本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種土元抗菌肽分離及抗菌活性研究方法。
背景技術(shù)：
抗菌肽是一類(lèi)免疫效應(yīng)因子,它在機(jī)體的先天非特異性免疫中起重要作用，構(gòu)成了低等動(dòng)物機(jī)體快速有效的免疫機(jī)制。抗菌肽最初從昆蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn),隨后在各種其它動(dòng)物乃至植物中也發(fā)現(xiàn)了抗菌肽，其家族不斷擴(kuò)大，種類(lèi)不斷增多。抗菌肽的研究始于二十世紀(jì)70年代中葉，此后一直是生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。利用基因工程方法生產(chǎn)抗菌肽除了工藝等問(wèn)題外，還由于抗菌肽種類(lèi)單一而效果欠佳，從來(lái)源豐富的天然材料中純化抗菌肽很有應(yīng)用前景。
土元eupolyphagasinensiswalker，蜚蠊目blattaria地鱉科polyphagidae昆蟲(chóng)，是我國(guó)傳統(tǒng)的藥用昆蟲(chóng)，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、抗腫瘤等功效，對(duì)白血病細(xì)胞具有抑制作用。土元喜歡生活在黑暗、潮濕的環(huán)境中，而且在人工規(guī)模高密度飼養(yǎng)條件下很難集體染病，因此可能是很好的天然抗菌藥物來(lái)源。但目前還沒(méi)有完善的土元抗菌肽的分離及抗菌活性分析研究方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種土元抗菌肽分離及抗菌活性研究方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)的不足。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種土元抗菌肽分離及抗菌活性研究方法，其特征在于，包括以下步驟：
步驟一、供試菌株制備，菌株采用番茄灰霉病病菌，首先將長(zhǎng)有灰色霉層的番茄病果實(shí)表面用無(wú)菌水沖洗，于病變交界處切取3mm×3mm的方塊，然后置于pda平板培養(yǎng)基上于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；于發(fā)病嚴(yán)重果實(shí)上挑取灰色霉層少量，置于pda平板培養(yǎng)基上，于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；將25℃下分離培養(yǎng)1-2天后的病原菌挑取單菌絲，純化2-3次后，轉(zhuǎn)接于pda斜面培養(yǎng)基中于4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>
步驟二、土元抗菌肽粗提液的提取制備，200g干土元用水浸泡30min，洗凈瀝干，沸水浸泡10min，迅速用自來(lái)水沖涼、瀝干；加入4℃預(yù)冷的0.5mol/l乙酸溶液800ml勻漿，勻漿液于4℃條件下，攪拌提取液，提取液在4℃、15000r/min條件下離心40min，將上清液冷凍干燥，獲得粗提物干物質(zhì)放置于-80℃低溫冰箱中備用；
步驟三、抗菌活力的測(cè)定，根據(jù)有效成份含量，分別配制成pda平板，每處理5個(gè)重復(fù)；步驟一制備的供試菌株在pda平板上25±1℃暗培養(yǎng)3天，用內(nèi)徑為4.5mm的打孔器打取菌塞備用，隨機(jī)取一菌塞，反接于加藥的pda平板上，以不加藥的pda做對(duì)照，25±1℃暗培養(yǎng)，24h、48h后各測(cè)定1次菌落直徑；
步驟四、根據(jù)步驟三，結(jié)合藥劑的相對(duì)抑制率a＝(b－c)/b×100％，評(píng)價(jià)供土元抗菌肽粗提物對(duì)番茄灰霉病菌的抑制作用，其中a為相對(duì)抑制率，b為對(duì)照菌落平均直徑，c為處理組菌落的平均直徑。
上述的一種土元抗菌肽分離及抗菌活性研究方法，其特征在于：所述步驟一將長(zhǎng)有灰色霉層的番茄病果實(shí)表面用無(wú)菌水沖洗3次。
上述的一種土元抗菌肽分離及抗菌活性研究方法，其特征在于：所述步驟三的pda平板的抗菌肽粗提物質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0和3.0mg/l。
本發(fā)明的有益效果是：
本發(fā)明通過(guò)簡(jiǎn)易的實(shí)驗(yàn)方法，得出土元抗菌肽粗提物對(duì)番茄灰霉病菌具有較明顯的抑制作用，方法較為完善、可靠，參考數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，有效解決了現(xiàn)有技術(shù)的不足。
具體實(shí)施方式
一種土元抗菌肽分離及抗菌活性研究方法，其特征在于，包括以下步驟：
步驟一、供試菌株制備，菌株采用番茄灰霉病病菌，首先將長(zhǎng)有灰色霉層的番茄病果實(shí)表面用無(wú)菌水沖洗，于病變交界處切取3mm×3mm的方塊，然后置于pda平板培養(yǎng)基上于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；于發(fā)病嚴(yán)重果實(shí)上挑取灰色霉層少量，置于pda平板培養(yǎng)基上，于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；將25℃下分離培養(yǎng)1-2天后的病原菌挑取單菌絲，純化2-3次后，轉(zhuǎn)接于pda斜面培養(yǎng)基中于4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>
步驟二、土元抗菌肽粗提液的提取制備，200g干土元用水浸泡30min，洗凈瀝干，沸水浸泡10min，迅速用自來(lái)水沖涼、瀝干；加入4℃預(yù)冷的0.5mol/l乙酸溶液800ml勻漿，勻漿液于4℃條件下，攪拌提取液，提取液在4℃、15000r/min條件下離心40min，將上清液冷凍干燥，獲得粗提物干物質(zhì)放置于-80℃低溫冰箱中備用；
步驟三、抗菌活力的測(cè)定，根據(jù)有效成份含量，分別配制成pda平板，每處理5個(gè)重復(fù)；步驟一制備的供試菌株在pda平板上25±1℃暗培養(yǎng)3天，用內(nèi)徑為4.5mm的打孔器打取菌塞備用，隨機(jī)取一菌塞，反接于加藥的pda平板上，以不加藥的pda做對(duì)照，25±1℃暗培養(yǎng)，24h、48h后各測(cè)定1次菌落直徑；
步驟四、根據(jù)步驟三，結(jié)合藥劑的相對(duì)抑制率a＝(b－c)/b×100％，評(píng)價(jià)供土元抗菌肽粗提物對(duì)番茄灰霉病菌的抑制作用，其中a為相對(duì)抑制率，b為對(duì)照菌落平均直徑，c為處理組菌落的平均直徑。
本實(shí)施例中，所述步驟一將長(zhǎng)有灰色霉層的番茄病果實(shí)表面用無(wú)菌水沖洗3次。
本實(shí)施例中，所述步驟三的pda平板的抗菌肽粗提物質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0和3.0mg/l。
土元抗菌肽的抗菌活性結(jié)果與分析
由表1可知，1.0mg/lpda、2.0mg/lpda、3.0mg/lpda培養(yǎng)基的24h土元抗菌肽粗提物對(duì)番茄灰霉病菌的相對(duì)抑制率分別為0.7407％、14.81％、26.30％，對(duì)照與3.0mg/lpda培養(yǎng)基菌落平均直徑相比較差異極顯著。由表2可知，1.0mg/lpda、2.0mg/lpda、3.0mg/lpda培養(yǎng)基的48h土元抗菌肽粗提物對(duì)番茄灰霉病菌的相對(duì)抑制率分別為3.355％、20.78％、50.53％，對(duì)照與2.0mg/l、3.0mg/lpda培養(yǎng)基菌落平均直徑相比較差異極顯著?？梢?jiàn)，土元抗菌肽粗提物對(duì)番茄灰霉病菌具有較明顯的抑制作用。
表1土元抗菌肽粗提物24h抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果
表2土元抗菌肽粗提物48h抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果
以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無(wú)需創(chuàng)造性勞動(dòng)就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思做出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過(guò)邏輯分析、推理或者有限的實(shí)驗(yàn)可以得到的技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書(shū)所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。