本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的，本發(fā)明涉及一種馬鏈球菌獸疫亞種保護(hù)性抗原sec_205及其制備方法。

背景技術(shù)：

鏈球菌是一種常見的致病菌，根據(jù)細(xì)胞壁多糖抗原不同，可分為a、b、c…、v(缺i和j)20個(gè)群，其中a群鏈球菌(groupastreptococci,gas)主要對(duì)人致病，其他群主要對(duì)動(dòng)物致病。b群鏈球菌(groupbstreptococci,gbs)和c群鏈球菌(groupcstreptococci,gcs)等群溶血性鏈球菌主要感染家畜和家禽，如gbs主要引起牛乳腺炎和豬膿皰癥；gcs則主要引起馬腺疫以及羊和豬敗血癥。

馬鏈球菌獸疫亞種(streptococcuszooepidemicus,sez)是gcs的一種，為β溶血性鏈球菌，目前國內(nèi)對(duì)于sez的研究還有待進(jìn)一步的深入。sez主要引起敗血癥、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、化膿性關(guān)節(jié)炎，還可引起馬、豬、羊、牛等哺乳動(dòng)物的乳房炎。此外，sez還可以感染人，主要通過接觸感染sez的動(dòng)物、排泄物等或其他日常工作而發(fā)生感染。雖然抗生素被廣泛用于預(yù)防和治療鏈球菌病，但隨之而來的則是耐藥性的產(chǎn)生和獸藥殘留等問題。因此，開發(fā)出效果較好的疫苗既可以解決抗生素濫用的問題，又有利于鏈球菌的防治。目前，對(duì)于sez毒力因素和保護(hù)性抗原的研究較少，從而很難開發(fā)出有效的亞單位疫苗來控制sez對(duì)動(dòng)物的感染。因此提供一種保護(hù)性抗原對(duì)于sez的防治意義重大。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，針對(duì)sez感染及防治問題，本發(fā)明提供了一種馬鏈球菌獸疫亞種保護(hù)性抗原sec_205及其制備方法。

本發(fā)明第一方面提供了一種馬鏈球菌獸疫亞種保護(hù)性抗原sec_205，其特征在于：為sezsec_205重組蛋白，由sesec_205基因編碼，由650個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為70.9kda，氨基酸序列如seqidno.2所示。

本發(fā)明第二方面提供了上述鏈球菌保護(hù)性抗原sec_205的制備方法，包含以下步驟：

s1、pcr擴(kuò)增：使用馬鏈球菌獸疫亞種基因組為模板，使用引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增克隆sesec_205基因；

s2、與載體連接：pcr產(chǎn)物和pet-32a載體通過限制性酶酶切后連接；

s3、轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)：將上述連接好的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，待其生長進(jìn)入指數(shù)生長期，加入iptg后繼續(xù)培養(yǎng)3-5h；

s4、純化：收集細(xì)菌沉淀并重懸，破碎后離心收集上清液，取上清液進(jìn)行純化，獲得純化的重組蛋白。

優(yōu)選的，所述引物為：

正向引物：5’-cccggatccgcggaaacggctactact-3’

反向引物：5’-ctcaagcttgctctggcttaacctca-3’。

更加優(yōu)選的，所述正向引物和反向引物各有1個(gè)酶切位點(diǎn)，分別為bamhi酶切位點(diǎn)和hindiii酶切位點(diǎn)。

本發(fā)明第三方面提供了上述馬鏈球菌獸疫亞種保護(hù)性抗原sec_205在制備鏈球菌疫苗中的應(yīng)用。

本發(fā)明第四方面提供了上述馬鏈球菌獸疫亞種保護(hù)性抗原sec_205制備鏈球菌疫苗的方法，步驟包括：將成功表達(dá)并純化的sezsec_205重組蛋白與免疫佐劑乳化后作為疫苗，sezsec_205重組蛋白濃度為100-200μg/ml。

本發(fā)明的有益效果為：

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過克隆、表達(dá)、純化sec_205重組蛋白，應(yīng)用一系列生物技術(shù)方法和小鼠試驗(yàn)對(duì)sec_205重組蛋白進(jìn)行系統(tǒng)分析。本發(fā)明首先通過pcr技術(shù)獲得目的基因，酶切后與pet-32a載體連接，并使用大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)sec_205重組蛋白，經(jīng)免疫印記分析，該重組蛋白和豬的sez感染康復(fù)血清表現(xiàn)良好的免疫反應(yīng)。

sec_205重組蛋白免疫后可以提供較高的保護(hù)效力，抗sec_205重組蛋白小鼠二免血清對(duì)小鼠有明顯的被動(dòng)免疫保護(hù)，sec_205重組蛋白免疫后的小鼠血清中具有較高的抗體滴度。sec_205重組蛋白抗體可以誘導(dǎo)較高水平的殺菌能力，sesec_205基因在sez感染的小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平高于體外培養(yǎng)的轉(zhuǎn)錄水平。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明，sec_205分布于sez的表面，而粘附抑制試驗(yàn)表明，rsec_205可以明顯減弱sez粘附hep-2細(xì)胞的能力。

附圖說明

圖1.rsec_205的sds-page和免疫印記分析結(jié)果圖。泳道1～3分別是大腸桿菌非誘導(dǎo)、誘導(dǎo)表達(dá)的rsec_205蛋白和ni-nta純化的rsec_205蛋白。泳道4是rsec_205蛋白與sez康復(fù)期血清的免疫印記分析結(jié)果，m為分子蛋白marker。

圖2.表示rsec_205免疫組、陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組的免疫攻毒保護(hù)情況。

圖3.表示sec_205抗體和sez滅活疫苗(陽性對(duì)照組)對(duì)小鼠表現(xiàn)較高的保護(hù)能力，而正常血清(陰性對(duì)照組)不能保護(hù)小鼠。

圖4.表示sec_205在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)結(jié)果。(a)免疫組的sec_205/igg水平顯著高于陰性對(duì)照組的抗體水平。(b)sec_205誘導(dǎo)的產(chǎn)生的抗體反應(yīng)類型中，igg1起主導(dǎo)地位。

圖5.是小鼠全血?dú)⒕芰Ψ治觯瑂ez滅活疫苗血清(陽性對(duì)照組)的殺菌能力最強(qiáng)，而重組蛋白sec_205血清的殺菌能力高于正常血清(陰性對(duì)照組)。

圖6.顯示了定量pcr分析結(jié)果，結(jié)果顯示，sesec_205基因在小鼠體內(nèi)有較高的轉(zhuǎn)錄水平，并且該轉(zhuǎn)錄水平高于體外培養(yǎng)的轉(zhuǎn)錄水平。

圖7.表示流式細(xì)胞分析sec_205分布情況，結(jié)果表明sec_205主要分布于sez表面。

圖8.表示粘附抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果表明sec_205能夠抑制sez對(duì)hep-2細(xì)胞的粘附能力，相對(duì)于對(duì)照組而言，抑制率為30.3％。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的一種馬鏈球菌獸疫亞種保護(hù)性抗原sec_205及其制備方法予以進(jìn)一步說明。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到。

本發(fā)明的實(shí)施例中所用的菌株及其生長條件如下：

菌株采用sezc55138菌株；培養(yǎng)基為添加5％胎牛血清的tsb培養(yǎng)基或者tsa培養(yǎng)基；在37℃震蕩培養(yǎng)約8h，或od600達(dá)到0.6～1.0。

所述tsb培養(yǎng)基、tsa培養(yǎng)基可市場(chǎng)購買得到，或按公知常規(guī)方法自行配置后使用。

本發(fā)明的實(shí)施例中所用的載體為大腸桿菌pet-32a，感受態(tài)細(xì)胞為大腸桿菌bl21。

本發(fā)明實(shí)施例中采用的sezc55138菌株、pet-32a載體和大腸桿菌bl21感受態(tài)三者均為市購產(chǎn)品。

實(shí)施例一

本實(shí)施例提供了一種馬鏈球菌獸疫亞種保護(hù)性抗原sec_205，為sezsec_205重組蛋白，由sesec_205基因(seqidno.1)編碼，由650個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為70.9kda，氨基酸序列如seqidno.2所示。

所述sesec_205基因正向引物有1個(gè)bamhi酶切位點(diǎn)，反向引物有1個(gè)hindiii酶切位點(diǎn)。所述正向和反向引物由ncbi數(shù)據(jù)庫基因組序列(genbankcp001129.1)設(shè)計(jì)而來。

進(jìn)一步的，本實(shí)施例還提供了上述馬鏈球菌獸疫亞種保護(hù)性抗原sec_205的制備方法，具體步驟包括：

pcr擴(kuò)增：使用c55138的基因組為模板，使用下述引物常規(guī)條件下進(jìn)行pcr擴(kuò)增克隆sesec_205基因；

正向引物(seqidno.3)：

5’-cccggatccgcggaaacggctactact-3’；(劃線部分為bamhi酶切位點(diǎn))；

反向引物(seqidno.4)：

5’-ctcaagcttgctctggcttaacctca-3’；(劃線部分為hindiii酶切位點(diǎn))；

與載體連接：pcr產(chǎn)物使用限制性酶酶切后與經(jīng)相同酶切的pet-32a載體連接；

轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)：將上述連接好的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞bl21后，在37℃環(huán)境培養(yǎng)至指數(shù)生長期，加入終濃度1mm的iptg進(jìn)行誘導(dǎo)，在37℃環(huán)境繼續(xù)培養(yǎng)3h；同時(shí)做非誘導(dǎo)對(duì)照試驗(yàn)。

純化：收集菌液，離心后用pbs重懸，經(jīng)高壓1000bar破碎后，離心收集上清，上清液中的目的蛋白經(jīng)過ni-nta層析柱純化后得到純化的重組蛋白。

免疫印記分析：純化后的重組蛋白，使用sez感染康復(fù)豬血清作為一抗，山羊抗豬hrp-igg作為二抗進(jìn)行免疫印記分析。

所述引物是由武漢金開瑞生物工程有限公司合成。所述限制性內(nèi)切酶為bamhi和hindiii。

iptg即異丙基-β-d-硫代半乳糖苷，是β-半乳糖苷酶的活性誘導(dǎo)物質(zhì)?；谶@個(gè)特性，帶有l(wèi)acz基因載體dna以lacz缺失細(xì)胞為宿主進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，它可以作為具有l(wèi)ac或tac等啟動(dòng)子的表達(dá)載體的表達(dá)誘導(dǎo)物使用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：從sezc55138菌株中提取的sesec_205基因(seqidno.1)，由1417個(gè)堿基組成。將sezc55138菌株sesec_205基因克隆后，表達(dá)出了650個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)(seqidno.2)，分子量為70.9kda。比較誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)菌，可以證明成功表達(dá)了目的蛋白，且目的蛋白的條帶大小與預(yù)測(cè)的大小一致。通過ni-nta親和層析的方式獲得純化的重組蛋白，通過westernblot實(shí)驗(yàn)表明，該蛋白與感染sez的康復(fù)期豬血清表現(xiàn)出良好的免疫反應(yīng)性(見圖1)

實(shí)施例二小鼠免疫接種與攻毒試驗(yàn)

本實(shí)施例對(duì)實(shí)施例一所得sezsec_205重組蛋白進(jìn)行小鼠免疫接種與攻毒試驗(yàn)，試驗(yàn)步驟包括：

1、30只6周齡km雌鼠，隨機(jī)分成3組，每組10只；

2、實(shí)驗(yàn)組：50μg純化的rsec_205用montanidegel01pr(seppic，france)佐劑乳化后，腹腔注射免疫第一組小鼠，14天后，以同樣的方式第二次免疫小鼠；

3、陽性對(duì)照組：將c55138滅活后經(jīng)montanidegel01pr(seppic，france)佐劑乳化后，以1×10⁹cfu/ml免疫小鼠，采用腹腔注射的方式，間隔14日后，同樣的方式進(jìn)行二次免疫；

4、陰性對(duì)照組：第二組小鼠腹腔注射經(jīng)montanidegel01pr(seppic，france)佐劑乳化的pbs做對(duì)照；

5、所有小鼠免疫10天后，尾靜脈采血分離血清，然后使用sezc55138菌株(2×10⁵cfu/ml)攻毒；

6、觀察并記錄所有小鼠的生長情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1)陽性對(duì)照組的小鼠基本未表現(xiàn)臨床癥狀，在整個(gè)攻毒期均未出現(xiàn)死亡。

2)陰性對(duì)照組的小鼠在攻毒后第二天即開始出現(xiàn)死亡，存活的小鼠表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，例如被毛零亂，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍，不好動(dòng)等，并在攻毒后6天內(nèi)全部死亡；

3)實(shí)驗(yàn)組的10只小鼠，攻毒后第三天開始出現(xiàn)死亡，存活的小鼠表現(xiàn)出輕微的臨床癥狀，如精神狀態(tài)較差，消瘦，在5天內(nèi)即全部恢復(fù)正常，最終有3只小鼠死亡(見圖2)。

實(shí)施例三、被動(dòng)保護(hù)試驗(yàn)分析

為了證實(shí)保護(hù)是歸功于sec_205特殊的刺激免疫反應(yīng)，用anti-rsec_205小鼠血清被動(dòng)免疫小鼠，然后再實(shí)行攻毒試驗(yàn)。

1、30只6周齡km雌鼠，隨機(jī)分為3組，每組10只；

2、實(shí)驗(yàn)組：用100μlanti-rsec_205二免小鼠血清靜脈注射免疫第一組小鼠；

3、陽性對(duì)照組：用sez滅活疫苗二免小鼠血清靜脈注射第二組小鼠；

4、陰性對(duì)照組：用正常小鼠的血清靜脈注射第三組小鼠；

5、免疫24h后，所有小鼠用sezc55138攻毒(2×10⁵cfu/ml)；

6、觀察并記錄所有小鼠的生長情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1)陽性對(duì)照組小鼠在攻毒試驗(yàn)中全部存活下來；

2)實(shí)驗(yàn)組小鼠在攻毒后有一些臨床表現(xiàn)，如精神萎靡，被毛粗亂，對(duì)刺激反應(yīng)遲緩，但小鼠最終的存活率達(dá)80％。

3)陰性對(duì)照組小鼠則在攻毒后3天內(nèi)全部死亡(見圖3)。

結(jié)果表明sec_205對(duì)小鼠有明顯的被動(dòng)免疫保護(hù)能力。

實(shí)施例四、抗體滴度測(cè)定

血清igg滴度用elisa測(cè)定后，將純化的重組蛋白于4℃過夜包被，將二免10天后的小鼠采血分離血清，梯度倍比稀釋后，每個(gè)稀釋度取100μl加入酶聯(lián)板，37℃反應(yīng)后加入山羊抗鼠igg，用酶標(biāo)儀讀取od值，取od值大于對(duì)照血清平均od值+3倍方差sd(標(biāo)準(zhǔn)差)的血清最低稀釋倍數(shù)作為血清抗體。

試驗(yàn)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組sec_205特異性igg水平明顯高于陰性對(duì)照組(圖4a)。

為了揭示免疫反應(yīng)類型，利用elisa檢測(cè)igg1和igg2a對(duì)亞類反應(yīng)進(jìn)行了評(píng)估。igg1與th2類反應(yīng)相關(guān)，而igg2a與th1類反應(yīng)相關(guān)，該實(shí)驗(yàn)在一定程度上反映了免疫反應(yīng)的類型。

結(jié)果表明rsec_205可以引起特異的免疫反應(yīng)，同時(shí)rsec_205可誘導(dǎo)igg1和igg2a的表達(dá)且igg1>igg2a(圖4b)。

實(shí)施例五、全血?dú)⒕囼?yàn)

為了測(cè)定anti-rsec_205抗體的殺菌活性，采集新鮮健康小鼠血液經(jīng)肝素抗凝，使用anti-rsec_205或sez滅活疫苗免疫前后小鼠血清混合后與sez孵育后進(jìn)行評(píng)估。

1、待sezc55138菌株生長到指數(shù)中期，離心后收集菌體，用pbs調(diào)整細(xì)菌濃度為10⁴cfu/ml；

2、陽性對(duì)照組：900μl健康小鼠肝素抗凝全血，與100μlsez滅活疫苗免疫后血清混合后作為陽性對(duì)照；

3、陰性對(duì)照組：900μl健康小鼠肝素抗凝全血，與100μlsez滅活疫苗免疫前血清混合后作為陰性對(duì)照；

4、實(shí)驗(yàn)組：900μl健康小鼠肝素抗凝全血，與100μlrsec_205免疫后血清混合；

5、分別向各混合液中加入100μlsez菌液，于37℃恒溫?fù)u床中孵育90min；

6、每組取100μl孵育后樣品，并于tsa培養(yǎng)基培養(yǎng)，每組進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，計(jì)算孵化前后存活的細(xì)菌數(shù)量；

7、殺菌率＝[(加入的細(xì)菌數(shù)量-存活的細(xì)菌量)/加入的細(xì)菌數(shù)量]×100％；

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：陰性對(duì)照組殺菌率僅為10.5±1.86％；而陽性對(duì)照組殺菌率為75±4.07％；實(shí)驗(yàn)組殺菌率為57.4±1.25％(見圖5)。

結(jié)果表明：rsec_205抗體可以誘導(dǎo)高水平的殺菌能力。

實(shí)施例六、定量pcr檢測(cè)體內(nèi)誘導(dǎo)基因的表達(dá)水平

為了評(píng)估sezsesec_205基因在小鼠體內(nèi)外的表達(dá)水平，通過熒光定量pcr技術(shù)定量檢測(cè)sesec_205基因體內(nèi)外的轉(zhuǎn)錄水平。

1、體內(nèi)細(xì)菌從感染sez的小鼠脾臟內(nèi)獲得，無菌收集脾臟組織，碾磨后于4℃，850×g離心5min，取上層清液于4℃，15500×g離心5min，沉淀即為脾臟組織內(nèi)的細(xì)菌；體外培養(yǎng)的細(xì)菌待其生長到指數(shù)中期后離心收集沉淀即可；

2、提取細(xì)菌總rna；

3、將rna逆轉(zhuǎn)錄為cdnas，以cdna樣品為模板進(jìn)行定量pcr反應(yīng)，所有反應(yīng)進(jìn)行三個(gè)重復(fù)；

在實(shí)時(shí)熒光定量pcr中，使用下述引物對(duì)sesec_205基因進(jìn)行定量分析：

正向引物(seqidno.5)：5’-gtcggtcagccaatc-3’；

反向引物(seqidno.6)：5’-tcctcgtactttagggtat-3’；

在實(shí)時(shí)熒光定量pcr中，使用下述引物對(duì)16srrna基因進(jìn)行定量分析：

正向引物(seqidno.7)：5’-atccgaactgagattggc-3’；

反向引物(seqidno.8)：5’-cccttatgacctgggcta-3’；

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：sesec_205基因在sez感染的小鼠體內(nèi)的表達(dá)水平比體外培養(yǎng)的表達(dá)水平高很多倍(見圖6)。

實(shí)施例七、流式細(xì)胞術(shù)分析

1、用pbs重懸細(xì)菌，取菌液200μl；

2、加入相應(yīng)的血清200μl，于室溫下孵育45min；

3、5000rpm離心3min，收集細(xì)菌；

4、用pbs/bsa洗3次，加入fitc-山羊抗鼠二抗，室溫下孵育45min；

5、用pbs/bsa洗滌3次，用500μl的pbs重懸，加入到流式細(xì)胞儀中進(jìn)行檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：未染色的細(xì)菌與正常血清孵育后染色的細(xì)菌所激發(fā)的熒光強(qiáng)度基本沒有差別，且均顯著低于sec_205抗體處理細(xì)菌的平均熒光強(qiáng)度，表明sec_205蛋白分布于sez的表面(見圖7)。

實(shí)施例八、hep-2細(xì)胞粘附抑制試驗(yàn)

為檢測(cè)sec_205對(duì)sez粘附hep-2細(xì)胞的影響，通過hep-2細(xì)胞的粘附試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，主要步驟如下：

1、在24孔板中加入含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)細(xì)胞，將其置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待其長至80％左右；

2、使用預(yù)冷的pbs/bsa洗滌細(xì)胞3次；

3、每孔加入200μg/ml的純化的rsec_205孵育2h，相同的細(xì)胞加入200μg/ml的bsa孵育作為對(duì)照組；

4、孵育完成后，用pbs/bsa洗滌3次，然后向各孔中加入1ml5×10⁷cfu/ml的sezc55138株在37℃，5％co2條件下孵育2h；

5、用pbs/bsa洗去沒有粘附的細(xì)菌，然后用1mlpbs(含0.2％的tritonx-100)將細(xì)胞吹散，稀釋后平板計(jì)數(shù)；

6、sec_205對(duì)sez粘附hep-2細(xì)胞的抑制率通過如下公式計(jì)數(shù)：

[1-(sec_205處理的細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)/bsa處理的細(xì)胞的細(xì)菌數(shù))]×100％。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：rsec_205能夠抑制sez對(duì)hep-2細(xì)胞的粘附作用，相對(duì)于對(duì)照組而言，抑制率為30.3％(見圖8)。

在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對(duì)上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任何的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。

盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。

sequencelisting

<110>湖北大學(xué)

<120>一種馬鏈球菌獸疫亞種保護(hù)性抗原sec_205及其制備方法

<130>1

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<170>patentinversion3.3

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<212>dna

<213>馬鏈球菌獸疫亞種（streptococcuszooepidemicus）

<400>1

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<213>馬鏈球菌獸疫亞種（streptococcuszooepidemicus）

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