非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移及預(yù)判其轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的miRNA標(biāo)記物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地，涉及非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移及預(yù)判其轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的miRNA標(biāo)記物。
【背景技術(shù)】
[0002]非小細(xì)胞肺癌是一類嚴(yán)重威脅人類生命健康癥情復(fù)雜的疾病，幾乎人體的所有部位、組織、臟器均可發(fā)病。非小細(xì)胞肺癌的治療是一種多學(xué)科的綜合治療，其中化療為治療的重要手段之一，但非小細(xì)胞肺癌耐藥性和非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移是非小細(xì)胞肺癌患者總體生存率不高的原因。缺乏有效的針對(duì)非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移和耐藥的早期診斷和治療手段是目前防治中的瓶頸。
[0003]死亡相關(guān)蛋白激酶是一種存在于細(xì)胞質(zhì)中的鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性的絲氨酸/蘇氨酸激酶，蛋白質(zhì)分子量為160kDa。死亡相關(guān)蛋白激酶含多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域:典型的絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域；鈣離子/鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域；含8個(gè)錨定重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)域；Ras蛋白質(zhì)復(fù)合體-Ras蛋白質(zhì)復(fù)合體C末端結(jié)構(gòu)域(R0C-C0R domain, Ras of complexproteins-C-terminal of ROC domain);死亡相關(guān)蛋白激酶在C-末端含一個(gè)典型的死亡結(jié)構(gòu)域，死亡結(jié)構(gòu)域后的C-末端是一 17個(gè)氨基酸殘基組成的富含Ser殘基區(qū)域，該區(qū)域是DAPK激酶活性的負(fù)調(diào)控結(jié)構(gòu)域。死亡相關(guān)蛋白激酶參與細(xì)胞多種生理和病理過(guò)程:凋亡、自噬、糖代謝、免疫反應(yīng)、非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移、tau蛋白病、細(xì)胞轉(zhuǎn)化等等。死亡相關(guān)蛋白激酶不僅是多種因素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)的匯合點(diǎn)，還參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激_、調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬過(guò)程和調(diào)節(jié)糖代謝，這提示死亡相關(guān)蛋白激酶參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。文獻(xiàn)報(bào)道顯示死亡相關(guān)蛋白激酶表達(dá)降低可增加非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移和耐藥的能力。
[0004]miRNA是細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄編輯成的21_22nt的RNA分子，這些RNA分子不翻譯成蛋白質(zhì)，但miRNA通過(guò)轉(zhuǎn)錄后基因沉默對(duì)相應(yīng)的靶基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)。據(jù)估計(jì)，生物體內(nèi)約有I / 3的基因受miRNA的調(diào)控。miRNA與RISC的復(fù)合體通過(guò)堿基配對(duì)可與靶基因mRNA57 -UTR或者3z -UTR中的互補(bǔ)序列相結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)翻譯，或是引發(fā)mRNA降解，從而負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)。miRNA作為細(xì)胞重要的基因調(diào)控分子，與非小細(xì)胞肺癌的關(guān)系備受關(guān)注。隨著miRNA芯片技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)已明確在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中存在多種miRNA的異常表達(dá)或缺失，推斷miRNA很可能是一類新的癌基因或抑癌基因，miRNA己經(jīng)成為研究非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的一個(gè)新領(lǐng)域，某些在非小細(xì)胞肺癌中異常表達(dá)的miRNA被證實(shí)與非小細(xì)胞肺癌對(duì)某些藥物耐受和加速非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移有關(guān)。
[0005]檢測(cè)miRNA的表達(dá)水平可以為癌癥的臨床診斷提供參考。而miRNA的異常表達(dá)直接導(dǎo)致一些與癌癥發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)異常，誘導(dǎo)癌癥的發(fā)生，發(fā)展，轉(zhuǎn)移和耐藥。在未來(lái)臨床診療中，miRNA不僅可以成為新的非小細(xì)胞肺癌早期診斷和癌癥進(jìn)程相關(guān)的標(biāo)記物，而且也有望通過(guò)改變miRNA的表達(dá)或者其靶基因的表達(dá)治療非小細(xì)胞肺癌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了 miR-340在作為檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移標(biāo)記物，或作為預(yù)判非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)記物，或作為非小細(xì)胞肺癌耐藥標(biāo)記物中的應(yīng)用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)所述miR-340可靶向下調(diào)死亡相關(guān)蛋白激酶的表達(dá)水平，而死亡相關(guān)蛋白激酶與非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移和耐藥密切相關(guān)。miR-340表達(dá)增加預(yù)示非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移的幾率增加，引發(fā)耐藥，預(yù)后不良。在此基礎(chǔ)上，miR-340還可以用作為抑制/預(yù)防非小細(xì)胞肺癌粘附或侵襲，或預(yù)防非小細(xì)胞肺癌耐藥的靶點(diǎn)，并進(jìn)一步推廣應(yīng)用到其他腫瘤細(xì)胞的防治和預(yù)后。
[0007]本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的。
[0008]miR-340在作為檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移標(biāo)記物，或作為預(yù)判非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)記物，或作為非小細(xì)胞肺癌耐藥標(biāo)記物中的應(yīng)用。
[0009]miR-340在作為抑制或預(yù)防非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移靶點(diǎn)，或作為抑制或預(yù)防非小細(xì)胞肺癌耐藥靶點(diǎn)中的應(yīng)用。
[0010]miR-340在制備抑制非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移制劑，或制備預(yù)防非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移制劑，或制備預(yù)判非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)制劑，或制備預(yù)防非小細(xì)胞肺癌耐藥制劑，或制備抑制或預(yù)防非小細(xì)胞肺癌粘附或侵襲制劑中的應(yīng)用。
[0011]miR-340在制備包含上述一種或多種制劑的產(chǎn)品中的應(yīng)用。所述產(chǎn)品可以是試劑盒，基因芯片。
[0012]miR-340在制備靶向上調(diào)死亡相關(guān)蛋白激酶表達(dá)藥物中的應(yīng)用。
[0013]
本發(fā)明還提供了上述miR-340在高通量測(cè)序平臺(tái)中的應(yīng)用。通過(guò)高通量測(cè)序能獲知待測(cè)樣本非小細(xì)胞肺癌組織或血清或血漿中miR-340的表達(dá)水平，將待測(cè)樣本的結(jié)果同未發(fā)生轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌組織或血清或血漿相比，容易判斷待測(cè)樣本是否存在轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)或者容易判斷待測(cè)樣本是否已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移、或者判斷非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移是否復(fù)發(fā)。
[0014]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，在已知的各種miRNA中，只有miR-340具有靶向下調(diào)DAPK的功能，而DAPK高表達(dá)是可以抑制肺癌轉(zhuǎn)移的，從而發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)檢測(cè)miR-340表達(dá)來(lái)預(yù)測(cè)DAPK表達(dá)，達(dá)到預(yù)測(cè)肺癌患者預(yù)后的情況。
[0015]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明miR-340的表達(dá)水平高有利于肺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移和產(chǎn)生耐藥，可以通過(guò)判斷miR-340的表達(dá)水平推斷肺腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和耐藥的風(fēng)險(xiǎn)高或者已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移，從而采取預(yù)防肺腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的方案或者為臨床治療方案的制定提供診斷基礎(chǔ)。
[0016]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明miR-340與非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)，在此基礎(chǔ)上，通過(guò)抑制miR-340的表達(dá)可用于抑制非小細(xì)胞肺癌的粘附、轉(zhuǎn)移或侵襲或者降低非小細(xì)胞肺癌粘附、轉(zhuǎn)移和侵襲的風(fēng)險(xiǎn)。
[0017]優(yōu)選地，所述miR-340 為 miR-340 初始 miRNA、miR-340 前體 miRNA 或 miR-340 成熟miRNA中的一種或多種。所述miR-340初始miRNA能在人細(xì)胞內(nèi)被剪切并表達(dá)成成熟miR-340ο
[0018]優(yōu)選地，所述miR-340包括該核酸分子的功能等同體，所述功能等同體由miR-340序列通過(guò)核苷酸殘基的缺失、置換或插入得到，或者是對(duì)miR-340序列進(jìn)行堿基修飾或在序列的一端或兩端增加堿基得到。所述功能等同體，即變體，其顯示完整miR-340核酸分子相同的功能，盡管它們通過(guò)核苷酸殘基的缺失、置換或插入而突變。另外，為了保證miRNA的穩(wěn)定性，可以在miRNA的一端或者兩端增加保護(hù)性堿基，如TT，也可對(duì)miRNA堿基進(jìn)行修飾，但是不影響miRNA的功能。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，在不影響miR-340功能的條件下，對(duì)miR-340進(jìn)行堿基修飾或者在一端或兩端增加堿基獲得的序列同樣包含在所述功能等同體的范圍內(nèi)。
[0019]本發(fā)明【具體實(shí)施方式】中，所述miR-340是成熟miRNA。所述成熟miRNA包括miR-340-3p和miR-340_5p，它們共同享有的種子序列是miR-340。雖然在【具體實(shí)施方式】中所使用的是成熟miR-340，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以預(yù)期，初始miRNA (pi_miR-340)、前體miRNA (pre-miR-340)將可以獲得與成熟 hsa-miR-340_3p 和 hsa-miR-340_5p 同樣的技術(shù)效果，因?yàn)榧?xì)胞有能力進(jìn)一步將初始miRNA (p1-miR-340)，前體miRNA (pre-miR-340)加工為成熟miR-340。
[0020]本發(fā)明所述miR-340核酸分子以單鏈或雙鏈的形式存在。成熟的miR-340主要是單鏈形式，而miR-340前體是部分自互補(bǔ)的，以形成雙鏈結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的miR-340核酸分子為RNA、DNA、PNA或LNA的形式。
[0021]優(yōu)選地，所述制劑內(nèi)包括檢測(cè)miR-340表達(dá)水平的試劑。