玉米組織特異性啟動(dòng)子及其在提高作物種子品質(zhì)中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及啟動(dòng)子，尤其涉及從玉米（Zeamays)中分離的組織特異性啟動(dòng)子，本 發(fā)明還涉及含有該組織特異性啟動(dòng)子的重組植物表達(dá)載體以及重組宿主細(xì)胞，本發(fā)明進(jìn)一 步涉及它們?cè)谔岣咦魑锓N子品質(zhì)、改良作物性狀、培育植物新品種等方面的應(yīng)用，屬于植物 組織特異性啟動(dòng)子的分離及應(yīng)用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 啟動(dòng)子是RNA聚合酶特異性識(shí)別和結(jié)合的DNA序列，是重要的順式作用元件，一般 位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游區(qū)。高等植物基因調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行，啟動(dòng)子控制著基因表 達(dá)的起始時(shí)間和表達(dá)程度，同時(shí)對(duì)所使用的RNA聚合酶類型也起著決定性作用，所以啟動(dòng) 子是理解基因表達(dá)模式和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵，是植物基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的中心。
[0003] 根據(jù)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄模式及功能，可將其分為三類：組成型啟動(dòng)子、組織或器官 特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。目前，在植物基因工程中使用的大多數(shù)為組成型啟動(dòng) 子，使外源目的基因在植物各組織部位高水平表達(dá)，但是，組成型啟動(dòng)子也有諸多缺點(diǎn)， 例如，不能從時(shí)間和空間上有效地調(diào)控目的基因的表達(dá)，過度消耗細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)和能 量（GittinsJR，PellnyTK，HilesER，RosaC，BiricoltiS，etal. (2000)Transgene expressiondrivenbyheterologousribulose-l, 5-bisphosphatecarboxylase/ oxygenasesmall-subunitgenepromotersinthevegetativetissuesofapple(Malus pumilamill.).Planta210:232-240.);大量異源蛋白或代謝產(chǎn)物在植物體內(nèi)積累，打破 植物的代謝平衡，不利于植物生長（RobinsonDJ(1996)Environmentalriskassessment ofreleasesoftransgenicplantscontainingvirus-derivedinserts.Transgenic research5:359-362.);容易引起基因沉默或共抑制現(xiàn)象（KumpatlaSP，Chandrasekharan MB,IyerLM,GuofuL,HallTC(1998)Genomeintruderscanningandmodulationsystems andtransgenesilencing.TrendsinPlantScience3:97-104；MetteMF,Aufsatz ff,vanderffindenJ,MatzkeMA,MatzkeAJ(2000)Transcriptionalsilencingand promotermethylationtriggeredbydouble-strandedRNA.EMBOJ19:5194-5201.)。因 此，科學(xué)家們不斷尋找更為有效的組織或器官特異性啟動(dòng)子來代替組成型啟動(dòng)子，以期更 精確的調(diào)控外源基因的表達(dá)。
[0004] 組織或器官特異性啟動(dòng)子調(diào)控下的基因轉(zhuǎn)錄過程一般只發(fā)生在某些特定的組織 或者器官中。組織或器官特異性表達(dá)啟動(dòng)子可以更加經(jīng)濟(jì)有效的調(diào)控外源基因的表達(dá)，特 異地在特定需要的部位發(fā)揮作用，這樣不僅可以提高外源基因的表達(dá)豐度，而且將生物能 耗降到最低，從而不影響植株的正常生長。
[0005] 玉米（Zeamays)是中國最大的糧食作物，也是重要的轉(zhuǎn)基因作物。玉米組織特異 性啟動(dòng)子可分為根、莖、葉、花、胚、胚乳、果實(shí)、木質(zhì)部、綠色組織等組織或器官特異性啟動(dòng) 子，每一類型的組織特異性啟動(dòng)子都具有一些特殊的功能元件。從玉米中分離獲得組織特 異性啟動(dòng)子，可以利用特異性啟動(dòng)子將目的基因在植物中進(jìn)行特異性的高效表達(dá)，這對(duì)玉 米進(jìn)行分子改良或生產(chǎn)具有特殊用途的新玉米品種等方面有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的之一是提供從玉米（Zeamays)中分離的組織特異性啟動(dòng)子。
[0007] 本發(fā)明目的之二是提供含有上述組織特異性啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體以及含有該 重組表達(dá)載體的重組宿主細(xì)胞。
[0008] 本發(fā)明目的之三是將所述的組織特異性啟動(dòng)子以及含有該組織特異性啟動(dòng)子的 重組表達(dá)載體應(yīng)用于提高作物種子品質(zhì)、改良作物性狀、培育植物新品種等方面。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供了一種從玉米（Zeamays)中分離的全長組織特 異性啟動(dòng)子（P2941)，其多核苷酸序列為（a)、（b)、（c)或（d)所示：
[0010] (a)、SEQIDNO. 1所示的多核苷酸序列；或
[0011] (b)、與SEQIDNO. 1的互補(bǔ)序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件能夠進(jìn)行雜交的多核苷酸，該多 核苷酸仍具有組織特異性啟動(dòng)子的功能；或
[0012] (C)、與SEQIDNO. 1的多核苷酸序列至少有60%以上同源性的多核苷酸序列，且 該多核苷酸具有組織特異性啟動(dòng)子的功能；優(yōu)選的，其與SEQIDNO. 1的多核苷酸序列至少 有80%以上同源性的多核苷酸序列，且該多核苷酸具有組織特異性啟動(dòng)子的功能；更優(yōu)選 的，其與SEQIDNO. 1的多核苷酸序列至少有90%以上同源性的多核苷酸序列，且該多核 苷酸具有組織特異性啟動(dòng)子的功能；最優(yōu)選的，其與SEQIDNO. 1的多核苷酸序列至少有 95%以上同源性的多核苷酸序列，且該多核苷酸具有組織特異性啟動(dòng)子的功能；或
[0013] (d)、在SEQIDNO. 1的基礎(chǔ)上進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的缺失、取代或插入獲得的多 核苷酸變體，該多核苷酸變體包含SEQIDNO. 2序列，且該多核苷酸變體仍具有組織特異性 啟動(dòng)子的功能。
[0014] 本發(fā)明進(jìn)一步將SEQIDNO. 1所示的多核苷酸序列從5'端逐漸刪除部分序列得到 多個(gè)截短的序列，將截短后的各個(gè)序列分別連接到帶有報(bào)告基因的表達(dá)載體上驗(yàn)證截短后 的序列是否具有組織特異啟動(dòng)子的功能；本發(fā)明通過功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)確定，將SEQIDNO. 1的 5'端核苷酸序列截短后的SEQIDNO. 2所示的192bp的序列（為-192 -+1之間的片段） 能夠驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因在玉米種子胚中進(jìn)行特異性的表達(dá)，說明SEQIDNO. 2所示的192bp的 序列仍具有組織特異性啟動(dòng)子的功能。
[0015] 本發(fā)明進(jìn)一步將SEQIDNO. 1所示啟動(dòng)子從5'端開始逐漸刪除得到兩個(gè)截短的 啟動(dòng)子片段P2941_Q和P2941_7，其長度分別為 〇. 4kb(SEQIDNO. 3)和 0. 16kb(SEQIDNO. 4); 根據(jù)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化玉米試驗(yàn)結(jié)果可見，啟動(dòng)子缺失片段P2941<(SEQIDNO. 3)仍具有在胚組織中 啟動(dòng)報(bào)告基因表達(dá)的功能，但其活性較全長啟動(dòng)子（SEQIDNO. 1)明顯下降，說明啟動(dòng)子缺 失片段P2941KI(SEQIDNO. 3)是一個(gè)啟動(dòng)子活性降低的胚組織特異性啟動(dòng)子；啟動(dòng)子缺失片 段P2941_7(SEQIDNO. 4)仍具有在胚組織中啟動(dòng)報(bào)告基因表達(dá)的功能，但其活性較全長啟動(dòng) 子己941(5￡〇IDN0.1)明顯下降，說明啟動(dòng)子缺失片段P2941_7(SEQIDN0.4)也是一個(gè)啟動(dòng) 子活性明顯降低的胚組織特異性啟動(dòng)子，但是在機(jī)械損傷誘導(dǎo)下在營養(yǎng)組織表現(xiàn)出誘導(dǎo)表 達(dá)的特性。
[0016] 因此，本發(fā)明提供了一種將SEQIDNO. 1所示的全長組織特異啟動(dòng)子截短后的組 織特異性啟動(dòng)子，其多核苷酸序列為（a)、（b)、（c)或（d)所示：
[0017] (a)、SEQIDNO. 2所示的多核苷酸序列；或
[0018](b)、與SEQ ID NO. 2的互補(bǔ)序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件能夠進(jìn)行雜交的多核苷酸，該多 核苷酸仍具有組織特異性啟動(dòng)子的功能；或
[0019](c)、與SEQIDNO. 2的多核苷酸序列至少有60%以上同源性的多