＝32μm)，然而，是否具有選擇性拮抗tnfr1不清楚、是否能競爭性抑制tnfr1與tnf-α的結(jié)合不清楚；動物模型結(jié)果表明其具有一定的抗炎活性。

本發(fā)明的主要技術(shù)方案是：對hydrostatin-sn10進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，表面等離子共振技術(shù)(spr)、微量熱泳動技術(shù)(mst)結(jié)果表明：hydrostatin-sn10靶點特異，能與tnfr1直接相互作用，與tnfr1的結(jié)合能力約為2.8μm；且只與tnfr1結(jié)合，具有選擇性，而不與tnf-α、tnfr2結(jié)合，能競爭性抑制tnfr1和tnf-α的相互作用，是一種選擇性tnfr1拮抗肽；hydrostatin-sn10對炎癥性腸病動物模型(葡聚糖硫酸鈉(dss)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型和噁唑酮(oxz)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型)都具有明顯的抗炎活性。證明了選擇性tnfr1拮抗肽hydrostatin-sn10具有治療炎癥性腸病(克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎)的用途。

制備peg修飾的peg-sn10，其中所用的修飾劑mpeg2000(單甲氧基聚乙二醇)的平均分子量為2000，其結(jié)構(gòu)簡式為ch3o-(ch2ch2o)n-cooh，其中n為聚合度。所述mpeg2000的羧基共價連接至hydrostatin-sn10肽鏈n-端天冬氨酸的游離氨基上，形成酰胺鍵，得到peg-sn10修飾肽。通過對葡聚糖硫酸鈉和噁唑酮誘導(dǎo)的小鼠急性結(jié)腸炎模型的抗炎效應(yīng)研究，證明peg-sn10能夠抑制小鼠結(jié)腸組織中炎癥因子的表達(dá)，有效緩解局部炎癥癥狀和體征，對ibd具有治療作用。

本發(fā)明的第一方面，提供一種選擇性tnfr1拮抗肽hydrostatin-sn10，所述的選擇性tnfr1拮抗肽hydrostatin-sn10的氨基酸序列如seqidno:2所示。

所述的選擇性tnfr1拮抗肽hydrostatin-sn10，其合成方法為：利用固相合成技術(shù)合成hydrostatin-sn10，并以hplc及ms分析其純度和分子量，分子量為1250.29道爾頓，等電點為4.39。

本發(fā)明的第二方面，提供一種選擇性tnfr1拮抗肽hydrostatin-sn10的編碼基因，其核苷酸序列如seqidno:1所示。

本發(fā)明的第三方面，提供上述的選擇性tnfr1拮抗肽hydrostatin-sn10在制備治療炎癥性腸病的藥物中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，所述的治療炎癥性腸病的藥物為：以選擇性tnfr1拮抗肽hydrostatin-sn10為唯一的活性成分，或包含選擇性tnfr1拮抗肽hydrostatin-sn10的藥物組合物。

本發(fā)明的第四方面，提供一種基于mpeg2000(單甲氧基聚乙二醇2000)修飾的選擇性tnfr1拮抗肽hydrostatin-sn10，即peg-sn10，所述的mpeg2000的羧基共價連接至hydrostatin-sn10肽鏈n-端天冬氨酸的游離氨基上。用平均分子量約2000道爾頓的mpeg(單甲氧基聚乙二醇)修飾hydrostatin-sn10能增加hydrostatin-sn10的半衰期和穩(wěn)定性。所述的mpeg2000的結(jié)構(gòu)簡式可表示為：ch3o-(ch2ch2o)n-cooh，其中所述n為聚合度，n＝35～45，其平均分子量為2000道爾頓。

本發(fā)明的第五方面，提供上述的基于mpeg2000修飾的選擇性tnfr1拮抗肽peg-sn10在制備治療炎癥性腸病的藥物中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，所述的治療炎癥性腸病的藥物為：以peg-sn10為唯一的活性成分，或包含peg-sn10的藥物組合物。

優(yōu)選的，所述的藥物組合物和藥劑學(xué)上的常規(guī)藥用輔料制成藥物制劑。所述的藥物制劑是片劑、顆粒劑、分散劑、膠囊劑、軟膠囊劑、滴丸、注射劑、粉針劑或氣霧劑等。

優(yōu)選的，所述的炎癥性腸病包括克羅恩病(cd)和潰瘍性結(jié)腸炎(uc)。

優(yōu)選的，上述的治療炎癥性腸病的藥物選擇性拮抗tnfr1。

本發(fā)明提供了選擇性tnfr1拮抗肽hydrostatin-sn10和peg-sn10在治療炎癥性腸病中的應(yīng)用，提供了有效的炎癥性腸病治療藥物。

附圖說明

圖1是hydrostatin-sn10的hplc分析結(jié)果。

圖2是hydrostatin-sn10的ms分析結(jié)果。

圖3是采用biacore(spr技術(shù))分析hydrostatin-sn10與tnfr1的結(jié)合能力；其中，a、sn10與tnfr1的相互作用，結(jié)合解離常數(shù)kd值約為2.8μm；b、sn10與tnf-α的相互作用，不結(jié)合；c、sn10對tnf-α-tnfr1結(jié)合的競爭性抑制作用(tnfr1在芯片上)；d、sn10對tnf-α-tnfr1結(jié)合的競爭性抑制作用(tnf-α在芯片上)；e、sn10對tnf-α-tnfr2結(jié)合的競爭性抑制作用。

圖4是采用mst技術(shù)分析hydrostatin-sn10與tnfr1的結(jié)合能力；其中，a、sn10與tnfr1的相互作用，結(jié)合解離常數(shù)kd值約為2.8μm；b、sn10與tnf-α的相互作用，不結(jié)合；c、sn10與tnfr2的相互作用，不結(jié)合；d、sn10對tnfr1-tnf-α結(jié)合的競爭性抑制作用，(tnfr1熒光標(biāo)記)；e、sn10對tnfr1-tnf-α結(jié)合的競爭性抑制作用，(tnf-α熒光標(biāo)記)；f、sn10對tnfr2-tnf-α結(jié)合的競爭性抑制作用，(tnfr2熒光標(biāo)記)。

圖5是hydrostatin-sn10和peg-sn10對葡聚糖硫酸鈉(dss)誘導(dǎo)的小鼠急性結(jié)腸炎模型中小鼠體重的影響。

圖6是hydrostatin-sn10和peg-sn10對dss誘導(dǎo)的小鼠急性結(jié)腸炎模型中小鼠疾病活動指數(shù)的影響。

圖7是hydrostatin-sn10和peg-sn10對dss誘導(dǎo)的小鼠急性結(jié)腸炎模型中小鼠結(jié)腸長度的影響。

圖8是hydrostatin-sn10和peg-sn10對dss誘導(dǎo)的小鼠急性結(jié)腸炎模型中小鼠脾臟指數(shù)的影響。

圖9是hydrostatin-sn10和peg-sn10對dss誘導(dǎo)的小鼠急性結(jié)腸炎模型中小鼠結(jié)腸組織中髓過氧化物酶活性的影響。

圖10是hydrostatin-sn10和peg-sn10對dss誘導(dǎo)的小鼠急性結(jié)腸炎模型中小鼠血清中炎癥因子表達(dá)水平的影響；其中，a、小鼠血清中tnf-α表達(dá)情況；b、小鼠血清中il-6表達(dá)情況；c、小鼠血清中il-1β表達(dá)情況；d、小鼠血清中ifn-γ表達(dá)情況；e、小鼠血清中il-10表達(dá)情況。

圖11是hydrostatin-sn10和peg-sn10對dss誘導(dǎo)的小鼠急性結(jié)腸炎模型中小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)損傷的影響，組織切片he染色光鏡圖(200倍)。

圖12是hydrostatin-sn10和peg-sn10對dss誘導(dǎo)的小鼠急性結(jié)腸炎模型中小鼠結(jié)腸組織tnf-α表達(dá)水平的影響，組織切片光鏡圖(100倍)。

圖13是hydrostatin-sn10和peg-sn10對噁唑酮(oxz)誘導(dǎo)的小鼠急性結(jié)腸炎模型中小鼠體重的影響。

圖14是hydrostatin-sn10和peg-sn10對oxz誘導(dǎo)的小鼠急性結(jié)腸炎模型中小鼠疾病活動指數(shù)的影響。

圖15是hydrostatin-sn10和peg-sn10對oxz誘導(dǎo)的小鼠急性結(jié)腸炎模型中小鼠結(jié)腸長度的影響。

圖16是hydrostatin-sn10和peg-sn10對oxz誘導(dǎo)的小鼠急性結(jié)腸炎模型中小鼠脾臟指數(shù)的影響。

圖17是hydrostatin-sn10和peg-sn10對oxz誘導(dǎo)的小鼠急性結(jié)腸炎模型中小鼠結(jié)腸組織中髓過氧化物酶活性的影響。

圖18是hydrostatin-sn10和peg-sn10對oxz誘導(dǎo)的小鼠急性結(jié)腸炎模型中小鼠血清中炎癥因子表達(dá)水平的影響；其中，a、小鼠血清中tnf-α表達(dá)情況；b、小鼠血清中il-6表達(dá)情況；c、小鼠血清中il-1β表達(dá)情況；d、小鼠血清中ifn-γ表達(dá)情況；e、小鼠血清中il-10表達(dá)情況。

圖19是hydrostatin-sn10和peg-sn10對oxz誘導(dǎo)的小鼠急性結(jié)腸炎模型中小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)損傷的影響，組織切片he染色光鏡圖(200倍)。

圖20是hydrostatin-sn10和peg-sn10對oxz誘導(dǎo)的小鼠急性結(jié)腸炎模型中小鼠結(jié)腸組織tnf-α表達(dá)水平的影響，組織切片光鏡圖(100倍)。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的具體實施方式作詳細(xì)說明。

下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

用實施例1制得的hydrostatin-sn10進(jìn)行實施例2-10的實驗。以下實施例中所用peg-sn10，由強耀生物科技有限公司合成，經(jīng)hplc檢測純度≥98％。

實施例1：選擇性tnfr1拮抗肽hydrostatin-sn10的合成和檢測。

以固相多肽合成技術(shù)合成hydrostatin-sn10，并以hplc(圖1)和ms(圖2)分析其純度及分子量，結(jié)果可知其純度>97％，分子量為1250.29g/mol。

實施例2：biacore分析hydrostatin-sn10與tnfr1的結(jié)合能力。

1、runningbuffer以10μl/min的流速流過cm-5傳感芯片中設(shè)定的通道，直至達(dá)到基線水平。

2、用儀器推薦的buffer活化芯片各通道的表面反應(yīng)基團(tuán)。

3、用epbuffer溶解tnfr1和tnfr2凍干粉，按一定的濃度進(jìn)樣，使之包被于芯片表面，再用1mol/l乙醇胺封閉芯片。測定動力學(xué)曲線前要對再生條件進(jìn)行測試，以選擇合適的再生條件。

4、當(dāng)runningbuffer跑至基線穩(wěn)定后，將系列濃度的多肽進(jìn)樣，中間濃度的多肽重復(fù)進(jìn)樣一次，記錄每個濃度的響應(yīng)值。

如圖3所示，hydrostatin-sn10能與tnfr1直接相互作用，與tnfr1的結(jié)合能力約為2.8μm；hydrostatin-sn10與tnf-α不結(jié)合，并能夠競爭性抑制tnfr1與tnf-α的相互作用。

實施例3：mst分析hydrostatin-sn10與tnfr1的結(jié)合能力。

1、hydrostatin-sn10與tnf-α、tnfr1、tnfr2的相互作用：

以1:1稀釋比例配制系列梯度濃度的hydrostatin-sn10，將等體積的熒光標(biāo)記tnf-α/tnfr1/tnfr2200nm與hydrostatin-sn10均勻混合后避光孵育30min，用毛細(xì)吸管吸取適量的樣品上機檢測，觀察相對熒光值的時間軌跡和熱泳動thermophoresis的劑量-響應(yīng)曲線，并通過軟件ntaffinityanalysisv2.0.2擬合計算親和力kd值，判斷是否有特異性結(jié)合趨勢。

2、hydrostatin-sn10對tnf-α與tnfr1/tnfr2結(jié)合的競爭性抑制作用：

以1:1稀釋比例配制系列梯度濃度的tnf-α，將等體積的熒光標(biāo)記tnfr1/tnfr2200nm與tnf-α均勻混合后避光孵育30min，用毛細(xì)吸管吸取適量的樣品上機檢測，軟件擬合求出陽性對照tnfr1/tnfr2與tnf-α的kd值；將400nmtnfr1和400μmhydrostatin-sn10等體積混合后，再與系列濃度的tnf-α等體積混合孵育30min，用毛細(xì)吸管吸取適量的樣品上機檢測，軟件擬合求出kd值。比較加入hydrostatin-sn10前后tnf-α飽和濃度、響應(yīng)值amplitude及親和力常數(shù)kd值的變化。

3、hydrostatin-sn10對tnf-α與tnfr1/tnfr2結(jié)合的競爭性抑制作用(方法同2)。

如圖4所示，mst實驗結(jié)果表明，hydrostatin-sn10靶點特異，能與tnfr1直接相互作用，與tnfr1的結(jié)合能力約為2.8μm；且只與tnfr1結(jié)合，具有選擇性，而不與tnf-α、tnfr2結(jié)合，能競爭性抑制tnfr1和tnf-α的相互作用。

實施例4：hydrostatin-sn10和peg-sn10在sd大鼠體內(nèi)的血漿半衰期檢測。

采用購自genzyme公司的elisa試劑盒，根據(jù)產(chǎn)品說明書進(jìn)行測定。血清樣品用肝素化的50μl毛細(xì)管從后眶內(nèi)采集，在處理后的1min、2min、3min、5min、10min、15min、20min、30min、45min、1h、2h、4h、6h、8h收集血液樣品。靜置2h后，將樣品離心，把得到的上清液貯存在-20℃以備檢測。

表1

如表1所示，結(jié)果表明，peg修飾后peg-sn10比hydrostatin-sn10的血漿半衰期延長。

實施例5：hydrostatin-sn10和peg-sn10對葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠急性結(jié)腸炎的作用。

具體實施步驟為：選取6-8周齡的balb/c小鼠隨機分為8組，每組包含10只小鼠。

正常組(normal)不做任何處理；模型組(model)小鼠的飲水中加入2.5％(w/v)的dss(市售，購自mp公司，mw為36,000-50,000)造模7天以誘發(fā)結(jié)腸炎；另外幾組在造模的同時腹腔注射hydrostatin-sn10肽和peg-sn10肽(400μg/kg/d)；陰性對照組：隨機肽組(400μg/kg/d))；陽性對照組：柳氮磺胺吡啶(sasp，400mg/kg/d)和英夫利昔單抗(ifx，5mg/kg/d)。每日記錄各組小鼠體重變化(圖5)，可知hydrostatin-sn10和peg-sn10能夠有效抑制結(jié)腸炎導(dǎo)致的體重下降。按照表2進(jìn)行疾病活動指數(shù)(dai)評分，結(jié)果如圖6所示，hydrostatin-sn10和peg-sn10可有效緩解結(jié)腸炎小鼠腹瀉、便血的癥狀。于造模七日后，頸椎脫臼處死小鼠，取出小鼠整段結(jié)腸及脾臟，發(fā)現(xiàn)hydrostatin-sn10和peg-sn10能顯著改善小鼠結(jié)腸長度(圖7)；測定脾重并計算脾臟指數(shù)，發(fā)現(xiàn)hydrostatin-sn10和peg-sn10能夠有效抑制結(jié)腸炎導(dǎo)致的脾臟變化(圖8)；通過檢測小鼠結(jié)腸組織的髓過氧化物酶(mpo)，發(fā)現(xiàn)hydrostatin-sn10和peg-sn10可明顯降低小鼠病變結(jié)腸組織中的mpo活性(圖9)；采集小鼠血液后，靜置2小時，取上清進(jìn)行炎癥因子檢測，發(fā)現(xiàn)hydrostatin-sn10和peg-sn10干預(yù)治療組的小鼠血清中促炎因子tnf-α、il-6、il-1β、ifn-γ的含量顯著降低，而抑炎因子il-10的顯著升高(圖10)；取結(jié)腸末端組織以10％福爾馬林固定，組織切片，he染色后觀察結(jié)腸變化，觀察發(fā)現(xiàn)hydrostatin-sn10和peg-sn10能夠有效抑制dss導(dǎo)致的結(jié)腸病變(圖11)；觀察小鼠結(jié)腸組織切片中的tnf-α表達(dá)量，同樣驗證了hydrostatin-sn10及peg-sn10能減輕小鼠結(jié)腸組織的炎癥程度(圖12)。

表2.dai評分標(biāo)準(zhǔn)

上述結(jié)果表明，hydrostatin-sn10和peg-sn10能夠有效治療dss誘導(dǎo)的結(jié)腸炎動物模型。

實施例6：hydrostatin-sn10和peg-sn10對噁唑酮誘導(dǎo)的小鼠急性結(jié)腸炎的作用。

具體實施步驟為：

噁唑酮誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎動物模型的建立：選取6-8周齡的雄性balb/c小鼠隨機分為8組，每組包含10只小鼠。第1天，將小鼠背部皮膚剃毛(1.5cm×1.5cm)，正常組皮膚涂搽0.15ml丙酮/橄欖油溶液(丙酮/橄欖油體積比4:1)，模型組、sn10組陰性對照藥和陽性對照藥組皮膚涂搽0.15ml3％(w/v)噁唑酮(溶解于丙酮/橄欖油溶液中)，行皮膚預(yù)致敏。第8天，以4％水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠后，將3.5f導(dǎo)管從肛門緩慢輕柔地插入小鼠結(jié)腸內(nèi)約4cm，正常組注入0.1ml50％乙醇，其它各組注入0.1ml1％(w/v)噁唑酮(溶解于50％乙醇中)，緩慢拔出導(dǎo)管，保持小鼠垂直、頭朝下體位60s，以使藥液充分留置于腸腔內(nèi)。灌腸后正常組和模型組小鼠給予0.1ml生理鹽水腹腔注射，hydrostatin-sn10組、peg-sn10組和隨機肽組分別給予0.1mlhydrostatin-sn10、peg-sn10和隨機肽(溶于生理鹽水)腹腔注射，劑量均為400ug/kg/d，陽性藥組分別給予0.1ml柳氮磺胺吡啶灌胃和英夫利昔單抗(溶于生理鹽水)腹腔注射，劑量分別為400mg/kg/d和5mg/kg/d，均連續(xù)給藥3天。

灌腸后每日觀察并記錄小鼠的體重變化、大便性狀及便血情況。小鼠體重變化如圖13所示，結(jié)果表明，hydrostatin-sn10、peg-sn10可顯著減輕結(jié)腸炎小鼠的體重下降。按照表2進(jìn)行疾病活動指數(shù)(dai)評分，結(jié)果如圖14所示，hydrostatin-sn10、peg-sn10可有效緩解結(jié)腸炎小鼠腹瀉、便血的癥狀。

于灌腸后第3天頸椎脫臼法處死小鼠，立即開腹取出結(jié)腸及脾臟，測量結(jié)腸長度如圖15所示，hydrostatin-sn10和peg-sn10能顯著改善小鼠結(jié)腸長度。稱重脾臟，計算脾臟指數(shù)＝10×脾重(g)/體重(g)，如圖16，結(jié)果顯示hydrostatin-sn10和peg-sn10能明顯下調(diào)小鼠的脾臟指數(shù)。

切取部分病變結(jié)腸組織并稱重，使用髓過氧化物酶(mpo)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)檢測小鼠結(jié)腸組織中mpo活性。mpo是中性粒細(xì)胞的功能標(biāo)志和激活標(biāo)志，參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的許多過程，而過高的mpo活性會催化反應(yīng)生成過量的氧化劑，造成局部氧化應(yīng)激和氧化性組織損傷。如圖17所示，hydrostatin-sn10和peg-sn10能有效抑制炎癥結(jié)腸組織中mpo活性的升高。

如圖18所示，取小鼠血清進(jìn)行炎癥因子檢測，發(fā)現(xiàn)hydrostatin-sn10和peg-sn10干預(yù)治療組的小鼠血清中促炎因子tnf-α、il-6、il-1β、ifn-γ的含量顯著降低，而抑炎因子il-10的顯著升高。

以生理鹽水沖洗小鼠結(jié)腸，取末段結(jié)腸組織，于10％福爾馬林中浸泡固定，制作組織切片，行he染色。如圖19，模型組結(jié)腸組織可見廣泛炎性細(xì)胞浸潤，杯狀細(xì)胞減少，腺體密度減低，而hydrostatin-sn10和peg-sn10能顯著減輕小鼠結(jié)腸組織的病理學(xué)改變。

如圖20所示，hydrostatin-sn10組和peg-sn10組小鼠結(jié)腸組織切片中tnf-α表達(dá)量明顯減少，結(jié)果表明hydrostatin-sn10及peg-sn10能減輕小鼠結(jié)腸組織的炎癥程度。

以上結(jié)果表明，hydrostatin-sn10和peg-sn10能夠有效治療惡唑酮誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎動物模型。

以上已對本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實施例進(jìn)行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可做出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>陸一鳴

<120>一種選擇性tnfr1拮抗肽sn10及其在炎癥性腸病中的應(yīng)用

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