專利名稱：相輔脫氧核糖核酸的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種相輔脫氧核糖核酸(cDNA)的合成方法。
cDNA在正常的生物體細(xì)胞內(nèi)并不存在，cDNA需借助于逆轉(zhuǎn)錄酶以信使核糖核酸(mRNA)為模板在試管內(nèi)合成，合成后的cDNA為信使核糖核酸的拷貝，因而帶有該信使核糖核酸的全部遺傳信息，是當(dāng)今基因克隆、分析(包括基因芯片)及功能蛋白質(zhì)表達(dá)的必不可少的中介物質(zhì)。
穩(wěn)定和實(shí)用的cDNA為雙鏈結(jié)構(gòu)，其第一鏈合成是如上所述的逆轉(zhuǎn)錄酶完成的，其第二鏈的合成可分為兩大類1)用傳統(tǒng)的(非耐熱的)聚合酶合成cDNA第二鏈(如大腸桿菌DNA聚合酶I全酶或Klenow片斷，T4、T7λ噬菌體DNA聚合酶等)。
2)用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)合成cDNA第二鏈，PCR用酶都是耐熱性的DNA聚合酶，如Taq，Klentaq，Tth等DNA聚合酶。
眾所周知，用傳統(tǒng)的聚合酶合成cDNA第二鏈的保真性好但合成量低，一般為起始信使核糖核酸模板量的80％-90％，而用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增合成cDNA第二鏈易產(chǎn)生點(diǎn)變異(PCR酶的保真性差)，但由于PCR擴(kuò)增，雙鏈cDNA為傳統(tǒng)方法的10-20倍，這種生產(chǎn)量可以滿足工業(yè)化大生產(chǎn)的要求，其中由于PCR所產(chǎn)生的點(diǎn)變異，在某些應(yīng)用(如cDNA芯片的生產(chǎn))上可忽略不計(jì)，或可以用低循環(huán)PCR降低或去除PCR酶產(chǎn)生的點(diǎn)變異，雖然低循環(huán)PCR(3-5循環(huán))的得率(合成量)要比標(biāo)準(zhǔn)PCR(25-30循環(huán))低得多，但還是比用傳統(tǒng)的聚合酶合成cDNA第二鏈的得率還是高。
把PCR技術(shù)應(yīng)用到cDNA合成必然會(huì)碰到的技術(shù)問題是如何把PCR引物銜接頭，又稱“通用序列”無差異地加到每一個(gè)cDNA分子上去？眾所周知，天然的信使核糖核酸(mRNA)分子存在3’端poly(A)尾部，因而用oligo(dT)轉(zhuǎn)錄成第一鏈的cDNA后，自然在其總體cDNA的5’端形成一個(gè)天然PCR通用序列，欲施行總體cDNA PCR擴(kuò)增，必需在5’端和3’都具有供引物結(jié)合的通用序列，如何在數(shù)以萬計(jì)的總體第一鏈cDNA的3’端高效加上一個(gè)PCR通用序列是一個(gè)技術(shù)難點(diǎn)，現(xiàn)有技術(shù)，如末端轉(zhuǎn)移酶催化的同聚物GC加尾，由于無法控制加尾長(zhǎng)度，而且GC富集區(qū)本身會(huì)抑制PCR反應(yīng)，故實(shí)用過程中不理想，用連接酶催化的磷酸接頭的連接反應(yīng)，對(duì)單鏈DNA的連接效果極差，對(duì)雙鏈DNA的連接亦不穩(wěn)定，而且連接反應(yīng)中如存在非mRNA污染序列，會(huì)在以后的PCR反應(yīng)中得到擴(kuò)增影響到cDNA的純度，所以連接反應(yīng)所需要的起始物為mRNA，而且使用量亦大。
本發(fā)明的目的在于提供一種可在全部第一鏈cDNA的3’端簡(jiǎn)易、高效加上一個(gè)PCR通用序列，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)總體cDNA PCR擴(kuò)增的cDNA的合成方法。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種cDNA的合成方法，其特征在于包括下列步驟(1)用常規(guī)方法人工合成下列結(jié)構(gòu)式的DNA-RNA或RNA供體分子5’-----------------****3’，包括①5’OOOOOOOOOOOOOO-GNGG3’②5’OOOOOOOOOOOOOO-NGGG3’③5’OOOOOOOOOOOOOO-NNGG3’④5’OOOOOOOOOOOOOO-GNG3’⑤5’OOOOOOOOOOOOOO-GGN3’⑥5’OOOOOOOOOOOOOO-NGG3’其中Poly＂O＂代表隨意DNA或RNA序列，包括25～35個(gè)堿基，是引物的結(jié)合部位；“G”代表RNA堿基G，“N”代表RNA堿基A或T、G、C；(2)用鼠源逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV采用常規(guī)方法以mRNA為模板合成第一鏈cDNA，在合成第一鏈cDNA的同時(shí)，加入上述供體分子，發(fā)生如下方式的逆轉(zhuǎn)錄和模板轉(zhuǎn)換反應(yīng)當(dāng)合成第一鏈cDNA到達(dá)mRNA的5’端，第一鏈cDNA在3’端具有加尾功能而形成的cDNA受體分子，通過分子相輔結(jié)合，該受體分子接受反應(yīng)液中的供體分子，逆轉(zhuǎn)錄酶繼續(xù)把供體分子作為模板繼續(xù)轉(zhuǎn)錄而合成一條和供體分子相輔的序列，即PCR通用序列，也即PCR引物結(jié)合部位；5’---------****3’供體分子PolyA尾5’------------****xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxAAAAAAAAAAAAAA3’3’←----------****yyyyyyyyyyyyy yyyyyyyyyyyyyyyyyT TTT T TTT5’受體分子 oligo-d(T)其中＂x＂代表mRNA，＂y＂代表第一鏈cDNA；(3)用常規(guī)PCR擴(kuò)增方法合成cDNA第二鏈，并生成大量擴(kuò)增產(chǎn)物。5’端引物5’ -----------------****xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxAAAAAAAAAA3’3’ -----------------****yyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyTT T TTT T T5’←-----------3’端引物本發(fā)明通過在全部第一鏈cDNA的3’端簡(jiǎn)易、高效加上一個(gè)PCR通用序列，進(jìn)而高效實(shí)現(xiàn)總體cDNA PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增產(chǎn)物可廣泛用于cDNA芯片生產(chǎn)、cDNA文庫(kù)的建立與生產(chǎn)、cDNA探針的合成以及起始RNA量受限制時(shí)的應(yīng)用等方面。
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例一種cDNA的合成方法，其特征在于包括下列步驟(1)用常規(guī)方法(采用核酸合成儀)人工合成下列結(jié)構(gòu)式的DNA-RNA或RNA供體分子5’-----------------****3’，包括①5’OOOOOOOOOOOOOO-GNGG3’②5’OOOOOOOOOOOOOO-NGGG3’③5’OOOOOOOOOOOOOO-NNGG3’④5’OOOOOOOOOOOOOO-GNG3’⑤5’OOOOOOOOOOOOOO-GGN3’⑥5’OOOOOOOOOOOOOO-NGG3’其中Poly＂O＂代表隨意DNA或RNA序列，包括25～35個(gè)堿基，是引物的結(jié)合部位；“G”代表RNA堿基G，“N”代表RNA堿基A或T、G、C，由于供體分子是供鼠源逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV催化之用，其通式是供體分子的3’端的最后3個(gè)RNA序列中的“G”要占50％以上，因?yàn)槭笤茨孓D(zhuǎn)錄酶M-MLV本身具有末端轉(zhuǎn)移酶活性，但加尾時(shí)以dc為主，以其它三種為輔。
(2)用鼠源逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV采用常規(guī)方法以mRNA為模板合成第一鏈cDNA，在合成第一鏈cDNA的同時(shí)，加入上述供體分子，發(fā)生如下方式的逆轉(zhuǎn)錄和模板轉(zhuǎn)換反應(yīng)當(dāng)合成第一鏈cDNA到達(dá)mRNA的5′端，第一鏈cDNA在3’端具有加尾功能而形成的cDNA受體分子，通過分子相輔結(jié)合，該受體分子接受反應(yīng)液中的供體分子，逆轉(zhuǎn)錄酶繼續(xù)把供體分子作為模板繼續(xù)轉(zhuǎn)錄而合成一條和供體分子相輔的序列，即PCR通用序列，也即PCR引物結(jié)合部位；5’---------****3’供體分子PolyA尾5’ -------------****xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxAAAAAAAAAAA3’3’ ←-----------****yyyyyyyyyyyyy yyyyyyyyyyyyyyyyT TTT T TTT5’受體分子oligo-d(T)其中＂x＂代表mRNA，＂y＂代表第一鏈cDNA；(3)用常規(guī)PCR擴(kuò)增方法合成cDNA第二鏈，并生成大量擴(kuò)增產(chǎn)物。5’端引物-----→5’ ------------------****xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxAAAAAAAAAAAA3’3’ ------------------****yyyyyyyyyyyyyyy yyyyyyyyyyyyyyyyyTTT TTT T T5’←---------3’端引物
權(quán)利要求
1.一種cDNA的合成方法，其特征在于包括下列步驟(1)用常規(guī)方法人工合成下列結(jié)構(gòu)式的DNA-RNA或RNA供體分子5’-------------------****3’，包括①5’OOOOOOOOOOOOOO-GNGG3’②5’OOOOOOOOOOOOOO-NGGG3’③5’OOOOOOOOOOOOOO-NNGG3’④5’OOOOOOOOOOOOOO-GNG3’⑤5’OOOOOOOOOOOOOO-GGN3’⑥5’OOOOOOOOOOOOOO-NGG3’其中Poly＂O＂代表隨意DNA或RNA序列，包括25～35個(gè)堿基，是引物的結(jié)合部位；“G”代表RNA堿基G，“N”代表RNA堿基A或T、G、C；(2)用鼠源逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV采用常規(guī)方法以mRNA為模板合成第一鏈cDNA，在合成第一鏈cDNA的同時(shí)，加入上述供體分子，發(fā)生如下方式的逆轉(zhuǎn)錄和模板轉(zhuǎn)換反應(yīng)當(dāng)合成第一鏈cDNA到達(dá)mRNA的5’端，第一鏈cDNA在3’端具有加尾功能而形成的cDNA受體分子，通過分子相輔結(jié)合，該受體分子接受反應(yīng)液中的供體分子，逆轉(zhuǎn)錄酶繼續(xù)把供體分子作為模板繼續(xù)轉(zhuǎn)錄而合成一條和供體分子相輔的序列，即PCR通用序列；5’---------****3’供體分子PolyA尾5’ ---------------****xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxAAAAAAAA3’3’←--------------****yyyyyyyyy yyyyyyyyyyyyyyyyyT TTT T TTT5’受體分子 oligo-d(T)其中＂x＂代表mRNA，＂y＂代表第一鏈cDNA；(3)用常規(guī)PCR擴(kuò)增方法合成cDNA第二鏈，并生成大量擴(kuò)增產(chǎn)物。5’端引物-----→5’ -------------------****xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxAAAAAAAAAAA3’3’ -------------------****yyyyyyyyyyyyyyy yyyyyyyyyyyyyyTT T TTT T T5’←-------3’端引物
全文摘要
本發(fā)明公開了一種cDNA的合成方法,包括人工合成DNA－RNA或RNA供體分子、用鼠源逆轉(zhuǎn)錄酶以mRNA為模板合成第一鏈cDNA,在合成第一鏈cDNA的同時(shí),加入上述供體分子進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和模板轉(zhuǎn)換反應(yīng)、用PCR擴(kuò)增方法合成cDNA第二鏈。本發(fā)明通過在全部第一鏈cDNA的3’端簡(jiǎn)易、高效加上一個(gè)PCR通用序列,進(jìn)而高效實(shí)現(xiàn)總體cDNA PCR擴(kuò)增。
文檔編號(hào)C12P19/00GK1380421SQ0111352
公開日2002年11月20日 申請(qǐng)日期2001年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月10日
發(fā)明者朱遠(yuǎn)源 申請(qǐng)人:朱遠(yuǎn)源