輔助鑒定豬鏈球菌2型、豬鏈球菌7型和豬鏈球菌9型的引物組及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學領域，更具體地說，涉及一種輔助鑒定豬鏈球菌2型、豬鏈 球菌7型和豬鏈球菌9型的引物組及其應用，尤其在利用該引物組來輔助檢測來自死亡動 物的樣品中是否攜帶豬鏈球菌2型、豬鏈球菌7型和豬鏈球菌9型的試劑盒及其檢測方法。
【背景技術】
[0002] 豬鏈球菌（Streptococcussuis,SS)是一種世界性的可引起豬重大疾病的重要病 原菌之一，同時它也是一種人獸共患病病原體。人感染豬鏈球菌的途徑主要是接觸病死豬， 致病菌經破損皮膚和黏膜侵入，或食入未煮熟的病死豬肉而感染。近年來，人感染豬鏈球菌 的報道大量增加，而這些病例主要來自亞洲國家。我國于2005年在四川省爆發(fā)的豬鏈球菌 疫情共感染215人，病死率將近20%。
[0003] 血清分型不僅是了解豬鏈球菌某一次特定爆發(fā)的流行情況或監(jiān)測血清型流行情 況的一種很重要的輔助監(jiān)控方法，而且對疫苗的研制有著重要的指導意義。目前，豬鏈球菌 的血清型主要通過凝集實驗來檢測，這種方法既耗時，又費力，且標準血清較為昂貴，結果 判讀主觀差異較大，常常引起誤判。此外，還有相當一部分自凝菌株的血清型無法鑒定。因 此，迫切的需要一種既簡單快速，又可靠的方法來進行血清型的鑒定。
[0004] 豬鏈球菌的血清型主要取決于其莢膜的抗原性，而莢膜的產生又受控于基因組中 的莢膜合成基因簇（cps)。與傳統(tǒng)的用抗血清檢測血清型的方法比較，基于血清型特異性基 因cps的PCR方法是一種簡單、可靠，且經濟的方法。
[0005] 目前公認的豬鏈球菌的血清型有33種（1-31，33,1/2)，經流行病學分析，臨床上 豬鏈球菌主要以2、7、9型是引起豬感染的重要流行血清型，且其致病力較強，而2型豬鏈球 菌極易感染人。雖然之前有文獻報道過2、7、9型的3重PCR方法，但其中用到的引物與我 們的不同，另外文獻中的3條引物擴增的目的條帶間隔距離太小，很難進行肉眼的區(qū)分。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術問題在于，針對現有技術的上述缺陷，以2、7、9型的莢膜多 糖合成基因簇為模板設計了特異性引物組，利用該引物組來輔助檢測來自死亡動物的樣品 中是否攜帶豬鏈球菌2型、豬鏈球菌7型和豬鏈球菌9型的試劑盒及其檢測方法。從中建 立了豬鏈球菌2、7、9型PCR定型方法，實現了 1次PCR同時檢測多個血清型，減少了繁瑣的 工作內容。
[0007] 本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是：提供一種輔助鑒定豬鏈球菌2型、 豬鏈球菌7型和豬鏈球菌9型的引物組，由如下引物對組成：由如SEQIDNO. 1所示的核苷 酸序列和如SEQIDN0. 2所示的核苷酸序列組成的用于輔助鑒定豬鏈球菌2型的引物對； 由如SEQIDN0. 3所示的核苷酸序列和如SEQIDN0. 4所示的核苷酸序列組成的用于輔助 鑒定豬鏈球菌7型的引物對；由如SEQIDN0. 5所示的核苷酸序列和如SEQIDN0. 6所示 的核苷酸序列組成的用于輔助鑒定豬鏈球菌9型的引物對。
[0008] 本發(fā)明所述引物組在制備輔助鑒定豬鏈球菌2型、豬鏈球菌7型和豬鏈球菌9型 的試劑盒中的應用。
[0009] 本發(fā)明還提供一種輔助鑒定豬鏈球菌2型、豬鏈球菌7型和豬鏈球菌9型的試劑 盒，包括PCR預混液、陽性對照以及陰性對照，所述PCR預混液包括Taq聚合酶、dNTPs、上述 的引物組以及雙蒸水。
[0010] 本發(fā)明所述的試劑盒，其中，所述陽性對照為豬鏈球菌2型、豬鏈球菌7型、豬鏈球 菌9型的質粒組，陰性對照為無菌雙蒸水。
[0011] 本發(fā)明還提供一種檢測來自死亡動物的樣品中是否攜帶豬鏈球菌2型、豬鏈球菌 7型和豬鏈球菌9型的方法，包括如下步驟：
[0012] (1)樣品核酸提?。?br>[0013] 從死亡動物選取樣品組織，提取樣品組織的DNA基因組作為DNA模板，并溶于滅菌 超純水中，-20 °C保存，備用；
[0014] (2)PCR擴增：
[0015] 以步驟⑴提取的DNA基因組為DNA模板分別用如權利要求1中所述的引物組對 2、7、9型豬鏈球菌的cps2I、cps7L、cps9J進行PCR擴增，得到PCR產物；
[0016] (3)結果分析：
[0017] 將步驟（2)得到的PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后，紫外燈下觀察目的條帶。
[0018] 其中，所述步驟（2)中的PCR擴增中PCR反應液包括18μLPCR預混液、1μL步驟 (1)制備得到的DNA模板、2yL陽性對照和2yL陰性對照；擴增反應條件為：94°ClOmin預 變性；94°C30s，60°C60s，72°C90s，35 個循環(huán)；72°C延伸lOmin。
[0019] 實施本發(fā)明的輔助鑒定豬鏈球菌2型、7型和9型的引物組及其應用，具有以下有 益效果：
[0020] (1)本發(fā)明以2、7、9型的莢膜多糖合成基因簇為模板設計了特異性引物組，將引 物組制備成試劑盒，建立了豬鏈球菌2、7、9型PCR定型方法，實現了 1次PCR同時檢測3個 血清型，大大縮短了臨床中的工作量與工作時間；同時我們對試劑盒的各項條件進行了優(yōu) 化，操作特別簡單易行，只需在試劑盒中加入待測樣本直接進行PCR擴增即可，不需進行試 劑的配制等繁瑣工作。
[0021] ⑵本發(fā)明的試劑盒及其檢測方法，三對引物對PCR擴增的目的條帶間隔距離較 大，容易區(qū)分出豬鏈球菌2型、豬鏈球菌7型和豬鏈球菌9型，該試劑盒具有操作簡單、快 速、結果判定方便、特異性強、靈敏度高的優(yōu)點。
【附圖說明】
[0022] 下面將結合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步說明，附圖中：
[0023] 圖1為2、7、9型豬鏈球菌cps2I、cps7L和cps9J基因PCR結果圖；其中，1代表 DL2000DNAMarker;2 代表cps2IPCR結果；3 代表cps7LPCR結果；4 代表cps9JPCR結 果；
[0024] 圖2為質粒p02的構建路線；
[0025] 圖3為質粒p07的構建路線；
[0026] 圖4為質粒p09的構建路線；
[0027] 圖5為重組質粒p02、p07和p09PCR擴增及質粒酶切鑒定結果圖；其中，1為p02/ BamHI+Sall;2 為cps2IPCR產物；3 為p07/BamHI+SalI;4 為cps7LPCR產物；5 為p09/ BamHI+Sall;6 為cps9JPCR產物；Μ為DL15000DNAMarker;
[0028] 圖6為檢測待測樣品中是否攜帶2、7、9型豬鏈球菌的多重PCR的檢測結果；其中， 1-20:臨床樣品；21:陽性對照；M:DL2000DNAMarker;22:陰性對照；
[0029] 圖7為本發(fā)明的試劑盒其特異性檢測結果；其中，1-24為SSI-24 ;M為DL2000DNA Marker；
[0030] 圖8為本發(fā)明的試劑盒其特異性檢測結果；其中，25-31為SS25-31 ;32為SS33 ;33 為SS2 ;34為SS7 ;35為SS9 ;36為陽性對照；37為陰性對照；Μ為DL2000DNAMarker;38為 副豬嗜血桿菌；39為豬大腸桿菌；40為豬巴氏桿菌；41為豬波氏桿菌；42為豬沙門氏菌；
[0031] 圖9為本發(fā)明的試劑盒對2型豬鏈球菌的敏感性檢測結果；其中，1為3X105CFU; 2 為 3X104CFU;3 為 3X103CFU;4 為 3X102CFU;5 為SXK^CFU;6 為 3CFU;7 為 3X10tFU; 8為3X102CFU;9為3X103CFU; 10為3X104CFU; -為陰性對照汁為陽性對照；Μ為 DL2000DNAMarker；
[0032] 圖10為本發(fā)明的試劑盒對7型豬鏈球菌的敏感性檢測結果；其中，1為4X105CFU; 2 為 4X104CFU;3 為 4X103CFU;4 為 4X102CFU;5 為AXK^CFU;6 為 4CFU;7 為 4X10tFU; 8為4X102CFU;9為4X103CFU;10為4X104CFU;+為陽性對照；一為陰性對照；Μ為 DL2000DNAMarker；
[0033] 圖11為本發(fā)明的試劑盒對9型豬鏈球菌的敏感性檢測結果；其中，1為5X105CFU; 2 為 5X104CFU;3 為 5X103CFU;4 為 5X102CFU;5 為SXK^CFU;6 為 5CFU;7 為 5X10tFU; 8為5X102CFU;9為5X103CFU; 10為5X104CFU; -為陰性對照汁為陽性對照；Μ為 DL2000DNAMarker〇
【具體實施方式】
[0034] 下面，結合附圖以及【具體實施方式】，對本發(fā)明做進一步描述：
[0035] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試 驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到。
[0036] 實施例1
[0037] -種輔助鑒定豬鏈球菌2型、豬鏈球菌7型和豬鏈球菌9型的引物組，由如下引物 對組成：
[0038] 豬鏈球菌2型上游引物（cps2I-F):
[0039]TTCGTATTAACTTACTTGGCGT(如SEQIDNO. 1 所示）
[0040] 豬鏈球菌2型下游引物（cps2I-R):
[0041]TAAATCCCCATATGCCAAATCC(如SEQIDN0.2 所示）
[0042] 豬鏈球菌7型上游引物（cps7L-F):
[0043]AAAATTCGTTCCATTGTAGGTG(如SEQIDN0.3 所示）
[0044] 豬鏈球菌7型下游引物（cps7L-R):
[0045]TGAAGTTGAAGCTGGTGATAAA(如SEQIDN0.4 所示）
[0046] 豬鏈球菌9型上游引物（cps9J-F):
[0047] TGAAAGTAGGTATATCTCAGCA(如SEQIDN0.5 所示）
[0048] 豬鏈球菌9型下游引物（cps9J-R):
[0049] AAAGAATTGAATCCCACCTGAG(如SEQIDN0.6 所示）
[0050] 實施例2
[0051] -種輔助鑒定豬鏈球菌2型、豬鏈球菌7型和豬鏈球菌9型的試劑盒，用于離體動 物組織的2、7、9型豬鏈球菌分離株的血清型的輔助鑒定和間接反映豬鏈球菌流行病學調 查。
[0052] 該試劑盒包括PCR預混液、陽性對照以及陰性對照，所述PCR預混液包括Taq聚合 酶、dNTPs、上述的引物組以及雙蒸水。陰性對照為無菌雙蒸水。
[0053] (1)PCR預混液的配制
[0054] 試劑盒中PCR預混液按以下配方配制，