專利名稱：人睪丸特異性蛋白－1基因編碼蛋白的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于人類基因組技術領域。
本發(fā)明所述人睪丸特異蛋白-1基因(Testis specific protein1,NYD-TSP1)是發(fā)明人在南京醫(yī)科大學生殖醫(yī)學江蘇省重點實驗室用基因芯片方法篩選獲得，首先制備人睪丸功能基因表達芯片，通過比較胚胎和成年人睪丸功能基因的表達，獲得差異表達克隆，經序列測定證明為全長cDNA，為1848bp；其開放閱讀框架為1293bp，編碼430個氨基酸。查閱基因庫，該基因為新基因，該基因表達蛋白為睪丸特異蛋白。由于該基因是成人睪丸高表達，因此發(fā)現的人睪丸特異蛋白基因可能與睪丸發(fā)育有關，用該基因克隆可制備成融合蛋白，用該蛋白免疫家兔，可獲得單克隆和多克隆抗體，該基因也可用于制備睪丸功能基因表達芯片。融合蛋白也可能成為治療相關疾病的基因藥物。
由于人睪丸特異蛋白-1基因在Genbank數據庫中尚無同源基因，本發(fā)明人對于該基因的結構和功能研究成果全都是開創(chuàng)性的。美國國家生物技術情報中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)已正式接受該基因為Genbank的新成員，接受號為AF333098。1 ggggggagcc ccagccttgg tcccctttcc cacccttcct ccccacaagg ctgtctgaga61 tgccaccttc cacctaaaca tcatctccca aattttaatc cttaactttg gtctctgact121 tctgcttgat tccacagtct ccacccacat ttgcacaaag gaccatcacc tgtccttcct181 ggaatctcta aagttttctg ctttccttct gtcctgatgg ccagctctgc taagtcagct241 gagatgccca ccatctccaa aacccttaac cctactcctg atcctcatca agaatatctg301 gactctagga ttaccattgc cttattcgaa attggatcac attccccttc ctcctggggc361 tctctccctt tcctaaagaa tagcagccat caagttacag aacaacagac tgcacagaag421 tttaacaatc tcttaaaaga aattaaagat attcttaaaa atatggcagg ttttgaagag481 aagatcacag aagcaaaaga actttttgag gaaaccaata ttactgagga tgtgtcagcc541 cacaaagaaa atatcagagg acttgacaaa atcaatgaaa tgttatcaac aaacctgcct601 gttagtttag ccccagagaa agaagacaat gaaaagaaac aggagatgat attggaaacc661 aatattactg aggatgtgtc agcccacaaa gaaaatatca gaggacttga caaaatcaat721 gaaatgttat caacaaacct gcctgttagt ttagccccag agaaagaaga caatgaaaag781 aaacagcaga tgataatgga aaaccagaac tctgagaaca ccgcacaagt ttttgcaaga841 gatttggtaa atcgtttaga agaaaaaaaa gtccttaacg aaactcaaca aagtcaggaa901 aaagcaaaaa acagacttaa tgttcaagaa gaaactatga aaattaggaa caacatggag961 cagttactac aggaagcaga acactggagt aaacaacata ctgagctcag taaactgata1021 aaatcctatc agaaatctca gaaagacata agtgaaactc ttggaaataa tggagtcggt1081 ttccaaaccc agccaaataa tgaagtgtcg gctaagcctg agctggagga acaggtgaag1141 aaactgagcc atgacaccta ttcattgcag ttgatggcag ctttgctaga gaatgaatgc1201 caaatcttac agcagagagt agagattctc aaggaactcc atcatcagaa acagggaact1261 ctgcaagaga agccaattca gataaactat aaacaggaca agaaaaatca gaagccatca1321 gaagcaaaga aagtagaaat gtataagcag aacaagcaag caatgaaggg tacattttgg1381 aaaaaagaca gatcctgtag aagcctggat gtttgtctta ataagaaagc ttgcaatacc1441 cagttcaata ttcatgttgc aagaaaagct cttaggggaa aaatgaggtc agctagcagc1501 ctaagataga aaataccaaa agcagatgaa aaggtgaatc cttaaaaaac tacatctgtt1561 acctccaact tgtcagtcat gatcaatcat caaaccttgg gcagatctgc tggttcaacc1621 aagaaagagc tatagaataa ggagattgac acttatatta ctcattactt cagcagttat1681 gtaagtctgg tctttaatga ccattgtgtc tacatcaagt tcataacttt tcacctttac1741 aatctgcttg ttttttttgt aattattaga tagacagcct agagtgagaa gttaaaggtc1801 caattaagta aagatctaaa taaaaaccag aatccccaaa aaaaaaaa人睪丸特異蛋白-1基因cDNA序列MASSAKSAEMPTISKTLNPTPDPHQEYLDSRITIALFEIGSHSPSSWGSLPFLKNSSHQVTEQQTAQKFNNLLKEIKDILKNMAGFEEKITEAKELFEETNITEDVSAHKENIRGLDKINEMLSTNLPVSLAPEKEDNEKKQEMILETNITEDVSAHKENIRGLDKINEMLSTNLPVSLAPEKEDNEKKQQMIMENQNSENTAQVFARDLVNRLEEKKVLNETQQSQEKAKNRLNVQEETMKIRNNMEQLLQEAEHWSKQHTELSKLIKSYQKSQKDISETLGNNGVGFQTQPNNEVSAKPELEEQVKKLSHDTYSLQLMAALLENECQILQQRVEILKELHHQKQGTLQEKPIQINYKQDKKNQKPSEAKKVEMYKQNKQAMKGTFWKKDRSCRSLDVCLNKKACNTQFNIHtVARKALRGKMRSASSLR人睪丸特異蛋白-1基因開放閱讀框架氨基酸序列本發(fā)明的目的是鑒于人睪丸特異蛋白-1基因是本發(fā)明人發(fā)現的全新基因，目前人類對此基因的認識和了解僅限于本發(fā)明人所做的科學研究工作。由于該基因是與睪丸特異功能相關的基因，而且是胚胎低表達，成人高表達，因此該基因很可能與睪丸內的精子發(fā)生有關，其異常表達可能影響男性的生殖功能，因此該基因的研究可用于①通過制備該基因的融合蛋白，用于研究該基因與睪丸功能的關系，還可能成為一種治療男性睪丸相關疾病的生物藥品。
②制備特異性抗體基因編碼蛋白的特異性抗體是研究基因結構和功能的不可缺少的重要工具，人睪丸特異蛋白-1基因編碼蛋白的多克隆和單克隆抗體，可用作免疫組織化學染色、ELISA、免疫電鏡、免疫共沉淀等多種根據免疫學原理設計的檢測方法，可用于該基因編碼蛋白在組織細胞中的定位和定量研究，也可用于各種生物樣本(如血液、精液、尿液等)中的含量變化研究以及蛋白質-蛋白質相互作用研究等。因此，該抗體有可能用于制備與人睪丸特異蛋白-1基因表達異常相關疾病診斷試劑盒，并有可能用于制備抗生育藥物。
③制備基因診斷芯片將功能基因用于制備基因診斷芯片是基因開發(fā)研究的一個重要方面，在疾病診斷(如男性不育、性功能低下)和藥物篩選等方面均具有重要意義。
本發(fā)明技術方案1．人睪丸特異蛋白-1基因融合蛋白的制備以人睪丸特異蛋白-1基因開放閱讀框的核苷酸序列與質粒pDESTTM15制備成GST-SP2-pDEST15表達質粒，在無NaCl的LB中30℃培養(yǎng)到0.5OD600，經0.3MNaCl誘導后，超聲粉碎后經GST親和層析柱純化，得到純化的融合蛋白。
2．人睪丸特異蛋白-1基因編碼蛋白特異性多克隆抗體取融合蛋白與載體蛋白KLH(Keyhole Limpet Hymocyanin)結合，經透析后再與完全/不完全佐劑(Complete/Incomplete Freund’sAdjuvant)等量混合，免疫新西蘭兔(背部皮下注射)，每隔3～4周激發(fā)注射一次，共三次，于三個月后取血分離血清。以免疫前動物血清作為對照做ELISA，測定各免疫兔血清中抗體滴度。篩選高滴度血清，進一步用抗原作競爭抑制免疫試驗確定抗體的特異性。根據ELISA結果確定其用于免疫組織化學染色的稀釋倍增數為1∶200～500。
3．人睪丸特異蛋白-1基因編碼蛋白特異性單克隆抗體取融合蛋白與載體蛋白KLH(Keyhole Limpet Hymocyanin)結合，經透析后再與完全/不完全佐劑(Complete/Incomplete Freund’sAdjuvant)混合，免疫Balb/C小鼠(腹腔內注射)，隔周一次，連續(xù)2-3次，融合前靜脈加強一次，用ELISA方法證實抗體的產生后，取脾臟分離脾細胞，然后與骨髓瘤細胞融合產生雜交瘤細胞。陽性克隆經多次亞克隆，直至獲得分泌抗人睪丸特異蛋白-1抗體的單克隆雜交瘤細胞株。
4．人睪丸特異蛋白基因用于制備睪丸功能基因表達芯片(1)以獲取的人睪丸特異蛋白基因的核苷酸序列設計引物，擴增全長的人睪丸特異蛋白基因序列，用作點膜的樣品。
(2)用英國BioRobotics自動點膜儀將標本點在8×12cm尼龍膜上，每一標本點2個點，每點的DNA量約幾ng。；陽性對照8個housekeeping genes (a.ribosomal protein S9；b.Actin gamma；c.glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；d.hypoxanthinephosphoribosyltransferase 1；e.H.sapiens mRNA for 23KD highly basicprotein；f.ubiqnitin C；g.Phospholipase A2；h.ubiquitin carboxy Ⅰ-ferminal esterase L Ⅰ)。陰性對照加λ噬菌體DNA和P-blue質粒。
(3)將含有該基因的芯片用于人睪丸特異蛋白基因缺失的診斷和藥物篩選
33P標記抽提待檢標本mRNA或DNA，用Random Primer標記法標記待檢標本mRNA或DNA，作為雜交的探針。
雜交將點制好的尼龍膜標記探針雜交后，雜交爐(68℃)內烘干，用磷屏壓片。
信號掃描和分析用記錄儀分析雜交信號。根據雜交信號的強弱分析影響人睪丸特異蛋白基因蛋白表達水平或人睪丸特異蛋白基因的缺失。
權利要求
1．人睪丸特異蛋白1基因(NYD-TSP1)克隆制備的融合蛋白，其特征是NYD-TSP1基因全部開放閱讀框氨基酸，序列為MDNRKEPPFFNDDNMGPFYYRLHFCDTMELFIETLTGTCFELRVSPFETVISVKAKIRRLEGIPICRQHLIWNNMELENDYCLNDYNISEGCTLKLVLAMRGGPINTRRVPTDDPLRKMAEYLDSSRVEVWEKTSCSKQVTFLVYREGDQLNFFPAVDRGDGTLTPLSDSSKKIDFHLHVLRRKGEHRMSGGSMYNSDTDEDEETEPSSSGQQIIENSITMNKMKLLKAKMKNMNLSKKPKKAVKIKPHPPVAPRPSSGSTAPSRHRLLRVLPNIGQSCSPAFGNAYPPEISRNGISSLATQLSAERYISSITGEFLKEDNSWENNTLSHFSSNVKLPPQIPHLELGNDQELADSVLHLGSSLPRQTKHFLGNLPSSNGNIVLPSEECVTEQSLLPKVGSPASFAEGNADEQSSGLEGACKVNLELLLTNADKGLKAPEQHLKHVAGVLNGESVETSVLNYRELSPHKNRLLSPLRCSASMSLHNSLVKPERQSKCFEFGKLQPSSSQSLDVQNITDSSFSRTTCFQGVKVDSLGKRSDVISKVEARDITEMTNKASKEPVGCVNNISFLASLAGSTSRNRLQSTRGAGRLQNSGTGLSTNLQHFQEENFRKSSPQLEHTGVFLSTHGVGMNGNNAAAGKSVGECTTHHLPPVKAPLQTKKKTTNHCFLCGKKTGLASSYECRCGNNFCASHRYAETHGCTYDYKSAGRRYLHEANPVVNAPKLPKI
2．根據權利要求1所述針對NYD-TSP1基因開放閱讀框氨基酸序列制備的多克隆抗體，其特征是融合蛋白與完全和不完全佐劑混合后，免疫新西蘭兔制備多克隆抗體。
3．根據權利要求1所述針對NYD-TSP1基因開放讀框氨基酸序列制備的單克隆抗體，其特征是融合蛋白與完全和不完全佐劑混合，免疫Balb/C小鼠，分離脾臟B淋巴細胞并和骨髓瘤細胞融合產生雜交瘤細胞，進一步用亞克隆方法、ELISA和抗體分型方法篩選分泌IgG抗體的單克隆，制備單克隆抗體。
4．根據權利要求1所述針對將NYD-TSP1基因開放讀框氨基酸序列用于制備睪丸功能基因表達芯片，其特征是PCR擴增NYD-TSP1基因cDNA，點于芯片用于芯片制備。
5．根據權利要求1所述，針對NYD-TSP1基因開放讀框氨基酸序列制備融合蛋白，其特征是融合蛋白可作為治療相關疾病的基因藥物。
全文摘要
本發(fā)明屬于人類基因組技術領域,所述的人睪丸特異蛋白1(Testis specific protein 1,NYD－TSP1)基因全長cDNA序列為1848bp,其開放閱讀框序列為1293bp,編碼430個氨基酸,該基因在基因庫(Genbank)中的編號為AF333098。本發(fā)明利用NYD－TSP1基因克隆制備融合蛋白,并用該蛋白免疫動物制備單克隆和多克隆抗體,同時將基因克隆用于睪丸特異功能基因表達芯片的制備,表達蛋白也可能成為治療相關疾病的基因藥物。
文檔編號C12Q1/68GK1318560SQ01113508
公開日2001年10月24日 申請日期2001年4月11日 優(yōu)先權日2001年4月11日
發(fā)明者沙家豪, 周作民, 李建民 申請人:南京醫(yī)科大學