本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中油體相關(guān)蛋白在調(diào)控植物蠟質(zhì)含量中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

水稻不僅是重要的模式植物，也是當(dāng)今世界種植面積最廣的糧食作物之一。極端的外部環(huán)境已成為限制水稻種植和產(chǎn)量的一個(gè)重要因素。其中，高溫、干旱等嚴(yán)重影響水稻適應(yīng)性和生產(chǎn)。植物蠟質(zhì)作為覆蓋在植物地上部分表面的一層疏水屏障，與外部環(huán)境關(guān)系密切，具有保水、抗輻射、抗病蟲(chóng)害等功能。因此，深入研究調(diào)控水稻葉片蠟質(zhì)含量，對(duì)水稻生產(chǎn)具有重要意義。

蠟質(zhì)的主要成分是長(zhǎng)鏈脂肪酸及其衍生物。長(zhǎng)鏈脂肪酸起源于質(zhì)體上合成的c16和c18脂肪酸，這些脂肪酸酯化為?；o酶a后在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上通過(guò)脂肪酸延伸酶復(fù)合體延長(zhǎng)，然后通過(guò)初級(jí)醇途徑和烷烴途徑形成蠟質(zhì)混合物。因此,蠟質(zhì)代謝與脂肪酸是密不可分的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何調(diào)控植物葉片中的蠟質(zhì)含量。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了油體相關(guān)蛋白在調(diào)控植物蠟質(zhì)含量中的應(yīng)用。

本發(fā)明所提供的油體相關(guān)蛋白在調(diào)控植物蠟質(zhì)含量中的應(yīng)用中，所述油體相關(guān)蛋白名稱是oshsd1，為下述a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列為序列1所示的蛋白質(zhì)；

a2)在序列1的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基得到的具有相同功能的由a1)衍生的蛋白質(zhì)；

a3)在a1)或a2)的n端或/和c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)。

其中，序列1由354個(gè)氨基酸組成。

為了使a1)、a2)和a3)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在a1)、a2)或a3)的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。

表1、標(biāo)簽的序列

上述a2)中的oshsd1可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述a2)中的oshsd1的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列2所示的dna序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了與oshsd1相關(guān)的生物材料在調(diào)控植物蠟質(zhì)含量中的應(yīng)用。

本發(fā)明所提供的與oshsd1相關(guān)的生物材料在調(diào)控植物蠟質(zhì)含量中的應(yīng)用中，所述生物材料，為下述b1)至b20)中的任一種：

b1)編碼oshsd1的核酸分子；

b2)含有b1)所述核酸分子的表達(dá)盒；

b3)含有b1)所述核酸分子的重組載體；

b4)含有b2)所述表達(dá)盒的重組載體；

b5)含有b1)所述核酸分子的重組微生物；

b6)含有b2)所述表達(dá)盒的重組微生物；

b7)含有b3)所述重組載體的重組微生物；

b8)含有b4)所述重組載體的重組微生物；

b9)含有b1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；

b10)含有b2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；

b11)含有b3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；

b12)含有b4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；

b13)含有b1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物組織；

b14)含有b2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物組織；

b15)含有b3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物組織；

b16)含有b4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物組織；

b17)含有b1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物器官；

b18)含有b2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物器官；

b19)含有b3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物器官；

b20)含有b4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物器官。

上述與oshsd1相關(guān)的生物材料在調(diào)控植物蠟質(zhì)含量中的應(yīng)用中，b1)所述核酸分子為如下a1)或a2)或a3)或a4)或a5)所示的基因：

a1)核苷酸序列是序列表中序列2的cdna分子或dna分子；

a2)核苷酸序列是序列表中序列3的基因組dna；

a3)核苷酸序列是序列表中序列3的第3442-10284位的基因組dna；

a4)與a1)或a2)或a3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼oshsd1的cdna分子或基因組dna分子；

a5)在嚴(yán)格條件下與a1)或a2)或a3)限定的核苷酸序列雜交，且編碼oshsd1的cdna分子或基因組dna分子。

其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因組dna或重組dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

序列2由1065個(gè)核苷酸組成，編碼序列1所示的蛋白質(zhì)。序列3由11417個(gè)核苷酸組成，序列3中，序列3的第3442-3639位、第6939-7131位、第8110-8195位、第8720-8851位、第9527-9691位和第9994-10284位分別為oshsd1基因的六個(gè)外顯子的序列，序列3中oshsd1基因的六個(gè)外顯子的序列依次連接得到序列2；序列3的第1-3204位為啟動(dòng)子的序列。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方法，對(duì)本發(fā)明的編碼oshsd1的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過(guò)人工修飾的，具有與本發(fā)明分離得到的oshsd1的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼oshsd1且具有oshsd1功能，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。

這里使用的術(shù)語(yǔ)“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的編碼oshsd1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來(lái)評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。

上述與oshsd1相關(guān)的生物材料在調(diào)控植物蠟質(zhì)含量中的應(yīng)用中，所述嚴(yán)格條件是在2×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×sspe(或0.1×ssc)、0.1％sds的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可為80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述與oshsd1相關(guān)的生物材料在調(diào)控植物蠟質(zhì)含量中的應(yīng)用中，b2)所述的含有編碼oshsd1的核酸分子的表達(dá)盒(oshsd1基因表達(dá)盒)，是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)oshsd1的dna，該dna不但可包括啟動(dòng)oshsd1基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，還可包括終止oshsd1 基因轉(zhuǎn)錄的終止子。進(jìn)一步，所述表達(dá)盒還可包括增強(qiáng)子序列?？捎糜诒景l(fā)明的啟動(dòng)子包括但不限于：組成型啟動(dòng)子，組織、器官和發(fā)育特異的啟動(dòng)子，和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的例子包括但不限于：花椰菜花葉病毒的組成型啟動(dòng)子35s：來(lái)自西紅柿的創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，亮氨酸氨基肽酶("lap",chao等人(1999)plantphysiol120：979-992)；來(lái)自煙草的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，發(fā)病機(jī)理相關(guān)1(pr1)(由水楊酸和bth(苯并噻二唑-7-硫代羥酸s-甲酯)誘導(dǎo))；西紅柿蛋白酶抑制劑ii啟動(dòng)子(pin2)或lap啟動(dòng)子(均可用茉莉酮酸甲酯誘導(dǎo))；熱休克啟動(dòng)子(美國(guó)專利5，187，267)；四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(美國(guó)專利5，057,422)；種子特異性啟動(dòng)子，如谷子種子特異性啟動(dòng)子pf128(cn101063139b(中國(guó)專利200710099169.7))，種子貯存蛋白質(zhì)特異的啟動(dòng)子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的啟動(dòng)子(beachy等人(1985)emboj.4：3047-3053))。它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用。此處引用的所有參考文獻(xiàn)均全文引用。合適的轉(zhuǎn)錄終止子包括但不限于：農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶終止子(nos終止子)、花椰菜花葉病毒camv35s終止子、tml終止子、豌豆rbcse9終止子和胭脂氨酸和章魚(yú)氨酸合酶終止子(參見(jiàn)，例如：odell等人(i⁹⁸⁵)nature313:810；rosenberg等人(1987)gene,56:125；guerineau等人(1991)mol.gen.genet,262:141；proudfoot(1991)cell,64:671；sanfacon等人genesdev.,5:141；mogen等人(1990)plantcell,2:1261；munroe等人(1990)gene,91:151；ballad等人(1989)nucleicacidsres.17:7891；joshi等人(1987)nucleicacidres.,15:9627)。

可用現(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建含有所述oshsd1基因表達(dá)盒的重組載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如pahc25、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb(cambia公司)等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3′端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mrna加工或基因表達(dá)的dna片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mrna前體的3′端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(ti)質(zhì)粒基因(如胭脂堿合成酶基因nos)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3′端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是atg起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(gus基因、螢光素酶基因等)、抗生素的標(biāo)記基因(如 賦予對(duì)卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptii基因，賦予對(duì)除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，賦予對(duì)抗生素潮霉素抗性的hph基因，和賦予對(duì)氨甲喋呤抗性的dhfr基因，賦予對(duì)草甘磷抗性的epsps基因)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等(如抗除莠劑基因)、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。

上述與oshsd1相關(guān)的生物材料在調(diào)控植物蠟質(zhì)含量中的應(yīng)用中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。

上述與oshsd1相關(guān)的生物材料在調(diào)控植物蠟質(zhì)含量中的應(yīng)用中，所述微生物可為酵母、細(xì)菌、藻或真菌，如農(nóng)桿菌。所述農(nóng)桿菌可為農(nóng)桿菌eha105。

上述與oshsd1相關(guān)的生物材料在調(diào)控植物蠟質(zhì)含量中的應(yīng)用中，所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因植物組織和轉(zhuǎn)基因植物器官均不包括繁殖材料。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，oshsd1的編碼基因通過(guò)含有oshsd1的編碼基因的表達(dá)盒的重組載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌eha105中。所述重組載體為將pcambia2300的bamhi和xhoi識(shí)別序列間的dna替換為序列3所示的dna分子得到的重組載體pcambia2300-oshsd1。pcambia2300-oshsd1表達(dá)序列1所示的油體相關(guān)蛋白(即oshsd1)。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了oshsd1或所述生物材料在培育蠟質(zhì)含量降低植物或制備降低植物蠟質(zhì)含量產(chǎn)品中的應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了培育蠟質(zhì)含量降低的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括向受體植物中導(dǎo)入下述1)或2)得到轉(zhuǎn)基因植物；

1)oshsd1的編碼基因；

2)含有oshsd1的編碼基因的表達(dá)盒；

所述轉(zhuǎn)基因植物與所述受體植物相比蠟質(zhì)含量降低。

上述方法中，所述oshsd1的編碼基因可為b1)所述核酸分子；

所述表達(dá)盒可為b2)所述表達(dá)盒。

在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述oshsd1的編碼基因通過(guò)含有所述oshsd1的編碼基因表達(dá)盒的oshsd1基因重組表達(dá)載體導(dǎo)入受體植物中。

上述方法中，其中所述oshsd1的編碼基因可先進(jìn)行如下修飾，再導(dǎo)入受體植物中，以達(dá)到更好的表達(dá)效果：

1)根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行修飾和優(yōu)化，以使基因高效表達(dá)；例如，可根據(jù)受體植物所偏愛(ài)的密碼子，在保持本發(fā)明所述oshsd1的編碼基因的氨基酸序列的同時(shí)改變其密碼子以符合植物偏愛(ài)性；優(yōu)化過(guò)程中，最好能使優(yōu)化后的編碼序列中保持一定的gc含量，以最好地實(shí)現(xiàn)植物中導(dǎo)入基因的高水平表達(dá)，其中g(shù)c含量可為35％、 多于45％、多于50％或多于約60％；

2)修飾鄰近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻譯有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列進(jìn)行修飾；

3)與各種植物表達(dá)的啟動(dòng)子連接，以利于其在植物中的表達(dá)；所述啟動(dòng)子可包括組成型、誘導(dǎo)型、時(shí)序調(diào)節(jié)、發(fā)育調(diào)節(jié)、化學(xué)調(diào)節(jié)、組織優(yōu)選和組織特異性啟動(dòng)子；啟動(dòng)子的選擇將隨著表達(dá)時(shí)間和空間需要而變化，而且也取決于靶物種；例如組織或器官的特異性表達(dá)啟動(dòng)子，根據(jù)需要受體在發(fā)育的什么時(shí)期而定；盡管證明了來(lái)源于雙子葉植物的許多啟動(dòng)子在單子葉植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，選擇雙子葉植物啟動(dòng)子用于雙子葉植物中的表達(dá)，單子葉植物的啟動(dòng)子用于單子葉植物中的表達(dá)；

4)與適合的轉(zhuǎn)錄終止子連接，也可以提高本發(fā)明基因的表達(dá)效率；例如來(lái)源于camv的tml，來(lái)源于rbcs的e9；任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可以與本發(fā)明基因進(jìn)行連接；

5)引入增強(qiáng)子序列，如內(nèi)含子序列(例如來(lái)源于adhl和bronzel)和病毒前導(dǎo)序列(例如來(lái)源于tmv,mcmv和amv)。

所述oshsd1基因重組表達(dá)載體可通過(guò)使用ti質(zhì)粒，植物病毒栽體，直接dna轉(zhuǎn)化，微注射，電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞(weissbach,1998，methodforplantmolecularbiologyviii,academypress,newyork,pp.411-463；geisersonandcorey,1998,plantmolecularbiology(2ndedition).)。

上述方法中，所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述oshsd1的編碼基因轉(zhuǎn)化目的植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細(xì)胞。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了降低植物蠟質(zhì)含量的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品含有oshsd1或所述生物材料。

上述產(chǎn)品可以以oshsd1或所述生物材料作為活性成分，還可以將oshsd1或所述生物材料與其它可以降低植物蠟質(zhì)含量的物質(zhì)進(jìn)行組合得到的組合物作為活性成分。

本發(fā)明中，所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物具體可為禾本科植物，如水稻(oryzasatival.)。

本發(fā)明中，所述蠟質(zhì)含量可為長(zhǎng)鏈脂肪酸及其衍生物的含量，如脂肪酸、鏈烷烴和/或酯類的含量。所述蠟質(zhì)含量可為葉片蠟質(zhì)含量。

實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的oshsd1及其編碼基因可以降低植物葉片中蠟質(zhì)的含量：將oshsd1基因?qū)胧荏w植物中得到的轉(zhuǎn)基因植物蠟質(zhì)組分總含量為受體植物的0.67 倍，差異達(dá)到顯著水平，表明，oshsd1基因可以降低水稻葉片中的蠟質(zhì)含量；將oshsd1基因?qū)胧荏w植物中得到的轉(zhuǎn)基因植物的c16、c18、c26、c28與c30脂肪酸含量分別為受體植物的0.41、0.44、0.34、0.25和0.41倍，與受體植物相比，轉(zhuǎn)基因植物中的c16、c18、c26、c28與c30脂肪酸均有極顯著的降低，表明，oshsd1基因可以降低水稻葉片蠟質(zhì)中的脂肪酸含量。

附圖說(shuō)明

圖1為水稻突變體oshsd1中oshsd1基因的基因組dna與日本晴的差異。其中，wt表示日本晴。

圖2為t1代轉(zhuǎn)oshsd1基因oshsd1的鑒定結(jié)果。其中，marker為分子量標(biāo)準(zhǔn)，oshsd1表示轉(zhuǎn)基因受體植物，oshsd1-c1、oshsd1-c5和oshsd1-c6分別表示三個(gè)t1代轉(zhuǎn)oshsd1基因oshsd1株系。

圖3為oshsd1基因的亞細(xì)胞定位結(jié)果。比例尺為4μm

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中的水稻突變體oshsd1為將日本晴中的oshsd1基因敲除得到的突變體，oshsd1來(lái)源于國(guó)家作物種質(zhì)庫(kù)，統(tǒng)一編號(hào)為gd-00127。其中，oshsd1基因的基因組dna定位在第11號(hào)染色體上分子標(biāo)記m8和m9間，分子標(biāo)記m8為利用引物tgcgatgatcacctgcatac和ggtgttaccaaccgggatta對(duì)日本晴基因組進(jìn)行擴(kuò)增得到的pcr產(chǎn)物，分子標(biāo)記m9為利用引物gcgtgcgccttacaaatta和gttttgcaattgtcgtcgtg對(duì)日本晴基因組進(jìn)行擴(kuò)增得到的pcr產(chǎn)物，分子標(biāo)記m8和m9位于同一bac克隆osjnbb0019e05上，物理距離約為16.9kb。oshsd1基因的基因組dna包含六個(gè)外顯子與五個(gè)內(nèi)含子，與日本晴相比，水稻突變體oshsd1中oshsd1基因的基因組dna的第五個(gè)外顯子上存在一個(gè)單堿基的突變和三個(gè)堿基的缺失(圖1)。

實(shí)施例1、oshsd1可以調(diào)控水稻葉片中蠟質(zhì)的含量

本實(shí)施例提供了來(lái)源于日本晴(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院國(guó)家種質(zhì)庫(kù))的油體相關(guān)蛋白及其編碼基因(即oshsd1基因)，油體相關(guān)蛋白的名稱為oshsd1，油體相關(guān)蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示，oshsd1基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示，oshsd1基因的基因組序列如序列3所示。序列3中，序列3的第3442-3639位、第6939-7131位、第8110-8195位、第8720-8851位、第9527-9691位和第9994-10284 位分別為oshsd1基因的六個(gè)外顯子的序列；序列3的第1-3204位為啟動(dòng)子的序列。

1、轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建

1.1重組載體和重組農(nóng)桿菌的構(gòu)建

將載體pcambia2300的ecori與psti識(shí)別序列間的片段替換為序列3所示的dna分子，得到重組載體，將該重組載體命名為pcambia2300-oshsd1。pcambia2300-oshsd1與pcambia2300的差別僅在于：pcambia2300-oshsd1為將pcambia2300的bamhi和xhoi識(shí)別序列間的dna替換為序列3所示的dna分子得到的重組載體。pcambia2300-oshsd1表達(dá)序列1所示的油體相關(guān)蛋白(即oshsd1)。

將pcambia2300-oshsd1導(dǎo)入農(nóng)桿菌eha105菌株中，得到含有pcambia2300-oshsd1重組農(nóng)桿菌，將其命名為eha105-pcambia2300-oshsd1；將載體pcambia2300導(dǎo)入農(nóng)桿菌eha105菌株中，得到含有載體pcambia2300的重組農(nóng)桿菌，將其命名為重組農(nóng)桿菌eha105-pcambia2300。

1.2轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建

將步驟1.1的eha105-pcambia2300-oshsd1菌株轉(zhuǎn)化水稻突變體oshsd1，具體方法為：

(1)28℃培養(yǎng)eha105-pcambia2300-oshsd116小時(shí)，收集菌體，并稀釋到n6液體培養(yǎng)基(sigma公司，c1416)中至濃度為od600≈0.5，獲得菌液；

(2)將培養(yǎng)至一個(gè)月的水稻突變體oshsd1成熟胚胚性愈傷組織與步驟(1)的菌液混合侵染30min，濾紙吸干菌液后轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基(n6固體培養(yǎng)基，sigma公司)中，24℃共培養(yǎng)3天；

(3)將步驟(2)共培養(yǎng)后的愈傷組織接種在n6固體篩選培養(yǎng)基1(n6固體篩選培養(yǎng)基1為向n6固體培養(yǎng)基中加入卡那霉素得到的卡那霉素濃度為100mg/l的培養(yǎng)基)上24℃培養(yǎng)16天進(jìn)行第一次篩選；

(4)挑取步驟(3)第一次篩選后的健康的愈傷組織轉(zhuǎn)入上述n6固體篩選培養(yǎng)基1上24℃下培養(yǎng)進(jìn)行第二次篩選，每15天繼代一次；

(5)挑取步驟(4)第二次篩選后的健康的愈傷組織轉(zhuǎn)入n6固體篩選培養(yǎng)基2(n6固體篩選培養(yǎng)基2為向n6固體培養(yǎng)基中加入卡那霉素得到的卡那霉素濃度為50mg/l的培養(yǎng)基)上24℃下培養(yǎng)進(jìn)行第三次篩選，每15天繼代一次；

(6)挑取步驟(5)得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入水稻分化培養(yǎng)基上24℃下進(jìn)行分化，得到分化成苗的t0代轉(zhuǎn)oshsd1基因oshsd1，培養(yǎng)t0代轉(zhuǎn)oshsd1基因oshsd1并收獲其種子，得到t1代轉(zhuǎn)oshsd1基因oshsd1種子，培養(yǎng)t1代轉(zhuǎn)oshsd1基因oshsd1種子，得到t1代轉(zhuǎn)oshsd1基因oshsd1。

按照上述步驟(1)-(6)的方法，將eha105-pcambia2300-oshsd1替換為 eha105-pcambia2300，其他步驟均不變，得到t1代轉(zhuǎn)空載體oshsd1。

利用引物5′-aaaattttggaacgaatttttca-3′和5′-tatcatgcgatcataggcgtctc-3′對(duì)t1代轉(zhuǎn)oshsd1基因oshsd1進(jìn)行鑒定，用oshsd1作為陰性對(duì)照，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，t1代轉(zhuǎn)oshsd1基因oshsd1中能擴(kuò)增出大小約1600bp的目的條帶。

2、轉(zhuǎn)基因植物與突變體的表型鑒定

分別將水稻突變體oshsd1、t1代轉(zhuǎn)oshsd1基因oshsd1和t1代轉(zhuǎn)空載體oshsd1在正常條件下進(jìn)行培養(yǎng)，利用氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀分別測(cè)定各水稻葉片的蠟質(zhì)組分(脂肪酸(fattyacids)、伯醇(primaryalcohols)、鏈烷烴(alkanes)和酯類(esters))，結(jié)果如表2所示。

利用氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定水稻葉片蠟質(zhì)組分，具體采用島津的氣質(zhì)聯(lián)用工作站進(jìn)行。檢測(cè)條件如下：氣相-質(zhì)譜檢測(cè)器(shimadzu,gcms-qp2010,japan)，毛細(xì)管柱為hp-1ms(agilent,america)低流失柱，型號(hào)為30m×0.32mm×0.25μm，以1.2mlmin^-1的氦氣為載氣，柱箱溫度50℃，進(jìn)樣口溫度250℃，上樣1μl。升溫程序?yàn)椋?0℃保持2min，然后以20℃min^-1升溫至200℃，在200℃保持2min，隨后以2℃min^-1升溫至320℃，在320℃保持14min。程序運(yùn)行結(jié)束得到各個(gè)樣品的scan峰圖，對(duì)照內(nèi)標(biāo)c24出峰位置，推斷先后出峰的脂肪酸組分，參照標(biāo)樣的峰面積，確定各個(gè)組分的物質(zhì)的量。

表2、水稻葉片中的蠟質(zhì)組分含量(單位:μm/cm²)

結(jié)果顯示，水稻突變體oshsd1和t1代轉(zhuǎn)空載體oshsd1的各蠟質(zhì)組分含量基本無(wú)差異，t1代轉(zhuǎn)oshsd1基因oshsd1蠟質(zhì)組分總含量為水稻突變體oshsd1的0.67倍，差異達(dá)到顯著水平。表明，oshsd1基因可以降低水稻葉片中的蠟質(zhì)含量。

結(jié)果顯示，水稻突變體oshsd1和t1代轉(zhuǎn)空載體oshsd1中的各脂肪酸無(wú)顯著差異。t1代轉(zhuǎn)oshsd1基因oshsd1中的c16、c18、c26、c28與c30脂肪酸含量分別為水稻突變體oshsd1轉(zhuǎn)oshsd1基因植株的0.41、0.44、0.34、0.25和0.41倍，與oshsd1相比，t1代轉(zhuǎn)oshsd1基因oshsd1中的c16、c18、c26、c28與c30脂肪酸含量均有極顯著的降低。表明，oshsd1基因可以降低水稻葉片蠟質(zhì)中的脂肪酸含量。

實(shí)施例2、oshsd1基因的亞細(xì)胞定位

將載體pan580(pan580的序列為序列表中序列4)的spe1與xbal識(shí)別序列間的片段替換為序列2所示的dna分子，得到重組載體，將該重組載體命名為pan580-oshsd1-gfp。pan580-oshsd1-gfp表達(dá)序列1所示的油體相關(guān)蛋白與gfp融合得到的融合蛋白質(zhì)，即oshsd1-gfp。

分別將日本晴與擬南芥的葉肉細(xì)胞去細(xì)胞壁，分別得到日本晴原生質(zhì)體與擬南芥原生質(zhì)體。日本晴原生質(zhì)體按照如下方法制備：

(1)選取80粒粳稻日本晴種子，經(jīng)催芽后在密閉的透明塑料盒中，30℃光照培養(yǎng)大約10天左右；

(2)將幼苗莖稈切成1mm大小的節(jié)段，放入三角瓶，加10ml用k3溶液配置的酶解液(含有1.5％的cellulase和0.3％的macerozyme)；然后置于恒溫?fù)u床進(jìn)行酶解(40rpm，28℃)4h；此段時(shí)間內(nèi)需要鏡檢，以觀察酶解狀況；

(3)將酶解液用200目的尼龍膜過(guò)濾，固體沉淀轉(zhuǎn)移新的三角瓶中，加入10ml w5溶液，繼續(xù)恒溫輕搖1h；

(4)搖晃結(jié)束后，轉(zhuǎn)移5ml上述w5溶液至體積為10ml的塑料試管中，1200rpm、離心4min收集原生質(zhì)體用于下一步的轉(zhuǎn)化。

將pan580-oshsd1-gfp用peg介導(dǎo)方法分別轉(zhuǎn)化日本晴原生質(zhì)體與擬南芥原生質(zhì)體中后進(jìn)行培養(yǎng)。觀察之前，用1mg/ml尼羅紅(油體marker)對(duì)轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體染色10min，然后用w5溶液洗3次。觀察融合蛋白質(zhì)的定位情況如圖3所示。結(jié)果顯示，融合蛋白質(zhì)定位在油體上。轉(zhuǎn)化程序如下：

(1)先加10μg質(zhì)粒dna(pan580-oshsd1-gfp)，再輕柔加入200μl的重懸的原生質(zhì)體，接著緩慢加入220μl的40％濃度peg4000溶液，輕柔混勻，室溫靜置10-20min；

(2)加入1mlw5溶液，混勻，150g離心3min，并收集原生質(zhì)體；

(3)用1mlk3溶液重懸原生質(zhì)體，28℃、黑暗條件下過(guò)夜培養(yǎng)；

(4)使用zeisslsm700激光共聚焦顯微鏡觀察熒光。