本發(fā)明涉及一種制備蜂毒肽的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蜂毒是工蜂毒腺分泌的一種具有芳香氣味的透明液體，主要由多肽類、活性酶類、非肽類物質(zhì)組成，蛋白質(zhì)多肽類物質(zhì)是蜂毒中的主要成分，約占蜂毒的70%-80%。蜂毒肽是由26個氨基酸殘基組成的多肽，分子量為2840da，約占蜂毒干重的50%，其一級結(jié)構(gòu)氨基酸殘基序列為nh2-gly-ile-gly-ala-val-leu-lys-val-leu-thr-thr-glu-leu-pro-ala-leu-ile-ser-trp-ile-lys-arg-lys-arg-glu-gln-cooh。蜂毒肽具有抗炎、抑菌、抗癌、抗輻射、抑制血小板凝集等作用，可有效地治療肩周炎、風濕性關(guān)節(jié)炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎等多種疾病，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用。
蜂毒肽是從蜂毒中分離純化得來的，具有生物活性高、不污染環(huán)境等特點，可以研制開發(fā)出機體免疫調(diào)節(jié)劑等產(chǎn)品，具有很大的市場開發(fā)前景，因而引起了學術(shù)界廣泛的關(guān)注。
用溶媒萃取、三柱層析、溶媒萃取與三柱層析相結(jié)合等方法制備蜂毒肽，其產(chǎn)品制備過程繁瑣，生產(chǎn)周期較長，有機溶劑使用量大。kreil（kreil,g.structureofmelittinisolatedfromtwospeciesofhoneybees[j].febsletters,1973,33(2):241-244.）報道了溶媒萃取制備蜂毒肽的方法，蜂毒肽得率約為20%（質(zhì)量分數(shù)），純度在60.3%（質(zhì)量分數(shù)），制備方法簡便，提取1g蜂毒肽需要200ml正丁醇，正丁醇的需求量大，造成環(huán)境的嚴重污染。劉嶺和楊文超（1.劉嶺,李昌全,黃雪強.蜂毒素的純化方法及體外抗腫瘤作用研究[j].中國生化藥物雜質(zhì).2003,24（4）：16-172.楊文超,蜂毒肽的分離純化及其抗輻射作用機理研究[d],福建農(nóng)林大學,2007.）報道了三柱層析法制備蜂毒肽，蜂毒肽得率約為48.67%（質(zhì)量分數(shù)），純度為97.32%（質(zhì)量分數(shù)），純度較高，解決了有機溶劑用量大的問題，但是提取過程復雜，提取時間較長。張文禮和徐彭（1.張文禮,孫井元.蜂毒肽的分離提純方法[p],中國,101089017a.2007-12-19.2.徐彭,歐陽永偉,黃敬耀,張桂英,肖誠,劉波.從蜂毒中分離純化蜂毒肽的實驗研究.中草藥[j].2000,31(12):892-894.）報道了溶媒萃取與層析法相結(jié)合制備蜂毒肽，蜂毒肽得率約為47%（質(zhì)量分數(shù)），純度為電泳純，縮短了三柱層析法所需時間，與kreil（kreil,g.structureofmelittinisolatedfromtwospeciesofhoneybees[j].febsletters,1973,33(2):241-244.）的制備方法相比較，減少了正丁醇的使用量，但在提取過程中仍需大量的正丁醇，不利于環(huán)境保護。
上述分離純化方法生產(chǎn)工藝復雜，生產(chǎn)周期長，得率低，純度低，且污染嚴重。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是為了克服蜂毒肽現(xiàn)有分離純化技術(shù)的不足，提供一種快速制備蜂毒肽的方法，該方法所制備的蜂毒肽，得率高，純度高，周期短，能耗低，污染小的制備蜂毒肽的方法。
本發(fā)明獲得蜂毒肽的提取率質(zhì)量分數(shù)為49%，純度質(zhì)量分數(shù)為98%。
本發(fā)明的一種制備蜂毒肽的方法，步驟如下：
①蜂毒的除雜
將粗蜂毒加入到ph為4.0-5.5的緩沖溶液中，使其濃度為0.5-1.5mg/ml，以2500-3500r/min離心3-7min去除不溶性的雜質(zhì)，得上清液；
所述粗蜂毒是將蜜蜂蟄刺排出的毒液用蒸餾水溶解，經(jīng)冷凍干燥所得；
所述緩沖液為醋酸-醋酸鈉緩沖溶液；
所述除雜為除去不溶于緩沖溶液的物質(zhì)。
②蜂毒肽的分離
將①中所得上清液過葡聚糖凝膠g-25柱，用蒸餾水洗脫，流速控制在25-30ml/h，測定各分離組分的分子量，在葡聚糖凝膠柱下收集分子量為2840da的層析組分經(jīng)冷凍干燥得固體樣品；
所述葡聚糖凝膠g-25為葡聚糖用英文字母g表示，g反映凝膠的交聯(lián)程度、膨脹程度及分布范圍，25為每克凝膠膨脹時吸水2.5克；
所述洗脫為以蒸餾水作為流動相連續(xù)通過色譜柱固定相，流動相與固定相作用力比樣品弱，樣品各組分按先后順序從固定相洗出；
所述分子量的測定為根據(jù)標準品洗脫保留時間t(min)與其相對分子質(zhì)量對數(shù)值(lgmr)標準曲線回歸方程，標準品為抗菌肽標準品（mr=1422da）、氧化性谷胱甘肽標準品(mr=612da)、還原性谷胱甘肽標準品(mr=307.32da)。
所述da為蜂毒肽分子量的單位；
所述冷凍干燥為將所得組分冷凍至水的冰點以下，并置于高真空(10-40pa)的容器中，通過供熱使物料中的水分直接從固態(tài)冰升華為水汽的一種干燥方法。
③蜂毒肽的純化
將②中冷凍干燥所得的固體用2-4倍體積的無水乙醇進行溶解，經(jīng)2500-3500r/min離心4-6min，沉淀物質(zhì)即為蜂毒肽。
所述沉淀為不溶于無水乙醇的固體物質(zhì)。
采用本方法生產(chǎn)蜂毒肽，簡化了蜂毒肽的提取工藝，與現(xiàn)有方法相比生產(chǎn)周期減少1-2天，得率提高1-2%，降低了制備成本，蜂毒肽純度可達到電泳純。
與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明制備蜂毒肽的方法，具有以下顯著特點：
（1）采用葡聚糖凝膠g-25柱，進行分離處理；
（2）本發(fā)明獲得蜂毒肽相對于劉嶺、楊文超、張文禮、徐彭（1.劉嶺,李昌全,黃雪強.蜂毒素的純化方法及體外抗腫瘤作用研究.中國生化藥物雜質(zhì)[j].2003,24（4）：16-172.楊文超,蜂毒肽的分離純化及其抗輻射作用機理研究[d],福建農(nóng)林大學,2007.3.張文禮,孫井元.蜂毒肽的分離提純方法:中國,101089017a[p].2007-12-19.4.徐彭,歐陽永偉,黃敬耀,張桂英,肖誠,劉波.從蜂毒中分離純化蜂毒肽的實驗研究.中草藥[j].2000,31(12):892-894.），得率提高到1-2%，制備時間縮短2-3天。
（3）本發(fā)明獲得蜂毒肽的純度達到了電泳純。
實施例1：
①蜂毒的除雜
將粗蜂毒加入到ph為4.75的緩沖溶液中，使其濃度為1.0mg/ml，以3000r/min離心5min去除不溶性的雜質(zhì)，得上清液；
所述粗蜂毒是將蜜蜂蟄刺排出的毒液用蒸餾水溶解，經(jīng)冷凍干燥所得；
所述緩沖液為醋酸-醋酸鈉緩沖溶液；
所述除雜為除去不溶于緩沖溶液的物質(zhì)。
②蜂毒肽的分離
將①中所得上清液過葡聚糖凝膠g-25柱，用蒸餾水洗脫，流速控制在28ml/h，測定各分離組分的分子量，在葡聚糖凝膠柱下收集分子量為2840da的層析組分經(jīng)冷凍干燥得固體樣品；
所述葡聚糖凝膠g-25為葡聚糖用英文字母g表示，g反映凝膠的交聯(lián)程度、膨脹程度及分布范圍，25為每克凝膠膨脹時吸水2.5克；
所述洗脫為以蒸餾水作為流動相連續(xù)通過色譜柱固定相，流動相與固定相作用力比樣品弱，樣品各組分按先后順序從固定相洗出；
所述分子量的測定為根據(jù)標準品洗脫保留時間t(min)與其相對分子質(zhì)量對數(shù)值(lgmr)標準曲線回歸方程，標準品為抗菌肽標準品（mr=1422da）、氧化性谷胱甘肽標準品(mr=612da)、還原性谷胱甘肽標準品(mr=307.32da)。
所述da為蜂毒肽分子量的單位；
所述冷凍干燥為將所得組分冷凍至水的冰點以下，并置于高真空(10-40pa)的容器中，通過供熱使物料中的水分直接從固態(tài)冰升華為水汽的一種干燥方法。
③蜂毒肽的純化
將②中冷凍干燥所得的固體用3倍體積的無水乙醇進行溶解，經(jīng)3000r/min離心5min，沉淀物質(zhì)即為蜂毒肽。
所述沉淀為不溶于無水乙醇的固體物質(zhì)。
當前發(fā)明獲得蜂毒肽的提取率質(zhì)量分數(shù)為49%，純度質(zhì)量分數(shù)為98%。
實施例2：
①蜂毒的除雜
將粗蜂毒加入到ph為5.25的緩沖溶液中，1.5mg/ml，以3200r/min離心6min去除不溶性的雜質(zhì)，得上清液；
所述粗蜂毒是將蜜蜂蟄刺排出的毒液用蒸餾水溶解，經(jīng)冷凍干燥所得；
所述緩沖液為醋酸-醋酸鈉緩沖溶液；
所述除雜為除去不溶于緩沖溶液的物質(zhì)。
②蜂毒肽的分離
將①中所得上清液過葡聚糖凝膠g-25柱，用蒸餾水洗脫，流速控制在30ml/h，測定各分離組分的分子量，在葡聚糖凝膠柱下收集分子量為2840da的層析組分經(jīng)冷凍干燥得固體樣品；
所述葡聚糖凝膠g-25為葡聚糖用英文字母g表示，g反映凝膠的交聯(lián)程度、膨脹程度及分布范圍，25為每克凝膠膨脹時吸水2.5克；
所述洗脫為以蒸餾水作為流動相連續(xù)通過色譜柱固定相，流動相與固定相作用力比樣品弱，樣品各組分按先后順序從固定相洗出；
所述分子量的測定為根據(jù)標準品洗脫保留時間t(min)與其相對分子質(zhì)量對數(shù)值(lgmr)標準曲線回歸方程，標準品為抗菌肽標準品（mr=1422da）、氧化性谷胱甘肽標準品(mr=612da)、還原性谷胱甘肽標準品(mr=307.32da)。
所述da為蜂毒肽分子量的單位；
所述冷凍干燥為將所得組分冷凍至水的冰點以下，并置于高真空(10-40pa)的容器中，通過供熱使物料中的水分直接從固態(tài)冰升華為水汽的一種干燥方法。
③蜂毒肽的純化
將②中冷凍干燥所得的固體用4倍體積的無水乙醇進行溶解，經(jīng)3200r/min離心6min，沉淀物質(zhì)即為蜂毒肽。
所述沉淀為不溶于無水乙醇的固體物質(zhì)。
當前發(fā)明獲得蜂毒肽的提取率質(zhì)量分數(shù)為48.65%，純度質(zhì)量分數(shù)為97.21%。
實施例3：
①蜂毒的除雜
將粗蜂毒加入到ph為4.5的緩沖溶液中，0.5mg/ml，以2800r/min離心4min去除不溶性的雜質(zhì)，得上清液；
所述粗蜂毒是將蜜蜂蟄刺排出的毒液用蒸餾水溶解，經(jīng)冷凍干燥所得；
所述緩沖液為醋酸-醋酸鈉緩沖溶液；
所述除雜為除去不溶于緩沖溶液的物質(zhì)。
②蜂毒肽的分離
將①中所得上清液過葡聚糖凝膠g-25柱，用蒸餾水洗脫，流速控制在26ml/h，測定各分離組分的分子量，在葡聚糖凝膠柱下收集分子量為2840da的層析組分經(jīng)冷凍干燥得固體樣品；
所述葡聚糖凝膠g-25為葡聚糖用英文字母g表示，g反映凝膠的交聯(lián)程度、膨脹程度及分布范圍，25為每克凝膠膨脹時吸水2.5克；
所述洗脫為以蒸餾水作為流動相連續(xù)通過色譜柱固定相，流動相與固定相作用力比樣品弱，樣品各組分按先后順序從固定相洗出；
所述分子量的測定為根據(jù)標準品洗脫保留時間t(min)與其相對分子質(zhì)量對數(shù)值(lgmr)標準曲線回歸方程，標準品為抗菌肽標準品（mr=1422da）、氧化性谷胱甘肽標準品(mr=612da)、還原性谷胱甘肽標準品(mr=307.32da)。
所述da為蜂毒肽分子量的單位；
所述冷凍干燥為將所得組分冷凍至水的冰點以下，并置于高真空(10-40pa)的容器中，通過供熱使物料中的水分直接從固態(tài)冰升華為水汽的一種干燥方法。
③蜂毒肽的純化
將②中冷凍干燥所得的固體用2倍體積的無水乙醇進行溶解，經(jīng)2800r/min離心4min，沉淀物質(zhì)即為蜂毒肽。
所述沉淀為不溶于無水乙醇的固體物質(zhì)。
當前發(fā)明獲得蜂毒肽的提取率質(zhì)量分數(shù)為48.76%，純度質(zhì)量分數(shù)為97.64%。