專利名稱：檢測(cè)脫氧核糖核酸的單核苷酸多態(tài)性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)脫氧核糖核酸的單核苷酸性質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列的多態(tài)性?；蛘{(diào)控區(qū)和編碼區(qū)的SNPs比其它區(qū)位上的SNPs更可能造成功能上的變化。分型這些雙等位基因標(biāo)志給鑒定致病基因、建立藥物靶向治療以及個(gè)體化給藥提供了很大的可能。因此，無(wú)論是學(xué)術(shù)界還是商業(yè)界對(duì)建立一種快速、敏感而經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)SNP的方法都有濃厚的興趣。
許多經(jīng)典的方法，如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)分析和凝膠遷移率變動(dòng)分析法等，因受繁瑣的操作程序、突變位點(diǎn)以及靶序列構(gòu)象的限制而限制了應(yīng)用范圍。這些方法所需的檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，并且需要有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)員來(lái)分析最終結(jié)果。近來(lái)，出現(xiàn)了許多新的快速分型SNP的技術(shù)。如基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)原理的單管快速SNP檢測(cè)法、基于等位基因特異性引物延伸并且利用綠色和紅色熒光標(biāo)記的單核苷酸基因分型法、利用淬滅基團(tuán)延伸(Quencher extension，QEXT)實(shí)時(shí)閉管檢測(cè)SNP法、雙聯(lián)蝎型引物分析SNP技術(shù)、固相支持SNP分型法、使用核酸外切酶III/核酸酶S1/PNA體系直接正向檢測(cè)SNP法、孿生探針?lè)ā⒍鄳B(tài)核酸探針偶聯(lián)聚合物檢測(cè)法以及利用全程TaqMan實(shí)時(shí)定量數(shù)據(jù)自動(dòng)基因分型法等。然而，以上所提及的技術(shù)需要昂貴的試劑，并且在中國(guó)，除了TaqMan探針及分子信標(biāo)探針之外，極少有公司修飾其它類型的探針(包括FRET探針)。上述方法中，如酶切法等時(shí)間較長(zhǎng)、標(biāo)記范圍也較小。
還有采用分子信標(biāo)探針進(jìn)行SNP檢測(cè)的方法采用人工合成的熒光標(biāo)記寡核苷酸探針，該探針的兩端由5～7個(gè)與靶序無(wú)關(guān)的互補(bǔ)堿基組成，一端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，另一端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。這樣在游離狀態(tài)下，熒光探針兩端互補(bǔ)折疊成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，寡核苷酸探針的熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)在空間非常接近，此時(shí)熒光報(bào)告基團(tuán)經(jīng)激發(fā)后發(fā)射出的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，不產(chǎn)生熒光信號(hào)，表現(xiàn)為熒光淬滅。而當(dāng)探針與靶DNA雜交后，探針的莖環(huán)結(jié)構(gòu)被破壞，淬滅基團(tuán)離開熒光報(bào)告基團(tuán)，經(jīng)激發(fā)后熒光報(bào)告基團(tuán)所產(chǎn)生的熒光信號(hào)向外發(fā)出。因而可以根據(jù)所發(fā)射熒光的情況，判斷是否有堿基突變。但是，這種方法在進(jìn)行探針的設(shè)計(jì)時(shí)，其標(biāo)記的范圍較小。
中國(guó)專利申請(qǐng)200310119928.3公開了一種用熒光共振能量轉(zhuǎn)移而進(jìn)行SNP檢測(cè)的方法，該方法選擇兩種探針，一種探針結(jié)合有熒光團(tuán)供體，另一種探針結(jié)合有熒光團(tuán)受體，在激發(fā)光的照射下，熒光團(tuán)供體受激向熒光團(tuán)受體提供熒光，熒光團(tuán)受體發(fā)出熒光，從而可以根據(jù)熒光團(tuán)受體發(fā)出熒光的變化量來(lái)確定解鏈峰值所對(duì)應(yīng)的溫度值，該溫度值低于解鏈溫度時(shí)則確定目的核酸中存在一單核苷酸多態(tài)性。這種方法中隨著探針的脫落，熒光強(qiáng)度由大變小，而不是由小變大?？膳c探針的寡核苷酸鏈結(jié)合的熒光團(tuán)供體或熒光團(tuán)受體的選取有一定的要求，因而成本較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種成本較低、操作方便、檢測(cè)時(shí)間較短、可供選擇的標(biāo)記范圍較大而成功率較高的檢測(cè)脫氧核糖核酸的單核苷酸多態(tài)性的方法。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是本發(fā)明的檢測(cè)脫氧核糖核酸的單核苷酸多態(tài)性的方法，具有以下步驟①確定要對(duì)某種生物的脫氧核糖核酸的某種基因進(jìn)行檢測(cè)，也就是確定待測(cè)DNA片段，而該待測(cè)DNA片段的一條單鏈上具有第一序列和第二序列，所述的第一序列是指該序列中的某一個(gè)特定核苷酸可能發(fā)生變異的一段核苷酸序列，第二序列是指與第一序列核苷酸相靠近的一段核苷酸序列；②制備可稱為敏感探針的一種寡核苷酸探針、以及制備可稱為錨定探針的另一種寡核苷酸探針；所述敏感探針互補(bǔ)于與待測(cè)DNA片段的第一序列相對(duì)應(yīng)的野生型基因的相應(yīng)DNA片段的相應(yīng)序列、或互補(bǔ)于與待測(cè)DNA片段的第一序列相對(duì)應(yīng)的突變型基因的相應(yīng)DNA片段的相應(yīng)序列，敏感探針的一端僅一端結(jié)合有熒光報(bào)告基團(tuán)或淬滅基團(tuán)；所述錨定探針與待測(cè)DNA片段的第二序列互補(bǔ)，錨定探針的一端僅一端在敏感探針結(jié)合有熒光報(bào)告基團(tuán)時(shí)結(jié)合有淬滅基團(tuán)、在敏感探針結(jié)合有淬滅基團(tuán)時(shí)結(jié)合有熒光報(bào)告基團(tuán)；敏感探針的融解溫度的值低于錨定探針的融解溫度的值；③制備合適的兩個(gè)寡核苷酸引物，該兩個(gè)寡核苷酸引物中的一個(gè)寡核苷酸引物與上述待測(cè)DNA片段的具有第一序列和第二序列的單鏈的一端互補(bǔ)，該兩個(gè)寡核苷酸引物中的另一個(gè)寡核苷酸引物與上述待測(cè)DNA片段的另一條單鏈的另一端互補(bǔ)；④由過(guò)量的底物、DNA聚合酶、過(guò)量的寡核苷酸引物、以及含有待測(cè)DNA片段的脫氧核糖核酸組成反應(yīng)體系，還加入敏感探針和錨定探針，且敏感探針和錨定探針的數(shù)量基本相同；在上述反應(yīng)體系中進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，而使上述待測(cè)DNA片段擴(kuò)增；⑤對(duì)上述進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)后的體系加熱，直至使擴(kuò)增后的待測(cè)DNA片段變性而使其雙鏈解開，然后降溫而使敏感探針和錨定探針雜交于擴(kuò)增后的待測(cè)DNA片段的含有第一序列和第二序列的單鏈上，因?yàn)闊晒鈭?bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)相互臨近且數(shù)量相當(dāng)，所以若對(duì)探針上的熒光報(bào)告基團(tuán)進(jìn)行激發(fā)，則其所被激發(fā)出的熒光被結(jié)合于同一條鏈上的另一個(gè)探針的熒光淬滅基團(tuán)淬滅，對(duì)外不顯示熒光；⑥加熱雜交后的體系，結(jié)合于待測(cè)DNA片段的單鏈上的第一序列上的敏感探針會(huì)先脫落下來(lái)，若此時(shí)對(duì)探針上的熒光報(bào)告基團(tuán)進(jìn)行激發(fā)，則因?yàn)槊舾刑结樀拿撀涠鴮?duì)外顯示出熒光，隨著溫度的繼續(xù)升高，敏感探針脫落增加，熒光強(qiáng)度也隨著增強(qiáng)，將其中的熒光強(qiáng)度增量變化最大時(shí)的溫度作為融解溫度；若該融解溫度值與同樣條件下野生型基因的相應(yīng)的DNA片段的相應(yīng)的融解溫度值之間有明顯的差別，則說(shuō)明所測(cè)脫氧核糖核酸具有單核苷酸多態(tài)性。
上述步驟②中的錨定探針的融解溫度的值低于步驟③中寡核苷酸引物的融解溫度的值。步驟②中結(jié)合于探針的熒光報(bào)告基團(tuán)可以是6-羧基熒光素，結(jié)合于探針的淬滅基團(tuán)可以是6-羧基四甲基羅丹明。
上述步驟④的體系中的待測(cè)脫氧核糖核酸為1.6～3.2ng/μl。步驟④中所加入的每一種探針在體系中的濃度為4×103～8×104pM。步驟④中進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法是，在90℃～95℃下預(yù)變性1分鐘，接著開始循環(huán)，也即90℃～95℃的溫度下保持0秒，以溫度轉(zhuǎn)換率為每秒20℃的速度降溫至55℃～61℃、保持10秒，再以溫度轉(zhuǎn)換率為每秒20℃的速度升溫至70℃～75℃、保持10秒，再以溫度轉(zhuǎn)換率為每秒20℃的速度升溫至90℃～95℃，如此便完成了一個(gè)循環(huán)；一共運(yùn)行25～40個(gè)循環(huán)。步驟④中待測(cè)脫氧核糖核酸的待測(cè)DNA片段可以是腫瘤壞死因子受體II、或載脂蛋白M。
上述步驟⑤中加熱體系使待測(cè)DNA片段的雙鏈解開的溫度為90℃～95℃，降溫而使敏感探針和錨定探針雜交于擴(kuò)增后的待測(cè)DNA片段的含有第一序列和第二序列的單鏈上的溫度為30℃～40℃；上述步驟⑥中升溫速度為每秒0.1℃，最高溫度為80℃。步驟⑥中，當(dāng)待測(cè)DNA片段的單鏈上的敏感探針脫落下來(lái)的融解溫度與野生型基因的相應(yīng)的DNA片段的相應(yīng)的融解溫度值之差的絕對(duì)值為5℃～10℃時(shí)，則判斷所測(cè)脫氧核糖核酸具有單核苷酸多態(tài)性。
本發(fā)明具有積極的效果(1)本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)單、時(shí)間較短、可在單管中快速檢測(cè)SNP，從而成本較低。本發(fā)明的方法僅僅需要兩條引物和兩條探針，是最簡(jiǎn)單、最經(jīng)濟(jì)的SNP分型方法之一。在中國(guó)，很多生物技術(shù)公司都進(jìn)行FAM和TAMRA的修飾，因此，研究人員或試劑開發(fā)公司很容易得到此項(xiàng)服務(wù)。雖然本法使用了兩條探針，但合成和修飾的總費(fèi)用僅僅為1000 RMB/5 OD左右。這比合成和修飾一條TaqMan探針還要便宜(1600 RMB/5 OD)。一般來(lái)說(shuō)，PCR產(chǎn)物通常飽和在～1011個(gè)分子/μl，因此，檢測(cè)SNP時(shí)每個(gè)反應(yīng)使用2pmol探針就足夠了。應(yīng)該注意的是，由于未雜交探針在被激發(fā)情況下釋放的熒光不能被淬滅，因而高濃度的探針會(huì)因增加熒光本底而影響本法的敏感性。因此，5 OD的探針約可檢測(cè)10000份標(biāo)本。從這個(gè)意義上來(lái)說(shuō)，本法是非常經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的。(2)在PCR產(chǎn)物融解過(guò)程中，基因序列的差異可通過(guò)敏感探針融解溫度的變化來(lái)檢測(cè)。當(dāng)溫度慢慢升高時(shí)，敏感探針從靶序列上脫落，兩個(gè)熒光基團(tuán)不再相鄰，淬滅基團(tuán)對(duì)熒光報(bào)告基團(tuán)受激發(fā)出的熒光不再起淬滅作用，從而導(dǎo)致熒光突然大量增加。熒光增量變化最大時(shí)的溫度稱為融解溫度。突變型基因的融解溫度與野生型基因的融解溫度具有明顯的差異。典型的野生型純合子標(biāo)本會(huì)呈現(xiàn)單一的融解谷，對(duì)于雜合子而言，則可見兩個(gè)融解谷。突變型純合子則會(huì)出現(xiàn)一個(gè)與野生型純合子不同溫度的融解谷。由一個(gè)堿基錯(cuò)配而造成的溫度漂移通常在5℃～10℃之間，并且很容易識(shí)別。(3)熒光淬滅探針的TM值必須低于引物的TM值，以避免Taq DNA聚合酶的切割。而且敏感探針的TM值應(yīng)該低于錨定探針的TM值，以保證在融解曲線分析時(shí)熒光信號(hào)的產(chǎn)生僅僅依賴于敏感探針。(4)本發(fā)明在制備探針時(shí)，因?yàn)榭晒┻x擇的基本方案就可達(dá)16種，因此對(duì)于目標(biāo)基因的可供選擇的標(biāo)記范圍較大，從而可以使成功率較高。(5)本檢測(cè)方法已通過(guò)DNA測(cè)序的驗(yàn)證，適用于大批量基因分型的研究。


圖1為本發(fā)明的方法的檢測(cè)原理圖。
圖2為本發(fā)明的方法中探針的設(shè)計(jì)方案圖。
圖3為本發(fā)明的方法中腫瘤壞死因子受體II的融解曲線分析圖；其中曲線1為G/G純合子融解曲線分析圖；曲線2為T/T純合子融解曲線分析圖；曲線3為T/G雜合子融解曲線分析圖；曲線4為陰性對(duì)照融解曲線分析圖。
圖4為本發(fā)明的方法中待測(cè)脫氧核糖核酸的待測(cè)DNA片段是腫瘤壞死因子受體II的部分測(cè)序結(jié)果圖；其中圖4(A)為突變型基因部分測(cè)序結(jié)果圖，圖4(B)為野生型基因部分測(cè)序結(jié)果圖，圖中箭頭所指為突變位點(diǎn)。
圖5為本發(fā)明的方法中載脂蛋白M的融解曲線分析圖；其中曲線1為T/T純合子融解曲線分析圖；曲線2為C/C純合子融解曲線分析圖；曲線3為T/C雜合子融解曲線分析圖；曲線4為陰性對(duì)照融解曲線分析圖。
圖6為本發(fā)明的方法中待測(cè)脫氧核糖核酸的待測(cè)DNA片段是載脂蛋白M的部分測(cè)序結(jié)果圖；其中圖6(A)為突變型基因部分測(cè)序結(jié)果圖，圖6(B)為野生型基因部分測(cè)序結(jié)果圖，圖中箭頭所指為突變位點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
圖1為本發(fā)明的檢測(cè)脫氧核糖核酸的單核苷酸多態(tài)性的方法的原理圖。圖1中的(A)～(D)為聚合酶鏈反應(yīng)過(guò)程的示意圖，在此過(guò)程中，探針不結(jié)合到靶DNA上去。
圖1中的(A)給出了靶DNA、正義引物、反義引物、敏感探針和錨定探針的混合在一起的示意圖。其中的靶DNA即為待測(cè)脫氧核糖核酸，其中含有待測(cè)DNA片段，該待測(cè)DNA片段的一條單鏈上具有第一序列和第二序列，其中的第一序列是指其中的某一個(gè)核苷酸可能發(fā)生變異的一段核苷酸序列，第二序列是指與第一序列核苷酸相靠近的一段核苷酸序列。此時(shí)靶DNA處于正常的雙螺旋狀態(tài)。正義引物是指與待測(cè)脫氧核糖核酸的待測(cè)DNA片段的包含第一序列和第二序列的一條單鏈的5′端的一段序列互補(bǔ)的引物，反義引物是指與該DNA片段的該單鏈相對(duì)應(yīng)的另一條單鏈的3′端的一段序列互補(bǔ)的引物。敏感探針采用結(jié)合有淬滅基團(tuán)的寡核苷酸，該寡核苷酸互補(bǔ)于與待測(cè)DNA片段的第一序列相對(duì)應(yīng)的野生型基因的相應(yīng)DNA片段的相應(yīng)序列、或互補(bǔ)于與待測(cè)DNA片段的第一序列相對(duì)應(yīng)的突變型基因的相應(yīng)DNA片段的相應(yīng)序列，且所述淬滅基團(tuán)為6-羧基四甲基羅丹明(6-carboxy-N，N，N，N-tetrachlorofluorescein，TAMRA)；錨定探針采用結(jié)合有熒光報(bào)告基團(tuán)的與待測(cè)DNA片段的第二序列互補(bǔ)的寡核苷酸，且所述熒光報(bào)告基團(tuán)為6-羧基熒光素(6-carboxyfluorescein，F(xiàn)AM)。
圖1中的(B)說(shuō)明升高溫度后，靶DNA變性，使其雙鏈DNA解開成為單鏈的模板。
圖1中的(C)說(shuō)明在退火過(guò)程中，反應(yīng)體系中的一對(duì)引物，也即正義引物與反義引物分別與已經(jīng)解鏈的靶DNA片段兩條單鏈進(jìn)行配對(duì)復(fù)性。
圖1中的(D)說(shuō)明在退火的基礎(chǔ)上，在合適的溫度下NDA聚合酶將單核苷酸從3′端滲入，并沿模板由5′端向3′端方向延伸，合成新的DNA片段。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行循環(huán)。
圖1中的(E)表示聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)束時(shí)，敏感探針及錨定探針與待測(cè)DNA片段在較低溫度條件下(如42℃或30℃)雜交。由于錨定探針的熒光報(bào)告基團(tuán)FAM與敏感探針的淬滅基團(tuán)TAMRA相互靠近，熒光報(bào)告基團(tuán)FAM受激所發(fā)出的熒光被淬滅基團(tuán)TAMRA淬滅。圖中箭頭所指位置為SNP位點(diǎn)。
圖1中的(F)表示當(dāng)溫度緩慢升高時(shí)，敏感探針先融解脫離靶DNA，而使敏感探針?biāo)鶐У拇銣缁鶊F(tuán)不再與錨定探針?biāo)鶐У臒晒鈭?bào)告基團(tuán)相靠近，而使熒光強(qiáng)度突然急劇增加。若待測(cè)脫氧核糖核酸的待測(cè)DNA片段具有單核苷酸變異，則其融解溫度值與野生型基因的相應(yīng)的DNA片段的相應(yīng)的融解溫度值有明顯的差異。
圖2是本發(fā)明的敏感探針和錨定探針的設(shè)計(jì)方案圖。其中的敏感探針的寡核苷酸的序列互補(bǔ)于與待測(cè)DNA片段的第一序列相對(duì)應(yīng)的野生型基因的相應(yīng)DNA片段的相應(yīng)序列、或互補(bǔ)于與待測(cè)DNA片段的第一序列相對(duì)應(yīng)的突變型基因的相應(yīng)DNA片段的相應(yīng)序列；前一種情況是指敏感探針的寡核苷酸的序列與不發(fā)生變異的待測(cè)DNA片段的第一序列互補(bǔ)；后一種情況是指敏感探針的寡核苷酸的序列與發(fā)生變異的待測(cè)DNA片段的第一序列互補(bǔ)。另外敏感探針的寡核苷酸的序列的長(zhǎng)短可隨第一序列的長(zhǎng)短而確定，或者說(shuō)，第一序列可以由是否有與其相對(duì)應(yīng)的寡核苷酸存在而確定，也即該寡核苷酸是除其可能變異點(diǎn)對(duì)應(yīng)核苷酸外，其余部分均與第一序列互補(bǔ)的寡核苷酸，且只要所選擇的寡核苷酸序列符合探針的基本條件即可；而該寡核苷酸的可能變異點(diǎn)對(duì)應(yīng)核苷酸是指該寡核苷酸的與第一序列的可能的變異點(diǎn)處的核苷酸相對(duì)應(yīng)的位置處的核苷酸；而該可能變異點(diǎn)對(duì)應(yīng)核苷酸可以與第一序列的該可能變異處的非變異的核苷酸互補(bǔ)，或者與變異后的核苷酸互補(bǔ)。
仍見圖2，在敏感探針的設(shè)計(jì)中，當(dāng)確定了敏感探針的寡核苷酸的序列后，可在熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)(可將該兩個(gè)基團(tuán)通稱為熒光基團(tuán))中選擇一個(gè)基團(tuán)將其設(shè)置在該寡核苷酸的3′端或5′端，這樣敏感探針就有4種形式。其中的第一種形式是該寡核苷酸的3′端設(shè)有熒光報(bào)告基團(tuán)，第二種形式是該寡核苷酸的5′端設(shè)有熒光報(bào)告基團(tuán)，第三種形式是該寡核苷酸的3′端設(shè)有淬滅基團(tuán)，第四種形式是該寡核苷酸的5′端設(shè)有淬滅基團(tuán)。
仍見圖2，在錨定探針的設(shè)計(jì)中，其寡核苷酸的序列與待測(cè)DNA片段的第二序列互補(bǔ)，且要符合探針的基本條件，而待測(cè)DNA片段的第二序列可以是位于第一序列的右側(cè)的一段核苷酸序列(可稱為右側(cè)第二序列)，也可以是位于第一序列的左側(cè)的另一段核苷酸序列(可稱為左側(cè)第二序列)。因此，可以將其序列與右側(cè)第二序列互補(bǔ)的寡核苷酸稱為錨定探針的右側(cè)寡核苷酸，而將其序列與左側(cè)第二序列互補(bǔ)的寡核苷酸稱為錨定探針的左側(cè)寡核苷酸。
錨定探針在使用時(shí)與敏感探針在兩個(gè)方面相配合。第一個(gè)方面的配合是兩者之間的位置配合，也就是錨定探針的寡核苷酸為右側(cè)寡核苷酸時(shí)，在使用中與待測(cè)DNA片段雜交時(shí)，位于敏感探針右側(cè)，錨定探針的寡核苷酸為左側(cè)寡核苷酸時(shí)，在使用中與待測(cè)DNA片段雜交時(shí)，位于敏感探針左側(cè)。第二個(gè)方面是熒光基團(tuán)的配合，也就是當(dāng)敏感探針上的熒光基團(tuán)為熒光報(bào)告基團(tuán)時(shí)，錨定探針上的熒光基團(tuán)則為淬滅基團(tuán)，當(dāng)敏感探針上的熒光基團(tuán)為淬滅基團(tuán)時(shí)，錨定探針上的熒光基團(tuán)則為熒光報(bào)告基團(tuán)。所以，對(duì)于錨定探針來(lái)說(shuō)，對(duì)應(yīng)于敏感探針4種形式的每一種，均有4種配合形式；第一種配合形式是寡核苷酸為右側(cè)寡核苷酸，熒光基團(tuán)位于該寡核苷酸的3′端；第二種配合形式是寡核苷酸為右側(cè)寡核苷酸，熒光基團(tuán)位于該寡核苷酸的5′端；第三種配合形式是寡核苷酸為左側(cè)寡核苷酸，熒光基團(tuán)位于該寡核苷酸的3′端；第四種配合形式是寡核苷酸為左側(cè)寡核苷酸，熒光基團(tuán)位于該寡核苷酸的5′端。
由以上說(shuō)明可知，本發(fā)明的進(jìn)行探針設(shè)計(jì)時(shí)，可供選擇的設(shè)計(jì)方案有16種。
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，但本發(fā)明不局限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1本實(shí)施例的方法具有以下步驟①確定待測(cè)DNA片段。該待測(cè)DNA片段為人類基因組中的腫瘤壞死因子受體II(Tumornecrosis factor receptor II，TNFRII)基因。TNFRII是1型跨膜蛋白，其基因定位在1p36.2，全長(zhǎng)43kbp，含有10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子，TNFRII基因第6外顯子196位雙等位基因SNP標(biāo)志產(chǎn)生3種基因型，分別為T/T純合子、G/G純合子和T/G雜合子，其中T/T純合子屬于野生型基因。TNFR2基因存在第6外顯子196位ATG→AGG兩種不同的等位基因，可以導(dǎo)致蛋氨酸(M)→精氨酸(R)的改變。這種多態(tài)性與自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡以及家族性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān)。TNFRII基因擴(kuò)增產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度為529bp，其中的第一序列從該片段的第91位堿基開始，至第107位堿基結(jié)束，其中的第101位堿基則是可能發(fā)生變異的點(diǎn)位，第一序列核苷酸的排列順序是5’-GACTGCATCCCTGCTTG-3’(其中的可能變異位點(diǎn)用突變型表示)。第二序列從該片段的第59位堿基開始，至第74位堿基結(jié)束，第二序列的排列順序是5’-GCCATACTCCGGGTGG-3’。
②確定敏感探針以及錨定探針。敏感探針的寡核苷酸由17位堿基組成，與步驟①中的采用的第一序列互補(bǔ)，也即與突變型的相應(yīng)的DNA片段的相應(yīng)序列互補(bǔ)，其3′端結(jié)合有淬滅基團(tuán)，敏感探針的序列是5’-CAAGCAGGGATGCAGTC-TAMRA-3’，其中的第7位與第一序列可能發(fā)生突變的位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)。錨定探針的寡核苷酸有16位，其5′端結(jié)合有熒光報(bào)告基團(tuán)，錨定探針的序列是5’-FAM-CCACCCGGAGTATGGC-3’。這兩種探針在上海生工合成和修飾，且敏感探針的融解溫度的值低于錨定探針的融解溫度的值。
③確定合適的兩個(gè)寡核苷酸引物。正義引物的寡核苷酸有24位，其序列為5’-CGGGGACGTTCTCCAACACGACTT-3’；反義引物的寡核苷酸有20位，其序列為5’-TGGCTGCGTGTGTTGGGATC-3’。這兩種引物在上海生工合成和修飾，且它們的融解溫度的值大于步驟②中的錨定探針的融解溫度的值。
④進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)。將40～80ng的DNA模板、2.5μl的10×PCR緩沖液、1.5mM的MgCl2、過(guò)量的底物0.5μl的4×dNTPs、購(gòu)自上海申能博彩公司的1.25U的Taq DNA聚合酶、步驟③得到的正義引物10pmol和反義引物10pmol組成反應(yīng)體系而進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，還加入步驟②得到的敏感探針2pmol以及錨定探針2pmol而構(gòu)成整個(gè)體系。其中，PCR總反應(yīng)體系為25μl，DNA模板在體系中的濃度為1.6～3.2ng/μl，每一種探針在體系中的濃度為8×104pM。DNA模板也即含有待測(cè)DNA片段的脫氧核糖核酸，也稱靶DNA，該DNA模板為用上海生工制造的UIIQ-10柱式血液基因組DNA抽提試劑盒從人類冠脈疾病患者的血液中提取。患者的人數(shù)有200名，因此，本實(shí)施例的DNA模板有200個(gè)，對(duì)每個(gè)DNA模板分別進(jìn)行了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以及分別進(jìn)行后續(xù)的檢測(cè)步驟。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在羅氏公司LightCycler基因擴(kuò)增檢測(cè)儀(版本號(hào)3.5)上進(jìn)行。過(guò)程如下在95℃下預(yù)變性1分鐘，接著開始循環(huán)，也即95℃的溫度下保持0秒，以溫度轉(zhuǎn)換率為每秒20℃的速度降溫至61℃、保持10秒，再以溫度轉(zhuǎn)換率為每秒20℃的速度升溫至72℃、保持10秒，再以溫度轉(zhuǎn)換率為每秒20℃的速度升溫至95℃，如此便完成了一個(gè)循環(huán)；一共運(yùn)行40個(gè)循環(huán)。最后一個(gè)循環(huán)在升溫至72℃、保持10秒而結(jié)束。
⑤探針雜交于待測(cè)DNA片段的同一條單鏈上。仍在羅氏公司LightCycler基因擴(kuò)增檢測(cè)儀上進(jìn)行，加熱體系至95℃、保持30秒，使擴(kuò)增后的待測(cè)DNA片段的雙鏈解開，然后降溫至42℃、保持4分鐘，從而使敏感探針雜交于擴(kuò)增后的待測(cè)DNA片段的含有第一序列和第二序列的單鏈的第一序列上，使錨定探針雜交于擴(kuò)增后的待測(cè)DNA片段的含有第一序列和第二序列的單鏈的第二序列上。因?yàn)樗尤氲拿舾刑结樑c錨定探針的數(shù)量基本相同，而雜交于相應(yīng)的待測(cè)DNA片段的單鏈上的探針又相互臨近，若此時(shí)對(duì)探針上的熒光報(bào)告基團(tuán)進(jìn)行激發(fā)，則其所被激發(fā)出的熒光被位于同一單鏈上的另一個(gè)探針上的淬滅基團(tuán)淬滅，因此對(duì)外不顯示熒光。
⑥見圖3，測(cè)定待測(cè)DNA片段的融解溫度。仍在羅氏公司LightCycler基因擴(kuò)增檢測(cè)儀上進(jìn)行，打開檢測(cè)儀上的熒光通道1(F1)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)探針的熒光報(bào)告基團(tuán)進(jìn)行激發(fā)。加熱雜交后的體系，以每秒0.1℃的速度使體系從42℃升溫至80℃，在升溫過(guò)程中，敏感探針首先從待測(cè)DNA片段的單鏈上脫落下來(lái)，從而其淬滅基團(tuán)不能對(duì)結(jié)合于該單鏈上的錨定探針上的熒光報(bào)告基團(tuán)受激發(fā)出的熒光進(jìn)行淬滅，因而體系中的熒光強(qiáng)度增加，隨著溫度的繼續(xù)升高，敏感探針脫落增加，熒光強(qiáng)度也隨著增強(qiáng)，將其中的熒光強(qiáng)度增量變化最大時(shí)的溫度作為融解溫度(Melting temperature，TM)。該融解溫度TM與以下三種情況之一相對(duì)應(yīng)第一種情況是由于G/G純合子與敏感探針完全匹配，產(chǎn)生一個(gè)較高的融解溫度，大約在58.5℃左右；第二種情況是T/T純合子與敏感探針有一個(gè)堿基不配，TM值則漂移到52.5℃；第三種情況是雜合子T/G基因型則出現(xiàn)兩個(gè)融解谷，TM值分別為52.5℃和58.5℃。兩個(gè)融解谷之間的溫度差(ΔT)為6℃。所在測(cè)出DNA片段的融解溫度后，就可以對(duì)該DNA片段是否具有單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行判斷了。如果屬于第一種情況和第三種情況說(shuō)明有突變，如果屬于第二種情況則說(shuō)明未發(fā)生突變。
不同實(shí)驗(yàn)之間的TM值可能在±0.8℃之間波動(dòng)，不同融解谷之間的ΔT可能在±0.6℃之間波動(dòng)。本法之所以用融解谷，而不是用融解峰來(lái)表示，是因?yàn)長(zhǎng)ightCycler 3.5版本中沒(méi)有dF/dT的作圖分析功能。我們希望這項(xiàng)功能在新的版本中添加，以便使用者根據(jù)各自需求選擇相應(yīng)功能。
見圖4，此項(xiàng)檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性通過(guò)DNA測(cè)序驗(yàn)證。DNA測(cè)序工作由上海英駿公司完成，圖4顯示了測(cè)序結(jié)果。
實(shí)施例2其余與實(shí)施例1相同，不同之處在于步驟①中所確定的待測(cè)DNA片段為人類基因組中的載脂蛋白M(apolipoprotein M，apoM)基因。ApoM是新近發(fā)現(xiàn)的載脂蛋白，其基因定位在6p21.31。在apoM近啟動(dòng)子區(qū)有一T-778C(rs805296)SNP。在此SNP標(biāo)志產(chǎn)生3種基因型，分別為T/T純合子、C/C純合子和T/C雜合子，其中的T/T純合子屬于野生型基因。這一SNP與膽固醇及空腹血糖相關(guān)，并且也增加漢族人群中2型糖尿病的易感性。apoM基因擴(kuò)增產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度為410bp，其中的第一序列從該片段的第170位堿基開始，至第189位堿基結(jié)束，其中的第180位堿基則是可能發(fā)生變異的位點(diǎn)，第一序列核苷酸的排列順序是5’-AATTTTTGTACTTTTTGTAG-3’(其中的可能變異位點(diǎn)用突變型表示)。第二序列從該片段的第149位堿基開始，至第162位堿基結(jié)束，第二序列的排列順序是5’-GCGTGTGCCACCAC-3’。
步驟②中所確定敏感探針的序列是5’-CTACAAAAAGTACAAAAATT-FAM-3’，所確定的錨定探針的序列是5’-GTGGTGGCACACGC-TAMRA-3’。apoM T-778C寡核苷酸在上海英駿公司合成和修飾。apoM T-778C的探針參照編碼鏈設(shè)計(jì)和合成，因此，T/T純合子和C/C純合子應(yīng)分別用A/A純合子和G/G純合子來(lái)表示。
步驟③中所確定的正義引物的寡核苷酸有30位，其序列為5’-ACTGACACATTCACTCAACATTTATTACTA-3’；反義引物的寡核苷酸有21位，其序列為5’-AGGGGTTGGTGGTGTTTTGTT-3’。
步驟④進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，所加入的敏感探針、錨定探針、正義引物和反義引物為本實(shí)施例的相應(yīng)的敏感探針、錨定探針、正義引物和反義引物。
步驟⑤中的雜交溫度為30℃。
步驟⑥中的融解溫度TM與以下三種情況之一相對(duì)應(yīng)第一種情況是由于C/C純合子與敏感探針完全匹配，產(chǎn)生一個(gè)較高的融解溫度，大約在50℃左右；第二種情況是T/T純合子與敏感探針有一個(gè)堿基不配，TM值則漂移到43℃；第三種情況是雜合子T/C基因型則出現(xiàn)兩個(gè)融解谷，TM值分別為50℃和43℃。兩個(gè)融解谷之間的溫度差(ΔT)為7℃。所在測(cè)出DNA片段的融解溫度后，就可以對(duì)該DNA片段是否具有單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行判斷了。如果屬于第一種情況和第三種情況說(shuō)明有突變，如果屬于第二種情況則說(shuō)明未發(fā)生突變。(圖5)。
此項(xiàng)檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性通過(guò)DNA測(cè)序驗(yàn)證。DNA測(cè)序工作由上海英駿公司完成，圖6顯示了測(cè)序結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)脫氧核糖核酸的單核苷酸多態(tài)性的方法，具有以下步驟①確定要對(duì)某種生物的脫氧核糖核酸的某種基因進(jìn)行檢測(cè)，也就是確定待測(cè)DNA片段，而該待測(cè)DNA片段的一條單鏈上具有第一序列和第二序列，所述的第一序列是指該序列中的某一個(gè)特定核苷酸可能發(fā)生變異的一段核苷酸序列，第二序列是指與第一序列核苷酸相靠近的一段核苷酸序列；②制備可稱為敏感探針的一種寡核苷酸探針、以及制備可稱為錨定探針的另一種寡核苷酸探針；所述敏感探針互補(bǔ)于與待測(cè)DNA片段的第一序列相對(duì)應(yīng)的野生型基因的相應(yīng)DNA片段的相應(yīng)序列、或互補(bǔ)于與待測(cè)DNA片段的第一序列相對(duì)應(yīng)的突變型基因的相應(yīng)DNA片段的相應(yīng)序列，敏感探針的一端僅一端結(jié)合有熒光報(bào)告基團(tuán)或淬滅基團(tuán)；所述錨定探針與待測(cè)DNA片段的第二序列互補(bǔ)，錨定探針的一端僅一端在敏感探針結(jié)合有熒光報(bào)告基團(tuán)時(shí)結(jié)合有淬滅基團(tuán)、在敏感探針結(jié)合有淬滅基團(tuán)時(shí)結(jié)合有熒光報(bào)告基團(tuán)；敏感探針的融解溫度的值低于錨定探針的融解溫度的值；③制備合適的兩個(gè)寡核苷酸引物，該兩個(gè)寡核苷酸引物中的一個(gè)寡核苷酸引物與上述待測(cè)DNA片段的具有第一序列和第二序列的單鏈的一端互補(bǔ)，該兩個(gè)寡核苷酸引物中的另一個(gè)寡核苷酸引物與上述待測(cè)DNA片段的另一條單鏈的另一端互補(bǔ)；④由過(guò)量的底物、DNA聚合酶、過(guò)量的寡核苷酸引物、以及含有待測(cè)DNA片段的脫氧核糖核酸組成反應(yīng)體系，還加入敏感探針和錨定探針，且敏感探針和錨定探針的數(shù)量基本相同；在上述反應(yīng)體系中進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，而使上述待測(cè)DNA片段擴(kuò)增；⑤對(duì)上述進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)后的體系加熱，直至使擴(kuò)增后的待測(cè)DNA片段變性而使其雙鏈解開，然后降溫而使敏感探針和錨定探針雜交于擴(kuò)增后的待測(cè)DNA片段的含有第一序列和第二序列的單鏈上，因?yàn)闊晒鈭?bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)相互臨近且數(shù)量相當(dāng)，所以若對(duì)探針上的熒光報(bào)告基團(tuán)進(jìn)行激發(fā)，則其所被激發(fā)出的熒光被結(jié)合于同一條鏈上的另一個(gè)探針的熒光淬滅基團(tuán)淬滅，對(duì)外不顯示熒光；⑥加熱雜交后的體系，結(jié)合于待測(cè)DNA片段的單鏈上的第一序列上的敏感探針會(huì)先脫落下來(lái)，若此時(shí)對(duì)探針上的熒光報(bào)告基團(tuán)進(jìn)行激發(fā)，則因?yàn)槊舾刑结樀拿撀涠鴮?duì)外顯示出熒光，隨著溫度的繼續(xù)升高，敏感探針脫落增加，熒光強(qiáng)度也隨著增強(qiáng)，將其中的熒光強(qiáng)度增量變化最大時(shí)的溫度作為融解溫度；若該融解溫度值與同樣條件下野生型基因的相應(yīng)的DNA片段的相應(yīng)的融解溫度值之間有明顯的差別，則說(shuō)明所測(cè)脫氧核糖核酸具有單核苷酸多態(tài)性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)脫氧核糖核酸的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于步驟④的體系中的待測(cè)脫氧核糖核酸為1.6～3.2ng/μl。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)脫氧核糖核酸的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于步驟④中所加入的每一種探針在體系中的濃度為4×103～8×104pM。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)脫氧核糖核酸的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于步驟②中的錨定探針的融解溫度的值低于步驟③中寡核苷酸引物的融解溫度的值。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)脫氧核糖核酸的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于步驟④中進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法是，在90℃～95℃下預(yù)變性1分鐘，接著開始循環(huán)，也即90℃～95℃的溫度下保持0秒，以溫度轉(zhuǎn)換率為每秒20℃的速度降溫至55℃～61℃、保持10秒，再以溫度轉(zhuǎn)換率為每秒20℃的速度升溫至70℃～75℃、保持10秒，再以溫度轉(zhuǎn)換率為每秒20℃的速度升溫至90℃～95℃，如此便完成了一個(gè)循環(huán)；一共運(yùn)行25～40個(gè)循環(huán)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)脫氧核糖核酸的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于步驟⑤中加熱體系使待測(cè)DNA片段的雙鏈解開的溫度為90℃～95℃，降溫而使敏感探針和錨定探針雜交于擴(kuò)增后的待測(cè)DNA片段的含有第一序列和第二序列的單鏈上的溫度為30℃～40℃。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)脫氧核糖核酸的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于步驟⑥中升溫速度為每秒0.1℃，最高溫度為80℃。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)脫氧核糖核酸的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于步驟②中結(jié)合于探針的熒光報(bào)告基團(tuán)是6-羧基熒光素，結(jié)合于探針的淬滅基團(tuán)是6-羧基四甲基羅丹明。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8之一所述的檢測(cè)脫氧核糖核酸的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于步驟④中待測(cè)脫氧核糖核酸的待測(cè)DNA片段是腫瘤壞死因子受體II、或載脂蛋白M。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至8之一所述的檢測(cè)脫氧核糖核酸的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于步驟⑥中，當(dāng)待測(cè)DNA片段的單鏈上的敏感探針脫落下來(lái)的融解溫度與野生型基因的相應(yīng)的DNA片段的相應(yīng)的融解溫度值之差的絕對(duì)值為5℃～10℃時(shí)，則判斷所測(cè)脫氧核糖核酸具有單核苷酸多態(tài)性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)脫氧核糖核酸的單核苷酸性質(zhì)的方法。該方法確定待測(cè)DNA片段的一條單鏈上的第一序列和第二序列、且第一序列可能具有變異位點(diǎn)，制備分別對(duì)應(yīng)于第一序列和第二序列的敏感探針和錨定探針、且敏感探針的一端僅一端結(jié)合有熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)中的一種、錨定探針的一端僅一端結(jié)合有熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)中的另一種，制備與待測(cè)DNA片段相對(duì)應(yīng)的一對(duì)引物，然后進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，再將探針雜交于擴(kuò)增后的待測(cè)DNA片段的含有第一序列和第二序列的單鏈上，再測(cè)定融解溫度，即可對(duì)待測(cè)DNA片段所屬的脫氧核糖核酸的單核苷酸是否具有單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行判斷。本發(fā)明具有成本較低、操作方便、檢測(cè)時(shí)間較短的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1952178SQ20061009738
公開日2007年4月25日 申請(qǐng)日期2006年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月3日
發(fā)明者羅光華, 鄭璐 申請(qǐng)人:羅光華, 鄭璐