從館藏干制麻蠅標本中擴增dna條碼全長方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種從館藏干制麻蠅標本中擴增DNA條形碼 全長的方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] DNA條形碼技術(shù)是近幾年新興的利用生物本身普遍具有的一段保守性適中、容易 獲得的基因片段作為標準，建立在現(xiàn)代先進的DNA擴增、測序和比對技術(shù)基礎之上的一種 物種鑒定手段。與傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定相比，利用DNA條形碼進行物種鑒定具有以下優(yōu)勢：對 物種的鑒定將不再受物種發(fā)育狀態(tài)的限制，克服了卵、幼蟲、蛹等無法直接鑒定的缺點；對 鑒定者的經(jīng)驗和專業(yè)背景知識大大降低，減少主觀判斷的干擾；物種的鑒定更加準確快速， 數(shù)據(jù)共享使構(gòu)建生物全球分子鑒定平臺成為可能。但由于國際上現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)有 限，往往得到的種類的DNA條形碼數(shù)據(jù)在數(shù)據(jù)庫中不能找到相匹配的數(shù)據(jù)，達不到種類鑒 定的目的。
[0003] 新采集的標本由于缺少相應的分類專家得不到準確的鑒定，環(huán)境的改變和人為的 干擾，致使許多過去的常見種變成了瀕危種甚至滅絕。博物館中儲存著大量的昆蟲標本，多 數(shù)是干制標本，經(jīng)專家鑒定過的館藏干制昆蟲標本，尤其是物種定名用的模式標本是獲取 準確種類DNA條形碼數(shù)據(jù)的重要來源，但由于館藏干制昆蟲標本儲存年代久，長期處在高 防蟲和防霉化學試劑的環(huán)境中，DNA降解嚴重，用一般的擴增方法，很難獲得長片段。動物 中尤其是昆蟲等節(jié)肢動物作為DNA條形碼的C0I片段長度包括引物在內(nèi)為710bp左右，在 保存時間過長，干制昆蟲標本中的DNA降解嚴重的情況下，一般不能或者很難擴增出DNA條 形碼全長的序列。因此很有必要研制一種有效的可以擴增DNA條形碼全長的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的首要目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足之處，提供一種從館藏干制麻蠅 標本中擴增DNA條形碼全長的方法。該方法速度快且重復性好。
[0005] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種從館藏干制麻蠅標本中擴增DNA條形碼全長的 試劑盒。
[0006] 本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：一種從館藏干制麻蠅標本中擴增DNA條形碼全長 的方法，包含以下步驟：
[0007](1)設計PCR所需要引物，如下：
[0008] LC01728 :5'-TCCTCGAATAAATAATATAAGTTTT-3' ；
[0009] HC01856 :5'-GATAAACAGTTCATCCTGTTCCAGC-3' ；
[0010] LC01490 :5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3' ；
[0011]HC02198:5,-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3，；
[0012] (2)提取館藏干制麻蠅標本的基因組DNA;
[0013] ⑶擴增：
[0014] ①以步驟⑵得到的基因組DNA為模板，以LC01490為上游引物，HC01856為下游 引物，進行PCR，得到片段A;
[0015] ②以步驟⑵得到的基因組DNA為模板，以LC01728為上游引物，HC02198為下游 引物，進行PCR，得到片段B;
[0016] (4)測序：將步驟⑶得到的片段A和片段B分別克隆到克隆載體上，測序；拼接， 得到從館藏干制麻蠅標本的DNA條形碼全長；
[0017]所述的麻蠅包括玲足鬃麻蠅（Sarcorohdendorfiaantilope)、擬玲足鬃麻蠅 (Sarcorohdendorfiainextricata)、白頭亞麻妮(Parasarcophagaalbiceps)、海南 刺麻妮（Sinonipponiahainanensis)、曲突鉤麻妮（Harpagophallakempi)、掠尾別 麻蠅（Boettcheriscaperegrina)、郭氏歐麻蠅（Heteronychiaquoi)、擬東方辛麻蠅 (Seniorwhiteareciproca)、黑尾黑麻妮（Helicophagellamelanura)和盤突緬麻妮 (Burmanomyiapattoni)等等；
[0018] 步驟（2)中所述的基因組DNA優(yōu)選通過動物組織基因組DNA提取試劑盒提取得 到；
[0019] 為了提高PCR所得的產(chǎn)物的準確性，在PCR過程中最好使用高保真酶；步驟（3)中 所述的PCR的反應體系優(yōu)選為：5倍PhusionHF緩沖液10iil，10mMdNTPs1iil，正向引 物和反向引物各lul，Phusion超保真DNA聚合酶0. 5iil，基因組DNA2iil，用ddH20補足 50u1 ；
[0020] 步驟⑶中所述的PCR的條件優(yōu)選為：94 °C變性5min;94°C40S、54°C40S、 72°Clmin，29 個循環(huán)；72°C延伸 10min;
[0021] 步驟（4)中所述的克隆載體優(yōu)選為T載體。
[0022] -種從館藏干制麻蠅標本中擴增DNA條形碼全長的試劑盒，包含如下兩對引物：
[0023]第一對：
[0024] LC01490 :5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3' ；
[0025] HC01856 :5'-GATAAACAGTTCATCCTGTTCCAGC-3' ；
[0026]第二對：
[0027]HC02198 :5,-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3，；
[0028] LC01728 :5'-TCCTCGAATAAATAATATAAGTTTT-3' ；
[0029] 所述的試劑盒還包含PCR擴增所用的試劑，如酶、dNTP、反應緩沖液；
[0030] 所述的酶優(yōu)選為Phusion超保真DNA聚合酶。
[0031] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：
[0032] 本發(fā)明為從館藏干制麻蠅標本中擴增DNA條形碼全長提供了一種方法。本發(fā)明通 過引物的設計與篩選，得到通用的一組引物，所建立的體系可重復性高，經(jīng)多次試驗穩(wěn)定性 好。其擴增結(jié)果與直接擴DNA條形碼全長相比，擴增效率高，具有更大的可靠性和適應性， 提高了擴增效率，從而為從館藏干制麻蠅標本中擴增DNA條形碼全長提供了一種可靠的方 法。
【具體實施方式】
[0033]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0034] 實施例1
[0035] (1)根據(jù)Genbank中發(fā)表的一部分麻蠅種類的C0I序列（序列號JQ413458、 JQ413452、JQ582102、JQ582072、JQ413461、JQ582073、JQ582071、JQ582069、JN231272)為依 據(jù)，進行序列分析，設計如下引物，委托大連寶生物技術(shù)有限公司合成DNA條形碼序列的擴 增引物。
[0036] LC01490 :5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3' ；
[0037] LC01637 :5'-ATTGTTACAGCTCATGCTTTTATTA-3' ；
[0038] LC01728 :5'-TCCTCGAATAAATAATATAAGTTTT-3' ；
[0039] HC01856 :5'-GATAAACAGTTCATCCTGTTCCAGC-3' ；
[0040]HC01995 :5'-AATACCTGTTGATCGTATATTAAT-3'；
[0041]HC02198 :5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'。
[0042] (2)以1960年的玲足鬚麻妮（來自中山出入境檢驗檢疫局媒介生物標本室）的一 條后腿為材料，用動物組織基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN;編號：DP304)中的裂解液浸 泡5個小時以上，用動物組織基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。以LC01490和HC01856 為引物，經(jīng)？〇?，反應體系為：5倍？111^〇11冊緩沖液1〇111，1〇1111(1階1^1111，正向引物 和反向引物（濃度為20pmol/L)各liil，Phusion超保真DNA聚合酶0? 5iU，基因組DNA 2iil，用ddH20 補足 50iil;PCR的條件為：94°C變性 5min;94°C40S、54°C40S、72°Clmin，29 個循環(huán)；72°C延伸lOmin;使用質(zhì)量體積比1%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行分離，對 目的條帶進行切膠，使用瓊脂糖凝膠DNA回收純化試劑盒進行純化，將目的基因克隆到質(zhì) 粒pGMT(TIANGEN;編號：VT202,按說明書操作），經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，將轉(zhuǎn) 化液涂布含100Ug/ml氨芐青霉素的LB平板上，通過引物LC01490和HC01856對菌落進行 PCR，篩選得到陽性克隆，抽提得到重組載體pGMT-lA，送測序，得到片段1A的序列如下：
[0043]AACTTTATATTTTATTTTCGGGGCCTGAGCAGGAATAGTAGGAACTTCACTAAGAATTCTTATTCGAG CAGAATTAGGTCACCCAGGGGCACTAATTGGTGATGATCAAATTTATAATGTAATTGTTACAGCACATGCCTTTAT TATAATTTTCTTTATAGTTATACCAATCATAATTGGAGGATTTGGAAATTGACTAGTACCTATTATGTTAGGAGC TCCAGATATAGCTTCTCCTCGAATAAATAATATAAGTTTTTGACTTTTACCCCCAGCATTAACACTTCTTCTAGT AAGTAGTATAGTAGAAAATGGA。
[0044] (3)以HC02198和LC01728為引物，PCR的反應條件和體系同步驟（2)，擴增獲 得PCR片段1B，將片段1B克隆到質(zhì)粒pGMT(克隆轉(zhuǎn)化步驟同步驟（2))，得到重組載體 pGMT-lB。片段1B的序列如下：
[0045]AAAAAGATGTTGGTATAAAATTGGGTCTCCTCCTCCTGCAGGATCAAAAAATGAAGTATTAATATTTCG GTCAGTTAATAATATAGTAATTGCTCCGGCAAGTACGGGTAAAGAAAGTAATAAAAGTAAGGCTGTAATTACTACTG ATCAAACGAATAGAGGCATTCGATCAAAAGTGATACCTGTTGATCGTATATTAATAACTGTAGTAATAAAGTTTACA GCTCCTAAAATTGAGGAAATTCCAGCTAGATGTAGGGAAAAAATAGCTAAGTCAACTGAAGCTCCTCCATGAGCAAT ATTAGATGATAGGGGAGGGTAAACAGTTCATCCTGTTCCAGCTCCATTTTCTACTATACTACTTACTAGAAGAAGTG TTAATGCTGGGGGTAAAAGTCA。
[0046] (4)拼接序列1A和序列1B，得到1960年的羚足鬃麻蠅的DNA條形碼序列全長，序 列如下：
[0047]AACTTTATATTTTATTTTCGGGGCCTGAGCAGGAATAGTAGGAACTTCACTAAGAATTCTTATTCGAGC AGAATTAGGTCACCCAGGGGCACTAATTGGTGATGATCAAATTTATAATGTAATTGTTACAGCACATGCCTTTATTA TAATTTTCTTTATAGTTATACCAATCATAATTGGAGGATTTGGAAATTGACTAGTACCTATTATGTTAGGAGCTCCA GATATAGCTTCTCCTCGAATAAATAATATAAGTTTTTGA