本發(fā)明屬于植物學(xué)和基因工程領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及ptre1基因在調(diào)控植物耐熱性中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

當今世界氣候變化已經(jīng)成為各國政府及普通民眾日益關(guān)注的熱點問題。諸如兩極冰川融化、卡特里娜颶風、印度洋海嘯、印度熱浪以及中國的南方雨雪冰凍災(zāi)害等災(zāi)害無時無刻不在提醒著我們?nèi)驓夂虻木薮笞兓?。地球作為人類賴以生存的家園，不僅孕育著人類文明，更承載和維持著整個生態(tài)系統(tǒng)，其上的動物、植物、微生物，高山、河流、湖泊、海洋都為人類的生存與發(fā)展提供著必不可少的條件。然而全球氣候變化正在嚴重的威脅著整個地球生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定。許多研究表明，隨著溫度升高，作物中的干物質(zhì)及產(chǎn)量會下降。

對植物尤其是稻類作物而言，溫度的升高首先會影響稻穗的不育率，在開花期高溫會阻止花粉囊裂開和花粉散發(fā)，致使授粉率和谷粒數(shù)量降低，不育率上升，產(chǎn)量下降。溫度升高還會改變作物的生長速率和生育期長度，從而影響產(chǎn)量。溫度升高延長了作物的全年生長期，這對無限生長習(xí)性或多年生作物以及熱量不足的地區(qū)有利，但對生育期短的作物生長不利。溫度升高使作物生長發(fā)育速度加快，生育期縮短。研究表明，作物生長期間氣溫每升高1℃，水稻生育期將縮短7～8天，冬小麥生育期將縮短17天，這就減少了作物光合作用積累干物質(zhì)的時間。由此，夜間溫度升高條件下，玉米、小麥和大豆產(chǎn)量的降低并不能全部歸因于夜間呼吸速率的升高，水分利用效率的降低和生育期的縮短也是導(dǎo)致作物產(chǎn)量下降的原因之一。所以通過植物分子生物學(xué)結(jié)合遺傳學(xué)的方法尋找具有耐熱性狀的基因具有重要的理論意義和現(xiàn)實意義。

新蛋白的合成和已有蛋白的降解控制著植物生命周期中的所有過程，每周約有50％的蛋白通過這種合成-降解循環(huán)進行更新?？茖W(xué)家們很早就開始對控制蛋白合成的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程的機制進行研究，但直到近來才開始認識到蛋白質(zhì)降解的重要性。蛋白降解可有效降解細胞內(nèi)不正常的蛋白從而產(chǎn)生自由的氨基酸供植物的生長發(fā)育及更新。泛素-蛋白酶體降解體系是已知的最重要的蛋白降解體系，在動植物發(fā)育過程中起重要的調(diào)控作用，aaronciechanover，avramhershko和irwinrose也因發(fā)現(xiàn)泛素調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)降解過程而獲得了2004年諾貝爾化學(xué)獎?，F(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)該降解體系基本涉及到植物生命活動的每個方面，包括抵抗逆境和疾病、激素信號調(diào)控、細胞周期控制、胚胎發(fā)育及光形態(tài)建成等。

目前的研究表明，提高蛋白酶體活性可以有效清除熱刺激條件下產(chǎn)生的垃圾蛋白，所以提高蛋白酶體活性可能是一種有效的獲得具有耐熱能力的植物的方法。因此，有必要尋找具有提高蛋白酶體活性的蛋白，并從這些蛋白中篩選具有提高植物耐熱能力的蛋白。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供ptre1基因在調(diào)控植物耐熱性中的應(yīng)用。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種提高植物耐熱能力的方法，所述方法包括：上調(diào)植物中ptre1蛋白的表達。

在一個優(yōu)選兩種，所述的植物是雙子葉植物。

在另一優(yōu)選例中，所述的植物包括：十字花科植物，禾本科植物，茄科植物，大戟科植物。

在另一優(yōu)選例中，所述十字花科植物包括：擬南芥。

在另一優(yōu)選例中，所述的禾本科植物包括：水稻、小麥、玉米。

在另一優(yōu)選例中，所述的茄科植物包括：馬鈴薯、西紅柿。

在另一優(yōu)選例中，所述的大戟科植物包括：木薯。

在另一優(yōu)選例中，所述的ptre1蛋白選自下組：(a)如seqidno:3氨基酸序列的蛋白；(b)將seqidno:3氨基酸序列經(jīng)過一個或多個(如1-30個；較佳地1-20個；更佳地1-10個；如5個，3個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或(c)與(a)限定的蛋白序列有80％以上(較佳地90％以上，如95％，98％，99％或更高)同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。

在另一優(yōu)選例中，所述上調(diào)植物中ptre1蛋白的表達包括：將ptre1蛋白的編碼序列轉(zhuǎn)入植物細胞、組織、器官或種子，從而上調(diào)植物中蛋白酶體活性，提高植物耐熱能力。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種ptre1蛋白或其編碼基因用途，用于提高植物耐熱能力。

在一個優(yōu)選例中，所述的ptre1蛋白通過促進植物蛋白酶體活性，從而提高植物耐熱能力。

在另一優(yōu)選例中，，所述的ptre1蛋白選自下組：(a)如seqidno:3氨基酸序列的蛋白；(b)將seqidno:3氨基酸序列經(jīng)過一個或多個(如1-30個；較佳地1-20個；更佳地1-10個；如5個，3個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或(c)與(a)限定的蛋白序列有80％以上(較佳地90％以上，如95％，98％，99％或更高)同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。

在另一優(yōu)選例中，所述的植物是雙子葉植物。

在另一優(yōu)選例中，所述的植物包括：十字花科植物，禾本科植物，茄科植物，大戟科植物。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種ptre1蛋白或其編碼基因用途，用于作為鑒定植物耐熱能力的分子標記。

在一個優(yōu)選例中，若經(jīng)檢測植物組織中ptre1蛋白表達高于一個特定值，則相對而言，所述植物的耐熱能力增強；若經(jīng)檢測植物組織中ptre1蛋白表達低于一個特定值，則相對而言，所述植物的耐熱能力減弱。其中，除非另外說明，所述的“特定值”是指植物中ptre1蛋白表達量的平均值。

本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。

附圖說明

圖1、ptre1基因過量表達擬南芥植株、ptre1突變體以及野生型col在不同溫度下進行處理后的表型分析。標尺＝1cm。

具體實施方式

本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，揭示了一種新的可以調(diào)節(jié)植物耐熱能力的基因，其是ptre1基因。ptre1基因可以提高植物蛋白酶體活性，實現(xiàn)植物品種改良。ptre1基因還可以被應(yīng)用于植物的培育中，選育出具有特定耐熱性狀的品種。

如本文所用，所述的“植物(作物)”包括農(nóng)作物、花卉植物、或林業(yè)植物等。所述的植物可以是：雙子葉植物、單子葉植物、或裸子植物。所述的“植物”包括：十字花科植物，禾本科植物、茄科植物、大戟科植物等。比如，可以包括但不限于：水稻、小麥、玉米、馬鈴薯、木薯等。較佳的，所述的植物是十字花科植物。

本發(fā)明所述的ptre1蛋白還包括ptre1蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的seqidno:3序列的蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的蛋白。本發(fā)明的蛋白片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個(如1-30個；較佳地1-20個；更佳地1-10個；如5個，3個)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的蛋白，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個(如1-30個；較佳地1-20個；更佳地1-10個；如5個，3個)氨基酸殘基中具有取代基團的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白等。根據(jù)本文的定義這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。

任何一種ptre1蛋白的生物活性片段都可以應(yīng)用到本發(fā)明中。在這里，ptre1蛋白的生物活性片段的含義是指作為一種蛋白，其仍然能保持全長的ptre1蛋白的全部或部分功能。通常情況下，所述的生物活性片段至少保持50％的全長ptre1蛋白的活性。在更優(yōu)選的條件下，所述活性片段能夠保持全長ptre1蛋白的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

在本發(fā)明中，術(shù)語“ptre1蛋白”指具有ptre1蛋白活性的seqidno:3序列的蛋白。該術(shù)語還包括具有與ptre1蛋白相同功能的、seqidno:3序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)：若干個(如1-30個；較佳地1-20個；更佳地1-10個；如5個，3個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加或缺失一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在c末端和/或n末端添加或缺失一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括ptre1蛋白的活性片段和活性衍生物。

編碼ptre1蛋白或其保守性變異蛋白的多核苷酸序列(編碼序列)也可以應(yīng)用到本發(fā)明中。編碼成熟ptre1蛋白的編碼區(qū)序列可以與seqidno:1或seqidno:2所示的序列基本上相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有seqidno:3的蛋白質(zhì)，但與seqidno:1或seqidno:2所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。

術(shù)語“編碼基因”可以是包括編碼所述蛋白的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。

上述多核苷酸的變異體也是可用的，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的蛋白或蛋白的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的蛋白的功能。

應(yīng)理解，雖然本發(fā)明的ptre1基因優(yōu)選獲自十字花科植物，但是獲自其它植物的與該ptre1基因高度同源(如具有80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本發(fā)明考慮的范圍之內(nèi)。比對序列相同性的方法和工具也是本領(lǐng)域周知的，例如blast。

本發(fā)明的ptre1蛋白的編碼序列通?？梢杂胮cr擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于pcr擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cdna庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cdna庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列。

包含所述編碼序列的載體，以及用所述的載體或ptre1蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細胞也包括在本發(fā)明中。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含ptre1蛋白編碼序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組dna技術(shù)、dna合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導(dǎo)mrna合成。包含上述的適當編碼序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎允蛊淠軌虮磉_蛋白質(zhì)。

宿主細胞通常是植物細胞。轉(zhuǎn)化植物一般可使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基因槍轉(zhuǎn)化等方法，例如葉盤法、幼胚轉(zhuǎn)化法等；優(yōu)選的是農(nóng)桿菌法。對于轉(zhuǎn)化的植物細胞、組織或器官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得相對于野生型而言性狀發(fā)生改變的植物。

蛋白酶體是在真核生物普遍存在的一種巨型蛋白質(zhì)復(fù)合物。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，ptre1蛋白參與了對于植物體內(nèi)蛋白酶體的調(diào)控作用，并且，其能夠顯著地提高植物的耐熱能力。

因此，ptre1可用于制備具有增強的耐熱能力的轉(zhuǎn)基因植物。

基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了所述的ptre1蛋白或其編碼基因的用途，用于增強植物的耐熱能力，或用于制備具有增強的耐熱能力的轉(zhuǎn)基因植物。

本發(fā)明還涉及ptre1蛋白或其編碼基因的上調(diào)劑及其用途。由于ptre1的上調(diào)劑可提高ptre1的表達和/或提高ptre1的活性等，因此，所述的ptre1的上調(diào)劑也可通過對ptre1的影響來調(diào)節(jié)植物性狀，從而達到改良植物的目的。

任何可提高ptre1蛋白的活性、提高ptre1蛋白的穩(wěn)定性、促進ptre1蛋白的表達、延長ptre1蛋白有效作用時間、或促進ptre1基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作為可用于增強植物的耐熱能力的有效物質(zhì)。

本發(fā)明還涉及一種改良植物的方法，該方法包括提高所述植物中ptre1蛋白的表達或活性。

在得知了所述的ptre1蛋白的用途后，可以采用本領(lǐng)域人員熟知的多種方法來調(diào)節(jié)所述的ptre1蛋白的表達。比如可通過一定的途徑將攜帶ptre1編碼基因的表達單位(比如表達載體或病毒等)遞送到靶點上，并使之表達活性的ptre1蛋白。

作為本發(fā)明的一種實施方式，將ptre1蛋白的編碼基因通過常規(guī)的方法克隆到適當?shù)妮d體中，將所述的帶有外源基因的重組載體導(dǎo)入到可表達所述ptre1蛋白的植物細胞中，使所述的植物細胞表達ptre1蛋白?？赏ㄟ^將所述植物細胞再生成植物，獲得過量表達ptre1蛋白的植物。優(yōu)選的，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將ptre1蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)入植物中。

如本文所用，所述的正向連接是指：ptre1的編碼基因與表達載體的連接是正義的連接，即編碼基因按照5’→3’的方向連接于載體上。通常，ptre1的編碼基因位于表達載體中啟動子的下游，也即啟動子的3’端下游連接該編碼基因的5’端。所述的編碼基因是可操作性地連接到表達載體上的。所述的“操作性連接”或“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性dna序列的某些部分能夠調(diào)節(jié)或控制同一線性dna序列其它部分的活性。例如，如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它就是可操作地連于編碼序列。

可采用任何適當?shù)某Ｒ?guī)手段，包括試劑、溫度、壓力條件等來實施所述的方法。其它增加ptre1表達的方法是本領(lǐng)域周知的。例如，可通過用強啟動子驅(qū)動從而增強ptre1的表達。或者通過增強子來增強該ptre1基因的表達。適用于本發(fā)明方法的強啟動子包括但不限于：35s啟動子、水稻、玉米的ubi啟動子等。

此外，本發(fā)明還涉及利用ptre1蛋白或其編碼基因作為一種基因轉(zhuǎn)化植株后代的追蹤標記。本發(fā)明還涉及利用ptre1蛋白或其編碼基因作為一種分子標記，通過檢測植物中ptre1蛋白的表達情況，鑒定植物的耐熱能力等。

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如j.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。

實施例1、ptre1基因的分離和表型分析

本發(fā)明人在蛋白酶體活性調(diào)節(jié)的研究中，發(fā)現(xiàn)了ptre1基因可以調(diào)控植物耐熱能力。

通過構(gòu)建ptre1過量表達載體轉(zhuǎn)入擬南芥植物獲得ptre1過量表達的植物。

1、構(gòu)建ptre1過量表達載體

載體構(gòu)建方法如下：以擬南芥col的基因組為擴增模板，通過引物p1和引物p2擴增ptre1cdna基因，通過酶切連接的方法插入到載體pcambia1302(該質(zhì)粒自帶gfp編碼序列)的多克隆位點中，獲得ptre1過量表達載體，稱為pcambia1302-ptre1，其可以表達35s驅(qū)動的ptre1-gfp(p35s::ptre1-gfp)。

引物p1：catgccatggcgaattctcagacggtga(seqidno:4)；

引物p2：ggactagttataaaatctgaaccgccg(seqidno:5)。

2、制備轉(zhuǎn)基因植物

采用常規(guī)方法轉(zhuǎn)化pcambia1302-ptre1到gv3101農(nóng)桿菌中，通過花浸染法將基因轉(zhuǎn)入植物中。

轉(zhuǎn)化植物的方法具體如下：根據(jù)cloughandbent(1998)的floraldipping方法進行擬南芥轉(zhuǎn)化。取生長1個月左右的擬南芥植株，去除已經(jīng)開放的花朵和結(jié)實的果莢，轉(zhuǎn)化前1天澆足水。將含有轉(zhuǎn)基因載體pcambia1302-ptre1的農(nóng)桿菌gv3101于28℃培養(yǎng)過夜至od600≈2.0，4500rpm離心10min，菌體沉淀懸浮于新鮮配制的轉(zhuǎn)化液中，至終濃度od600≈0.8。轉(zhuǎn)化時將擬南芥地上部分浸泡于菌液中30-40s，確保全部花苞都被浸沒。用吸水紙吸去多余的液體，將植物平放并用保鮮膜保持濕度，避光過夜。第2天將植物取出，豎直并轉(zhuǎn)移到正常條件下生長收種。

通過潮霉素抗性篩選，獲得ptre1基因過量表達的陽性轉(zhuǎn)基因擬南芥，稱為35s::ptre1-gfp。

實施例2、ptre1基因過量表達的植株的表型分析

本實施例中，檢測ptre1突變體和ptre1基因過量表達轉(zhuǎn)基因植物的表型性狀。

1、擬南芥突變體的建立

為了研究ptre1的生理功能，本發(fā)明人檢索了擬南芥t-dna插入突變體庫(http://signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress)，得到一個可能的t-dna插入突變體salk_034353。經(jīng)種子擴繁、篩選及鑒定，證明插入位置在第一個內(nèi)含子上。后代群體約300株經(jīng)t-dna插入驗證，發(fā)現(xiàn)在含t-dna插入雜合的植株成苗中，除果莢中胚胎發(fā)育異常外其他生長發(fā)育狀態(tài)和野生型沒有明顯差異，但t-dna插入純合植株的發(fā)育明顯異常。

用于鑒定突變體的引物如下：

lba1：tggttcacgtagtgggccatcg(seqidno:6)；

ptre1-rp：aacgtaggcccaaatttgatc(seqidno:7)；

ptre1-lp：ctccacaaaacgaagttccac(seqidno:8)。

2、表型分析

將ptre1基因過量表達擬南芥植株、ptre1突變體以及野生型col在不同溫度下進行培育，觀察生長情況。

具體培養(yǎng)方法如下：用75％的酒精清洗種子后，播種在1/2ms培養(yǎng)基上面，在4℃春化2天后，取出放置于22℃，16小時光照/8小時黑暗的植物培養(yǎng)箱中，2周后，取出培養(yǎng)皿放于42℃或者45℃水浴鍋進行熱刺激處理，2小時或者45分鐘后取出繼續(xù)放置于22℃生長9天，進行拍照分析。

具體表型分析結(jié)果見圖1?？梢姡谡l件下，ptre1基因過量表達擬南芥植株的生長狀況與野生型基本接近，而ptre1突變體生長狀況相對較差。在42℃條件下處理2小時后，野生型與ptre1突變體產(chǎn)生較多黃葉，而ptre1基因過量表達擬南芥植株相對而言產(chǎn)生的黃葉較少。在45℃條件下處理45分鐘后，ptre1突變體枯萎，野生型接近枯萎；而ptre1基因過量表達擬南芥植株產(chǎn)生較多黃葉、仍有部分未發(fā)生枯萎的葉子。

因此，ptre1基因過量表達擬南芥植株具有良好的耐熱能力，而其缺失表達后，植物耐熱能力顯著差。

在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。