專利名稱：：一種基于納米金與核酸結(jié)構(gòu)的比色檢測法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明特別涉及一種基于納米金與核酸結(jié)構(gòu)的比色檢測法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
：核酸適體(aptamer)是指利用上個(gè)世紀(jì)末建立而發(fā)展起來的SELEX(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment)體夕卜蹄選技術(shù),從隨機(jī)寡核苷酸文庫中篩選獲得的短單鏈寡核苷酸配基，它能夠與靶分子特異結(jié)合，從而本身發(fā)生構(gòu)象變化。通過體外篩選技術(shù)，理論上可篩選到任意物質(zhì)的核酸適體，再加上高通量篩選的技術(shù)特點(diǎn)與核酸適體精確識別、易體外合成與修飾等特性，使得核酸適體在分析化學(xué)與生物醫(yī)藥研究方面具有廣闊的應(yīng)用前景。例如，核酸適體在生物傳感器的設(shè)計(jì)中具有重要作用，被應(yīng)用于生物學(xué)、環(huán)境、安全等領(lǐng)域的檢測，包括蛋白質(zhì)(凝血酶、生長因子、HIV相關(guān)多肽等)、有機(jī)小分子(cAMP、ATP、可卡因等)和金屬離子(K+、Hg2+、Pb2+等)，其他新的令人興奮的應(yīng)用包括基于核酸適體的蛋白質(zhì)芯片，和在蛋白質(zhì)組學(xué)中用于高通量成像、基于DNA酶和RNA酶的分子尺度的邏輯DNA分子計(jì)算機(jī)等。除此之外，還有一些其他的DNA序列也可以在某一特定環(huán)境下發(fā)生構(gòu)象變化。核酸適體和這些DNA對各自的靶物質(zhì)來說都有其特異性的核酸結(jié)構(gòu)，可與靶物質(zhì)發(fā)生特異性反應(yīng)，從而本身發(fā)生構(gòu)象的變化。這種核酸結(jié)構(gòu)在遇到相應(yīng)的靶分子進(jìn)行結(jié)合時(shí)通常會(huì)伴有明顯的構(gòu)象變化。這種結(jié)構(gòu)的差異形成了基于核酸結(jié)構(gòu)傳感器的理論基礎(chǔ)。一個(gè)典型的基于核酸結(jié)構(gòu)的傳感器包括一個(gè)雙標(biāo)記的寡核苷酸序列(電子傳遞或能量傳遞的受體和供體)，因此，靶分子結(jié)合導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)變化可以直接影響到受體和供體之間的距離，從而可以高靈敏度的檢測到電信號或光信號的產(chǎn)生。在此基礎(chǔ)上，核酸結(jié)構(gòu)在分析化學(xué)方面的應(yīng)用逐漸成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，例如，Tan等將核酸適體應(yīng)用于分子信標(biāo)研究，發(fā)展了一種高效、高靈敏檢測生物分子的方法-分子aptamer信標(biāo)(MAB)，并進(jìn)一步用于凝血酶和血小板源生長因子(PDGF)的檢測。另外，由于核酸適體與抗體具有類似的特異結(jié)合性質(zhì)，因此在ELISA、免疫學(xué)分析、Western印跡法和生物傳感器等許多應(yīng)用中具有更大的發(fā)展?jié)摿Γ⑷〉贸醪浇Y(jié)果。納米金顆粒在生物學(xué)中的應(yīng)用非常廣泛，目前，核酸結(jié)構(gòu)-納米復(fù)合物在分析檢測中的應(yīng)用也受到了關(guān)注。1996年，Mirkin和Alivisatos所在工作組分別報(bào)道了納米金-DNA復(fù)合物的重要應(yīng)用，并將其發(fā)展為基于納米結(jié)構(gòu)的新型檢測平臺(tái)。通過深入了解金膠獨(dú)特的光學(xué)和電學(xué)性質(zhì)，Mirkin等人隨后發(fā)展了一系列方法對DNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行超微量檢測。他們的方法依賴于巰基DNA探針在金膠表面的修飾，當(dāng)加入靶時(shí)，可以引起金膠的團(tuán)聚或解聚，從而引起宏觀上顏色的紅_藍(lán)變化?；诩{米金和核酸結(jié)構(gòu)的分析檢測方法也已受到關(guān)注。Huang等用納米金顆粒(GNPs)與核酸適體5’端的-SH直接作用形成的結(jié)合物(即Apt-AuNPs)來檢測PDGF及其受體(PDGFR)，發(fā)現(xiàn)由于Apt-AuNPs具有簡易性和專一性，所以非常適合于蛋白質(zhì)分析和癌癥診斷。Parlor等還將Apt-AuNPs用于光學(xué)檢測凝血酶。Dwarakanath等將熒光性能優(yōu)異的半導(dǎo)體納米晶粒-量子點(diǎn)用于標(biāo)記核酸適體，開辟了量子點(diǎn)技術(shù)與SELEX技術(shù)聯(lián)合使用的先河。Korgd等通過生物素和抗生物素的作用將前列腺專一性膜抗原(PSMA)的核酸適體連接到具有近紅外發(fā)光性能的CdTe量子點(diǎn)上來檢測前列腺癌細(xì)胞，取得了較好的結(jié)果，這給核酸適體量子點(diǎn)標(biāo)記在活細(xì)胞及生物體內(nèi)的分析檢測提供了新思路。但是這些方法主要是基于納米金和HS-DNA的組裝來進(jìn)行的，由于DNA需要標(biāo)記，而且組裝的過程較為繁瑣，耗時(shí)長、成本高，不利于推廣應(yīng)用。最近，Rothberg等人報(bào)道了一種利用未經(jīng)過修飾的金膠檢測靶DNA的比色法(H.Li,L.Rothberg,PNAS101,14036,September28,2004)該法基本原理是納米金顆粒可以和單鏈DNA，通過靜電作用發(fā)生瞬時(shí)的吸附結(jié)合，從而可以在高離子強(qiáng)度條件下有效地穩(wěn)定納米金，而雙鏈DNA則不具有這種作用。但是該方法只對特定的DNA進(jìn)行了檢測，而不適用于任意靶物質(zhì)的檢測。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是將現(xiàn)有的納米金檢測靶DNA的比色法擴(kuò)展到對不同的靶分子進(jìn)行檢測，借助于核酸適體和其他核酸結(jié)構(gòu)對不同靶物質(zhì)的特異性反應(yīng)，提供一種簡便、快捷、成本低廉、通用型的納米金檢測靶物質(zhì)的比色法及其試劑盒，可以很方便地實(shí)現(xiàn)對任意靶物質(zhì)的檢測。本發(fā)明人經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，將納米金作為核酸適體的比色探針，核酸適體本身為一無規(guī)卷曲狀態(tài)的柔性單鏈，它可以吸附在納米金表面并有效的提高了納米金的抗鹽性能；當(dāng)核酸適體與靶發(fā)生特異性結(jié)合后，構(gòu)象發(fā)生變化形成有序的立體機(jī)構(gòu)，而這種有序DNA結(jié)構(gòu)不能吸附在納米金表面，因此在提高溶液的離子強(qiáng)度后，沒有靶分子的一組納米金仍然保持單分散狀態(tài)，而有靶分子的一組中，納米金發(fā)生了團(tuán)聚而產(chǎn)生由紅到蘭的顏色變化；因此，通過對納米金顏色的觀察，可以很方便地實(shí)現(xiàn)對靶物質(zhì)的檢測，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之一是一種基于納米金與核酸結(jié)構(gòu)的比色檢測法，包括以下步驟1)將能與靶分子特異性結(jié)合的特異性DNA與待檢溶液混合，進(jìn)行反應(yīng)；2)將步驟1)的反應(yīng)溶液與摩爾數(shù)為特異性DNA的0.011倍的納米金溶液混合，進(jìn)行反應(yīng)；3)加入反應(yīng)濃度在10600mM之間的高鹽溶液，觀察溶液顏色變化。本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)、有機(jī)小分子、金屬離子、甚至整個(gè)病毒顆粒等非DNA分子靶分子的檢測。較佳的靶分子可為三磷酸腺苷(ATP)、可卡因(Cocaine)、血小板衍生性生長因子(PDGF)、凝血酶(thrombin)、溶菌酶(lysozyme)、汞離子或氫離子(pH值)。本發(fā)明所述的特異性DNA為核酸適體和一些其他的DNA序列，這些DNA序列也可以在某一特定環(huán)境下發(fā)生構(gòu)象變化，核酸適體和這些DNA對各自的靶物質(zhì)來說都有其特異性的核酸結(jié)構(gòu)，可與靶物質(zhì)發(fā)生特異性反應(yīng)，從而本身發(fā)生構(gòu)象的變化。較佳的特異性DNA為核酸適體、特異性結(jié)合鉀離子的寡核苷酸(PSO)、特異性結(jié)合汞離子的寡核苷酸(MSO，mercury-specificOligonuclide)或具有i_motif結(jié)構(gòu)的寡聚核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，步驟1)中較佳的，所述的特異性DNA的反應(yīng)濃度為150μM，待檢溶液中靶分子的反應(yīng)濃度為11000μΜ,待檢溶液中靶分子與特異性DNA的摩爾比為111100。同常規(guī)，所述的反應(yīng)較佳的可在緩沖溶液中進(jìn)行，緩沖溶液較佳的為常規(guī)的Tris、PBS、檸檬酸或胂酸鹽體系，緩沖溶液的反應(yīng)濃度較佳的為O25mM。另外較佳的還可加入終濃度為O600mM的NaCl或者0_50mM的MgCl2以調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度。反應(yīng)溫度較佳的為437°C，反應(yīng)時(shí)間較佳的為130分鐘。本發(fā)明步驟2)為將步驟1)的反應(yīng)溶液與摩爾數(shù)為特異性DNA的0.011倍的納米金溶液混合，進(jìn)行反應(yīng)。所述的納米金較佳的為粒徑1020nm納米金溶液。納米金的反應(yīng)濃度較佳的為1ΙΟΟηΜ。反應(yīng)溫度較佳的為437°C，反應(yīng)時(shí)間較佳的為15分鐘。本發(fā)明步驟3)為加入反應(yīng)濃度在10600mM之間的高鹽溶液，觀察溶液顏色變化。所述的高鹽溶液較佳的為含有鹽的緩沖溶液；其中，所述的鹽為MX/M’X2，M=Na+/K+,Μ，=Mg2VCa2+,X=Cl7Br7r/N037C104_，反應(yīng)濃度在10600mM之間；所述的緩沖體系為常規(guī)的Tris、PBS或胂酸鹽體系，反應(yīng)濃度較佳的可為025mM。所述觀察溶液顏色變化的方法優(yōu)選為目視比色法或分光光度法?？梢酝ㄟ^肉眼觀察納米金溶液顏色變化。肉眼觀察時(shí)，當(dāng)加入上述濃度的鹽溶液后，含靶物質(zhì)的溶液中納米金會(huì)很快發(fā)生團(tuán)聚，呈現(xiàn)藍(lán)色，而沒有靶物質(zhì)的溶液則可以保持原來的紅色不變。分光光度法可為儀器記錄溶液的紫外可見光譜的變化光譜520nm處吸收降低的，待檢溶液含靶分子呈陽性；光譜保持不變的，待檢溶液不含靶分子呈陰性。同常規(guī)，本發(fā)明可以采用水或靶分子類似物替換步驟1)中所加的靶分子溶液作為對照組。所述的靶分子類似物可以是靶分子的結(jié)構(gòu)類似物或性質(zhì)類似物。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之二是一種采用所述的比色檢測法進(jìn)行檢測、更佳的還可定量靶物質(zhì)的試劑盒，包含1)特異性DNA；2)納米金溶液；3)鹽溶液。根據(jù)本發(fā)明，在所述的試劑盒中，所述的特異性DNA如上述，較佳的為三磷酸腺苷、可卡因、血小板衍生性生長因子、凝血酶或溶菌酶的核酸適體，特異性結(jié)合汞離子的寡核苷酸或具有i-motif結(jié)構(gòu)的寡聚核苷酸。所述的納米金溶液中的納米金的粒徑較佳的為1020nm。所述的納米金溶液的濃度較佳的為1ΙΟΟηΜ。所述的鹽溶液較佳的為下述鹽的溶液MX/M，X2,M=Na+/K+,Μ，=Mg2+/Ca2+，X=CΓ/BrVIVNO3VCIO4^0所述的鹽溶液的濃度優(yōu)選0.21M，以使其反應(yīng)濃度在10600mM之間。所述的鹽溶液中較佳的還含有的緩沖體系。所述的緩沖體系較佳的為常規(guī)的Tris、PBS或胂酸鹽體系。本發(fā)明整個(gè)反應(yīng)的體系可控制在微升級別，較佳的反應(yīng)體系的體積為5500微升，優(yōu)化實(shí)施方案可表述如下反應(yīng)濃度為150μM的特異性DNA與反應(yīng)濃度為11000μM的靶分子，在20μL的緩沖溶液中進(jìn)行充分反應(yīng)。同時(shí)以不加靶分子溶液的一組、以及加入靶分子類似物的一組作為對照。然后分別取2μL的上述反應(yīng)溶液加入5500μL的納米金(粒徑1020nm，反應(yīng)濃度在1IOOnM)溶液(AuDNA的摩爾比例范圍在111100)，437°C條件下反應(yīng)15分鐘，較佳的為5min。然后加入鹽的緩沖溶液，所述的鹽為MX/M，X2，其中M=Na/K，Μ，=Mg/Ca，X=CΓ/BrVIVNO3VCIO4^；反應(yīng)濃度在10600mM之間；緩沖體系Tris、PBS、胂酸鹽等常規(guī)生化體系，反應(yīng)濃度一般為025mM。觀察實(shí)驗(yàn)組和對照組的納米金顏色變化并記錄紫外可見光譜。本發(fā)明的基本原理可總結(jié)為利用納米金對不同結(jié)構(gòu)DNA的吸附作用不同來實(shí)現(xiàn)對DNA結(jié)構(gòu)的區(qū)分。單鏈DNA從分子形態(tài)上來講主要呈現(xiàn)柔性狀態(tài)，在溶液中可以隨機(jī)的發(fā)生結(jié)構(gòu)的變化；DNA骨架主要帶負(fù)電荷，但堿基上游離的氨基表現(xiàn)為帶正電。雙鏈DNA堿基通過A-T/G-C配對而被包含在結(jié)構(gòu)內(nèi)部，因此表現(xiàn)為帶負(fù)電。在溶液中，核酸適體主要以無規(guī)卷曲的單鏈形式存在，通過鏈上堿基上的游離氨基而吸附到納米金顆粒表面，并且由于DNA鏈上帶大量的負(fù)電荷從而提高了納米金表面電荷密度，增強(qiáng)了納米金在高濃度電解質(zhì)條件下的穩(wěn)定性。而當(dāng)核酸適體等核酸結(jié)構(gòu)結(jié)合了靶分子后，表現(xiàn)出較強(qiáng)的剛性，例如主要以雙鏈、四分體、莖環(huán)、假結(jié)、凸環(huán)等形式存在。因此不能吸附到納米金表面，不能提高納米金的穩(wěn)定性。因此，當(dāng)在上述混合物中加入適當(dāng)濃度的鹽溶液后，含靶物質(zhì)的溶液會(huì)很快發(fā)生團(tuán)聚，呈現(xiàn)藍(lán)色，而沒有靶物質(zhì)的溶液則可以保持原來的紅色不變。本發(fā)明的檢測原理圖可參見圖1。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明簡便、快捷、成本低廉、適用于野外分析和高通量篩選的高特異性檢測，在發(fā)明本方法的操作過程中，DNA無需標(biāo)記，無需昂貴儀器，只需通過觀察納米金溶液的顏色變化就可以判斷靶分子是否存在。本發(fā)明的檢測方法具有通用性，檢測對象可以是任意靶分子，應(yīng)用范圍廣。因?yàn)樵诶碚撋先魏伟形镔|(zhì)都可以通過SELEX技術(shù)尋找到特異性的核酸適體，而且自然界中還存在大量可以發(fā)生構(gòu)象變化的DNA片段是基于某一特定環(huán)境和特定物質(zhì)的。本發(fā)明的檢測方法具有高度特異性和靈敏度。因?yàn)楹怂峤Y(jié)構(gòu)通常都具有非常高的親和力，而高親和力使得可以很方便地檢測到極微量的靶分子，并將反應(yīng)信號直接傳輸?shù)綑z測元件進(jìn)行讀取，同時(shí)又不受其他非靶物質(zhì)的干擾，實(shí)現(xiàn)對靶分子的特異性檢測。并且整個(gè)反應(yīng)的體系控制在微升級別，大大提高了檢測的靈敏度，檢測靈敏度可達(dá)IO-12Hiol數(shù)量級。以下結(jié)合本發(fā)明的特征和有益效果。圖1是本發(fā)明納米金_核酸結(jié)構(gòu)探針對靶物質(zhì)的檢測原理示意圖。圖2是本發(fā)明檢測靶物質(zhì)的納米金溶液的紫外可見光譜圖(以可卡因?yàn)槔?。具體實(shí)施例方式下面用本發(fā)明對三磷酸腺苷(ATP)、可卡因、凝血酶、溶菌酶、汞離子、血小板衍生性生長因子(PDGF)、pH值(氫離子)檢測的實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。其中的“室溫”是指進(jìn)行實(shí)施例操作的實(shí)驗(yàn)室溫度，為2225°C。紫外可見光譜在HitachiUV-3010spectrophotometer上進(jìn)行，波長范圍300800nm,用50μL石英比色皿，取50μL樣品進(jìn)行測量。本發(fā)明實(shí)施例中所用納米金顆粒參考文獻(xiàn)(S.Dwarakanathetal.，BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications325，739，2004)制備。具體步驟如下，將IOOmL0.01%(w/w)的氯金酸溶液加熱到沸騰后，在劇烈攪拌下快速加入25mL的檸檬酸三鈉溶液(10mg/mL)并繼續(xù)加熱1530min，溶液變成酒紅色。停止加熱繼續(xù)攪拌30min后，靜置過夜。然后用0.22μm濾膜進(jìn)行過濾，并放置在冰箱4°C保存。根據(jù)本方法得到粒徑為1020nm，濃度為8InM的納米金溶液。在制備納米金時(shí)，使用的是同一濃度的氯金酸溶液，生成的顆粒越大，對應(yīng)的濃度就越低。此處，IOnm金的濃度為8nM左右，而20nm的金的濃度為InM左右。本發(fā)明實(shí)施例中所用的各種特異性DNA序列如表1所示，均按照已公布的序列由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。其中，檢測ATP、可卡因、凝血酶和溶菌酶所用的特異性DNA為核酸適體，檢測PDGF、汞離子、pH值所用的特異性DNA分別為MSO和具有i-motif結(jié)構(gòu)的DNA。表1.特異性DNA的寡聚核苷酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例1可卡因的檢測步驟分別取2μL濃度為100μM的可卡因_核酸適體溶液與2μL濃度為0.1IOmM的可卡因鹽酸鹽的水溶液，加入18μL緩沖溶液(25mMTris，pH8.2,0.6MNaCl)后混勻(DNA終濃度為10μM，可卡因的終濃度為10-1000μM)，室溫條件下反應(yīng)30min。同時(shí)以不加可卡因，加入2μL水的一組作為空白、以及加入2μLImM的苯甲酰芽子堿(W)、芽子堿甲酯(Ν2)的兩組作為對照。然后分別取2μL的上述反應(yīng)溶液加入100μL如上制備而得的納米金溶液(13nm，3.5nM)，室溫反應(yīng)5min后，加入30μL的0.2ΜPB-鹽溶液(IOmMPB,ΡΗ7.0,0.2ΜKCl)(終濃度約為50mM)。觀察實(shí)驗(yàn)組和對照組的納米金顏色變化并記錄紫外可見光譜。結(jié)果如圖1所示，在含有可卡因的一組溶液中，可卡因-核酸適體與可卡因作用形成剛性的雙鏈結(jié)構(gòu)，不能吸附到納米金表面，因此加入鹽后納米金發(fā)生團(tuán)聚表現(xiàn)為藍(lán)色。而可卡因_核酸適體本身，以及遇到Ni、N2后，DNA均保持原來的單鏈狀態(tài)，有效的提高了納米金的耐鹽性，仍然保持紅色。紫外可見光譜圖見圖2，顯示可卡因組在520nm處明顯降低，而長波處吸收明顯升高，證明大部分已經(jīng)形成聚集體，而Ni、N2組以及空白組均沒有明顯變化。利用此法，可以檢測納米金溶液中終濃度為1100μM的可卡因，溶液的體積可以控制在5500微升。通過優(yōu)化條件，例如控制溶液體積在5微升，檢測濃度在1μM時(shí)，最低可以檢測到5pmol的可卡因。實(shí)施例2ATP的檢測步驟分別取2μL濃度為10μM的ΑΤΡ-核酸適體溶液與2μL濃度為0.01ImM的ATP的水溶液，加入18μL緩沖溶液(IOmMTris，pH8.2,0.3MNaCl)后混勻(DNA終濃度為ΙμΜ，ATP的終濃度為1-10(^11)，室溫條件下反應(yīng)151^11。同時(shí)以不加ΑΤΡ，加入2μL水的一組作為空白、以及加入2μLImM的CTP、UTP、GTP的三組作為對照。然后分別取2μL的上述反應(yīng)溶液加入10μL的如上制備而得納米金溶液(20nm，2nM)，室溫反應(yīng)5min后，力口入10μL的0.2ΜPBSdOmMPB,ρΗ7.0,0.2ΜNaCl)(PBS的終濃度約為IOOmM)。分別記錄實(shí)驗(yàn)組和對照組的納米金顏色變化以及紫外可見光譜。結(jié)果根據(jù)如圖1所示的原理和操作步驟，加入ATP的一組呈現(xiàn)藍(lán)色，紫外可見光譜顯示520nm處的吸收峰明顯降低，而長波處吸收明顯升高，而UTP、CTP、GTP組以及空白組均沒有明顯變化。利用此法可以檢測納米金溶液中濃度為50nM5μM的ΑΤΡ，溶液的體積可以控制在5500微升。如實(shí)施例1通過優(yōu)化條件，最低可以檢測到0.5pmol的ATP。實(shí)施例3對二價(jià)汞離子的檢測步驟取2μL濃度為100μM的Hg2+-MSO溶液，加入2μL濃度為0.12mM的Hg2+的水溶液(MS0的反應(yīng)濃度為50μΜ,靶物質(zhì)的反應(yīng)濃度為50-1000μΜ,反應(yīng)緩沖溶液和離子強(qiáng)度均為0)，室溫條件下反應(yīng)lmin。同時(shí)以不加Hg2+，加入2μL水的一組作為空白實(shí)驗(yàn)。另外選擇性分析通過兩組實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行，一組加入2μL各25mM的Ca2+、Mg2+的，另外一組加入各0.5mM的混合離子(Fe2+，Cu2+，Co2+，Mn2+，Ni2+，Zn2+，Cd2+)。然后分別取2μL的上述反應(yīng)溶液加入100μL如上制備而得的納米金溶液(10nm，IOOnM)，37°C反應(yīng)Imin后，加入60μL的IMNaNO3(鹽的終濃度約為600mM)。觀察實(shí)驗(yàn)組和對照組的納米金顏色變化并記錄紫外可見光譜。結(jié)果根據(jù)如圖1所示的原理和操作步驟，加入Hg2+的一組呈現(xiàn)藍(lán)色，紫外可見光譜顯示520nm處的吸收峰明顯降低，而長波處吸收明顯升高，而其他混合離子組以及空白組均沒有明顯變化。檢測靈敏度和檢測限如實(shí)施例1所示。實(shí)施例4對二價(jià)汞離子的檢測步驟分別取2μL濃度為10μM的Hg2+-MSO溶液和2μL濃度為0.010.ImM的Hg2+的水溶液，加入18μL緩沖溶液(IOmM胂酸鹽，ρΗ8.0)，(此處MSO的反應(yīng)濃度為1μΜ,靶物質(zhì)的反應(yīng)濃度為1-10μΜ)在4°C條件下反應(yīng)5min。同時(shí)以不加Hg2+，加入2μL水的一組作為空白實(shí)驗(yàn)。另外選擇性分析通過兩組實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行，一組加入2μL各25mM的Ca2+、Mg2+的，另外一組加入各0.5mM的混合離子(Fe2+，Cu2+，Co2+，Mn2+，Ni2+，Zn2+，Cd2+)。然后分別取2μL的上述反應(yīng)溶液加入100μL如上制備而得的納米金溶液(13nm，InM)，4°C反應(yīng)5min后，加入5μL的0.2ΜNaClO4(終濃度約為IOmM)。觀察實(shí)驗(yàn)組和對照組的納米金顏色變化并記錄紫外可見光譜。結(jié)果根據(jù)如圖1所示的原理和操作步驟，加入Hg2+的一組呈現(xiàn)藍(lán)色，紫外可見光譜顯示520nm處的吸收峰明顯降低，而長波處吸收明顯升高，而其他混合離子組以及空白組均沒有明顯變化。檢測靈敏度和檢測限如實(shí)施例1所示。實(shí)施例5對pH-DNA結(jié)構(gòu)的檢測步驟分別取2μL濃度為100μM的pH_DNA溶液，加入到8μL檸檬酸緩沖溶液(0.05Μ,ρΗ5·5)以及8μLNa2C03/NaHC03緩沖溶液中(10mM，ρΗ8·5)，室溫條件下反應(yīng)5min，pH-DNA終濃度為10μΜ。同時(shí)以對比DNAl作為對照，如上操作。用HCl或NaOH調(diào)節(jié)如上制備而得的納米金溶液(13nm，IOnM)的pH值分別為5.5,8.5。然后分別取2μL的上述反應(yīng)溶液加入相同PH值的100μL的納米金溶液，室溫反應(yīng)5min后，加入20μL的PBS-鹽溶液(IOmMPB,pH7.0，0.IMNaI)。觀察實(shí)驗(yàn)組和對照組的納米金顏色變化并記錄紫外可見光譜。結(jié)果根據(jù)如圖1所示的原理和操作步驟，pH為5.5的一組呈現(xiàn)藍(lán)色，紫外可見光譜顯示520nm處的吸收峰明顯降低，而長波處吸收明顯升高，而pH為8.5的一組沒有明顯變化。對照組結(jié)果顯示，對比DNAl無論是在堿性還是酸性條件下均沒有明顯變化。利用此法可以得到PH-DNA的結(jié)構(gòu)半轉(zhuǎn)換點(diǎn)在pH6.3附近，這與通過⑶譜檢測得到的pH6.2的結(jié)構(gòu)半轉(zhuǎn)換點(diǎn)非常吻合。實(shí)施例6對pH的檢測步驟1、獲得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(1)分別取2μL濃度為ΙΟΟμM的pH-DNA溶液，加入到8μL檸檬酸緩沖溶液(0.05Μ,ρΗ5·5)以及8μLNa2C03/NaHC03緩沖溶液中(0.05M,ρΗ8·5)，室溫條件下反應(yīng)30mino(2)用HCl或NaOH制備pH分別為4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0,10.0的水溶液，然后分別取50μL該不同pH值的水溶液加入到50μL如上制備而得的納米金溶液(13nm，3.5nM)中，混合均勻。(3)分別取2μL的步驟(1)的反應(yīng)溶液加入到步驟(2)的不同pH值的100μL的納米金溶液中，室溫反應(yīng)5min，然后加入20μL的0.2ΜPBS(IOmMPB,ρΗ7·0,0.2ΜNaCl)。觀察實(shí)驗(yàn)組和對照組的納米金顏色變化并記錄紫外可見光譜，獲得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。2、樣品的檢測取50μL待測pH值的樣品加入到50μL如上制備而得的納米金溶液中(13nm，3.5nM)。再加入2yL的步驟(1)的反應(yīng)溶液，室溫反應(yīng)5min。然后加入20μL的0.2MPB-鹽溶液(IOmMPB,ρΗ7.0，0.2ΜNaBr)，觀察納米金溶液的顏色變化并記錄紫外可見光譜，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定待測溶液的PH值。結(jié)果可檢測的pH值的樣品的pH范圍是ρΗ510。實(shí)施例7對凝血酶的檢測步驟分別取2μL濃度為100μM的凝血酶_核酸適體溶液與2μL濃度為0.1ImM的凝血酶的水溶液，加入18μL緩沖溶液(20mMTris-乙酸，pH7.4，140mMNaCl，ImMCaCl2,ImMMgCl2)后混勻，室溫條件下反應(yīng)30min。(此處DNA的反應(yīng)濃度為10μM，靶物質(zhì)的反應(yīng)濃度為10-100μΜ)同時(shí)以不加凝血酶，加入2μL水的一組作為空白實(shí)驗(yàn)。以及加入2yLImM的BSA(牛血清白蛋白)的一組作為對照。然后分別取2μL的上述反應(yīng)溶液加入100μL如上制備而得的納米金溶液(13nm，10nM)，室溫反應(yīng)5min后，加入40yL的PBS-鹽溶液(IOmMΡΒ，ρΗ7·0,0.IMCaCl2)(終濃度約為65mM)。觀察實(shí)驗(yàn)組和對照組的納米金顏色變化并記錄紫外可見光譜。結(jié)果根據(jù)如圖1所示的原理和操作步驟，凝血酶組呈現(xiàn)藍(lán)色，紫外可見光譜顯示520nm處的吸收峰明顯降低，而長波處吸收明顯升高，而BSA對照和空白組均沒有明顯變化。檢測靈敏度和檢測限如實(shí)施例1所示。實(shí)施例8對溶菌酶的檢測步驟分別取2μL濃度為ΙΟΟμΜ的1溶菌酶-核酸適體溶液與2yL濃度為0.01ImM的溶菌酶的水溶液，加入18μL緩沖溶液(IOmMΡΒ，ρΗ7.0,0.IMNaCl)后混勻，(此處DNA的反應(yīng)濃度為10μΜ,靶物質(zhì)的反應(yīng)濃度為10-100μΜ)室溫條件下反應(yīng)30min。同時(shí)以不加溶菌酶，加入2μL水的一組作為空白實(shí)驗(yàn)。以及加入2yLImM的BSA的一組作為對照。然后分別取2μL的上述反應(yīng)溶液加入IOOyL如上制備而得的納米金溶液(20nm，IOnM)，室溫反應(yīng)5min后，加入10μL的PBS-鹽溶液(IOmMPB,ρΗ7.0,0.2ΜMgCl2)。觀察實(shí)驗(yàn)組和對照組的納米金顏色變化并記錄紫外可見光譜。結(jié)果根據(jù)如圖1所示的原理和操作步驟，溶菌酶組呈現(xiàn)藍(lán)色，紫外可見光譜顯示520nm處的吸收峰明顯降低，而長波處吸收明顯升高，而BSA對照和空白組均沒有明顯變化。檢測靈敏度和檢測限如實(shí)施例1所示。實(shí)施例9對PDGF的檢測步驟分別取2μL濃度為100μM的PDGF-核酸適體溶液與2μL濃度為0.01ImM的PDGF的水溶液，加入18μL緩沖溶液(IOmMΡΒ,ρΗ7.0,0.IMNaCl)后混勻，(此處DNA的反應(yīng)濃度為10μM，靶物質(zhì)的反應(yīng)濃度為10-10(^11)371條件下反應(yīng)301^11。同時(shí)以不加PDGF，加入2yL水的一組作為空白實(shí)驗(yàn)。以及加入2yLImM的BSA的一組作為對照。然后分別取2μL的上述反應(yīng)溶液加入100μL如上制備而得的納米金溶液(20nm，IOnM)，37°C反應(yīng)5min后，加入50μL的0.2ΜPBS(IOmMΡΒ，ρΗ7.0,0.2ΜNaCl)。觀察實(shí)驗(yàn)組和對照組的納米金顏色變化并記錄紫外可見光譜。結(jié)果根據(jù)如圖1所示的原理和操作步驟，PDGF組呈現(xiàn)藍(lán)色，紫外可見光譜顯示520nm處的吸收峰明顯降低，而長波處吸收明顯升高，而BSA對照和空白組均沒有明顯變化。檢測靈敏度和檢測限如實(shí)施例1所示。序列表<110>蘇州市長三角系統(tǒng)生物交叉科學(xué)研究院有限公司<120>一種基于納米金與核酸結(jié)構(gòu)的比色檢測法及其試劑盒<130>P4-081492C<140>200910047300·4<141>2009-03-10<160>8<170>PatentInversion3.4<210>1<211>30<212>DNA<213>Artificial<220><223>可卡因核酸適體<400>1gacaaggaaaatccttcaatgaagtgggtc30<210>2<211>27<212>DNA<213>Artificial<220><223>ATP核酸適體<400>2acctgggggagtattgcggaggaaggt27<210>3<211>15<212>DNA<213>Artificial<220><223>凝血酶核酸適體<400>3ggttggtgtggttgg15<210>4<211>42<212>DNA<213>Artificial<220><223>溶菌酶核酸適體<400>4atctacgaattcatcagggctaaagagtgcagagttacttag42<210>5<211>35<212>DNA<213>Artificial<220><223>PDGF核酸適體<400>5caggctacggcacgtagagcatcaccatgatcctg35<210>6<211>22<212>DNA<213>Artificial<220><223>Hg2+-DNA(MSO)<400>6ttctttcttccccttgtttgtt22<210>7<211>21<212>DNA<213>Artificial<220><223>pH-DNA<400>7ccctaaccctaaccctaaccc21<210>8<211>24<212>DNA<213>Artificial<220><223>對比DNAl<400>8agcaacctcaaacagacaccatgg2權(quán)利要求一種基于納米金與核酸結(jié)構(gòu)的比色檢測法，其特征在于，包括以下步驟1)將能與靶分子特異性結(jié)合的特異性DNA與待檢溶液混合，進(jìn)行反應(yīng)；2)將步驟1)的反應(yīng)溶液與摩爾數(shù)為特異性DNA的0.01～1倍的納米金溶液混合，進(jìn)行反應(yīng)；3)加入反應(yīng)濃度在10～600mM之間的鹽溶液，觀察溶液顏色變化。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶分子的比色檢測法，其特征在于，步驟1)所述的靶分子為三磷酸腺苷、可卡因、血小板衍生性生長因子、凝血酶、溶菌酶、汞離子或氫離子；所述的特異性DNA為三磷酸腺苷、可卡因、血小板衍生性生長因子、凝血酶或溶菌酶的核酸適體，特異性結(jié)合汞離子的寡核苷酸或具有i-motif結(jié)構(gòu)的寡聚核苷酸。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的比色檢測法，其特征在于，步驟1)所述的特異性DNA的反應(yīng)濃度為150iiM，待檢溶液中靶分子的反應(yīng)濃度為11000iiM，待檢溶液中靶分子與特異性DNA的摩爾比為111100。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的比色檢測法，其特征在于，步驟1)所述的反應(yīng)在緩沖溶液中進(jìn)行。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的比色檢測法，其特征在于，步驟1)的反應(yīng)溫度為437°C，反應(yīng)時(shí)間為130分鐘。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的比色檢測法，其特征在于，步驟2)所述的納米金溶液的反應(yīng)濃度為1100nM。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的比色檢測法，其特征在于，步驟2)的反應(yīng)溫度為437°C，反應(yīng)時(shí)間為15分鐘。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的比色檢測法，其特征在于，步驟3)所述觀察溶液顏色變化的方法為目視比色法或分光光度法。9.一種采用權(quán)利要求18任一項(xiàng)所述的比色檢測法進(jìn)行檢測靶物質(zhì)的試劑盒，其特征在于，包含1)能與靶分子特異性結(jié)合的特異性DNA；2)納米金溶液；3)鹽溶液。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述的納米金溶液中的納米金的粒徑為1020nm。11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述的納米金溶液的濃度為1100nM。12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述的鹽溶液為下述鹽的溶液:MX/M，X2，M=Na+/K+，M，=Mg2+/Ca2+，X=Cl7Br7r/N037C104^13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述的鹽溶液的濃度為0.21M。14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述的鹽溶液中含有的緩沖體系。15.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述的緩沖體系為常規(guī)的Tris、PBS或胂酸鹽體系。全文摘要本發(fā)明公開了一種基于納米金與核酸結(jié)構(gòu)的比色檢測法及其試劑盒，包括以下步驟1)將能與靶分子特異性結(jié)合的特異性DNA與待檢溶液混合，進(jìn)行反應(yīng)；2)將步驟1)的反應(yīng)溶液與摩爾數(shù)為特異性DNA的0.01～1倍的納米金溶液混合，進(jìn)行反應(yīng)；3)加入反應(yīng)濃度在10～600mM之間的高鹽溶液，觀察溶液顏色變化。本發(fā)明在操作過程中，DNA無需標(biāo)記，無需昂貴儀器，只需通過觀察納米金溶液的顏色變化就可以判斷靶分子是否存在，因此本發(fā)明簡便、快捷、成本低廉、高特異性、高靈敏的檢測任意靶分子，尤其適用于野外分析和高通量篩選，應(yīng)用范圍廣。文檔編號G01N21/78GK101832936SQ200910047300公開日2010年9月15日申請日期2009年3月10日優(yōu)先權(quán)日2009年3月10日發(fā)明者樊春海,王麗華申請人:蘇州市長三角系統(tǒng)生物交叉科學(xué)研究院有限公司