專利名稱::預(yù)防與治療肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的反義寡核苷酸的結(jié)構(gòu)及用途的制作方法預(yù)防與治療肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的反義寡核苷酸的結(jié)構(gòu)及用途本發(fā)明涉及生物工程藥物領(lǐng)域,具體地說是一種針對(duì)uPA基因的反義寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotide,ASODN)的序列結(jié)構(gòu)及其成為治療肺癌等惡性腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的新型藥物。惡性腫瘤細(xì)胞的侵潤轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜過程,但啟動(dòng)這一過程的首要條件和必需步驟是腫瘤細(xì)胞穿越基底膜侵入周圍基質(zhì),因此如能在此階段控制腫瘤細(xì)胞侵潤,就有可能阻止或抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。資料顯示,腫瘤侵入周圍基質(zhì)與腫瘤細(xì)胞分泌基質(zhì)降解酶溶解基質(zhì)引起腫瘤周圍組織"再塑"(remodeling)密切相關(guān)。絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶等是目前認(rèn)為較為重要的三類基質(zhì)降解酶。其中與多種類型惡性腫瘤侵潤轉(zhuǎn)移相關(guān)的一種絲氨酸蛋白酶一尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinaseplasminogenactivator,uPA)近來皮員為弓I人關(guān)注。1976年Astedt和Holmberg即發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞可產(chǎn)生及釋放uPA,近來Gershtein等發(fā)現(xiàn)在檢測(cè)的所有乳腺癌、卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織中uPA表達(dá)均明顯升高;Zhang等證實(shí)uPA在肝癌組織中高表達(dá);其他作者也相繼報(bào)道了uPA在胃癌、結(jié)腸癌、食道癌、前列腺癌、胸腺癌、膀胱癌、頭頸部鱗癌等腫瘤中高表達(dá),并發(fā)現(xiàn)uPA活性高低與部分腫瘤(如非小細(xì)胞肺癌、胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等)大小、分化狀態(tài)、轉(zhuǎn)移能力及患者臨床分期、生存周期長(zhǎng)短等明顯相關(guān),可作為判斷腫瘤惡性程度和患者預(yù)后狀況的重要指標(biāo);實(shí)驗(yàn)研究亦發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染uPA基因可促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移,而應(yīng)用uPA抑制劑或抗uPA抗體可阻止或抑制腫瘤細(xì)胞侵潤轉(zhuǎn)移。上述這些涵蓋基礎(chǔ)與臨床,涉及正反兩方面的研究資料均說明uPA高表達(dá)在腫瘤細(xì)胞侵潤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。因此,以u(píng)PA為靶點(diǎn)降低其表達(dá)水平就有可能成為抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的一種手段(HanB,etal.O"cW2005;14(1):105-112.DanoK,etal./.rA/wnft好畫oW.2005;93(4):676-681.DuffyMJ,.C"/ri^固Z)饑2004;10(1):39-49).反義寡核苷酸(ASODN)在導(dǎo)入細(xì)胞后能與靶基因mRNA結(jié)合形成DNA-RAN雜合體,封閉或抑制耙基因復(fù)制或表達(dá),從而減少其"下游"產(chǎn)物一蛋白或酶的表達(dá)水平。目前ASODN在惡性腫瘤、病毒感染性疾病(肝炎,流感等)、某些遺傳性疾病及其它基因表達(dá)異常所致疾病的實(shí)驗(yàn)治療中已取得較理想療效,且與傳統(tǒng)治療藥物相比彰顯出作用時(shí)間長(zhǎng)、作用特異性強(qiáng)、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn),自1998年8月美國FDA批準(zhǔn)首個(gè)抗病毒反義藥物進(jìn)入床應(yīng)用以來,國外已有一批反義藥物進(jìn)入臨床II一III期試驗(yàn)或臨床試用(JoensenH,AfedL2000,32(1):31-33.MorrisMJ,etal.C7//IGwice/"/es.2002,8(3):679-683.CoreyDR.Telomeraseinhibition,oligonucleotides,andclinicaltrials.Ozic。ge/ie2002,21(4):631-637)。人uPAmRNA為2304bp(NM-002658),利用生物信息學(xué)軟件可模擬uPAmRNA二級(jí)結(jié)構(gòu),作為設(shè)計(jì)ASODN的重要依據(jù)。但由于uPAmRNA在細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)難以預(yù)測(cè),因此所設(shè)計(jì)的ASODN能否接近uPAmRNA并與之雜交以封閉或減少uPA表達(dá)尚有待體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)做進(jìn)一步篩選與評(píng)價(jià)。本發(fā)明的目的在于尋找能特異高效抑制肺癌細(xì)胞侵潤轉(zhuǎn)移的新型反義藥物,即對(duì)yPAmRNA表達(dá)有較好抑制效應(yīng)的ASODN及能改善其生物活性的化學(xué)修飾衍生物。本發(fā)明的主要內(nèi)容是,根據(jù)GeneBank中人yPAmRNA序列,參考計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu),采用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)了25條ASODN(見表1),并進(jìn)行硫代修飾。經(jīng)MicroPureII反向純化柱(SolidPhaseSciences)純化備用。以侵襲小室(Boyden小室)對(duì)設(shè)計(jì)的ASODN進(jìn)行體外抗人肺癌A549細(xì)胞侵襲能力篩選與評(píng)價(jià)。結(jié)果證明有4條ASODN,即uPA85、uPA604、uPA969、uPA1227在濃度為1.0nmol/L及2.0nmol/L時(shí)對(duì)人肺癌A549細(xì)胞體外侵襲具有抑制作用,提示它們可用于肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的預(yù)防與治療。<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>根據(jù)本發(fā)明,針對(duì)uPAmRNA翻譯起始區(qū)(uPA85)及翻譯區(qū)(uPA604、uPA969、uPA1227)的ASODN能特異性抑制uPA基因表達(dá),有可能成為治療肺癌等惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的新型生物工程藥物。根據(jù)本發(fā)明,為增強(qiáng)反義寡核苷酸的核酸酶抗性、生物利用度、及組織靶向性等,本發(fā)明包含了uPA85、uPA604、uPA969、uPA1227的各種化學(xué)修飾,例如硫代修飾、半乳糖直接修飾、親脂性分子或PH敏靶向脂質(zhì)體修飾等。根據(jù)本發(fā)明,發(fā)明的寡核苷酸及其修飾物可按本領(lǐng)域已知方法配成非腸道給藥的試劑。根據(jù)本發(fā)明,本發(fā)明的寡核苷酸及其修飾物治療組成可應(yīng)用單獨(dú)的有效成分或組合物形式包括聯(lián)合其它反義寡核苷酸及其衍生物。根據(jù)本發(fā)明,本發(fā)明的治療組成,依不同情況包括特定藥物的藥物動(dòng)力學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)、給藥模式、給藥途徑、受者的年齡、體重、肝腎功能狀態(tài)、疾病的性質(zhì)、程度及治療時(shí)限等,以適量的劑量給藥。根據(jù)本發(fā)明,本發(fā)明的實(shí)施對(duì)嚴(yán)重危害人類健康的肺癌等惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的預(yù)防與治療具有重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。結(jié)合附表說明本發(fā)明的具體實(shí)施方法表1:25條反義寡核苷酸序列及性質(zhì)表2:4條ASODN對(duì)人肺癌A549細(xì)胞體外侵襲能力的抑制效應(yīng)表3:4條有效ASODN序列、作用靶點(diǎn)及靶基因局部結(jié)構(gòu)實(shí)施例1.ASODN的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GeneBank中uPAmRNA全長(zhǎng)序列,參考計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu),采用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)了25條硫代ASODN(見表l),采用DNA自動(dòng)合成儀合成并在合成時(shí)進(jìn)行硫代修飾。合成完畢后,濃氨水55'C切割并脫保護(hù)15小時(shí)后,經(jīng)MicroPureII反向純化柱(SolidPhaseSciences)純化,紫外定量后,真空干燥,-20匯保存?zhèn)溆谩?.ASODN的細(xì)胞轉(zhuǎn)染人肺癌A549細(xì)胞以含10。/。小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),適時(shí)更換培養(yǎng)液及傳代,逐漸降低培養(yǎng)液中小牛血清濃度直至無血清培養(yǎng)。以無血清、無抗生素含Lipofectin的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行硫代ASODN細(xì)胞轉(zhuǎn)染,具體步驟參見Lipofectin使用說明書,每條ASODN濃度分別為0.5nmol/L、1.0nmol/L、2.0pmol/L,同一濃度ASODN設(shè)3組,未轉(zhuǎn)染ASODN的A549細(xì)胞為對(duì)照組(C),轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染ASODN的A549細(xì)胞培養(yǎng)后,分別用于細(xì)胞侵襲能力測(cè)定。3.A549細(xì)胞侵襲能力測(cè)定分別將2xl05個(gè)轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染ASODN的A549細(xì)胞懸浮于鋪有Matrigel50嗎的侵襲小室(Boyden小室)的上室中,下室加有趨化劑Fibronectin10pg,在37°(7孵箱培養(yǎng)10h后,以棉簽擦盡膜上室面細(xì)胞及基質(zhì)膠,甲醛固定,HE染色,光鏡下將多聚碳膜分成9等格,取其平均值,每組設(shè)2個(gè)樣本,重復(fù)3次。4.結(jié)果a.在設(shè)計(jì)的25條靶向uPAmRNA的ASODN中,uPA85、uPA604、uPA969、uPA1227在濃度為1.0pmol/L和2.0pmol/L時(shí)能顯著抑制A549細(xì)胞侵襲能力(表2)。表2.4條ASODN體外對(duì)AS49細(xì)胞侵襲能力的抑制效應(yīng)_ASODN代號(hào)_ASODN濃度Qimol/L)_0(C)_9^__^_179.86±34.47138皿26.94'81.86土16.53"192.29±22.17174.14±31.28114,14土25.00"79.00±17.77"159.86±22.25101.29±20.89**68.71土12.91"_183.71±27.24144.43土32.68"95,86±24.94*'Note:,P<0.05,"P<0.01vsC.uPA85UPA604uPA969UPA1227b.4條能抑制A549細(xì)胞侵襲能力的ASODN作用靶點(diǎn)局部結(jié)構(gòu)見表3。表3.4條有效ASODN序列、作用靶點(diǎn)及耙點(diǎn)局部結(jié)構(gòu)ASODN代號(hào)作用靶點(diǎn)靶點(diǎn)局部結(jié)構(gòu)ASODN序列uPA8566-85分枝環(huán)GGCTCTCATGGTGGCGAGGTuPA604585-604分枝環(huán)GCGGGGCCTCAGAGTCTTTTuPA969950-969分枝環(huán)ATGGTCTGTATAGTCCGGGAuPA12271208-1227內(nèi)環(huán)GAGGGAACAGACGAGGGGTC權(quán)利要求1.一種可特異性結(jié)合人uPAmRNA的反義寡核苷酸,其序列選自1).uPA855’-GGCTCTCATGGTGGCGAGGT-3’2).uPA6045’-GCGGGGCCTCAGAGTCTTTT-3’3).uPA9695’-ATGGTCTGTATAGTCCGGGA-3’4).uPA12275’-GAGGGAACAGACGAGGGGTC-3’2.含有權(quán)利要求l中的反義寡核苷酸序列及可藥用載體的藥物組合物。3.權(quán)利要求1中的反義寡核苷酸用于制備抗肺癌及其它惡性腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移藥物的用途。全文摘要本發(fā)明是根據(jù)人尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase-typeplasminogenactivator,uPA)基因結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、合成的反義寡核苷酸(ASODN),可用于抑制人uPA基因表達(dá)。本發(fā)明設(shè)計(jì)了25條互補(bǔ)于uPAmRNA5’區(qū)、翻譯區(qū)、3’區(qū)的反義寡核苷酸,首次發(fā)現(xiàn)互補(bǔ)于uPAmRNA特定區(qū)域的寡核苷酸體外對(duì)培養(yǎng)的人肺癌A549細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移具有抑制效應(yīng)。故本發(fā)明涉及到針對(duì)uPA基因的反義寡核苷酸序列、結(jié)構(gòu)及其成為預(yù)防和治療肺癌等惡性腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的新型藥物。文檔編號(hào)A61P35/00GK101113159SQ20061014601公開日2008年1月30日申請(qǐng)日期2006年11月3日優(yōu)先權(quán)日2006年11月3日發(fā)明者江其生申請(qǐng)人:江其生