專利名稱：：植物轉(zhuǎn)錄阻遏物,結(jié)合其的蛋白質(zhì)核因子,及它們的應(yīng)用的制作方法相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求2001年7月10日提交的、美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/303,780的優(yōu)先權(quán)，其全部?jī)?nèi)容結(jié)合于此作為參考。
背景技術(shù)：
：A)發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種植物基因調(diào)控元件及其應(yīng)用，更具體地，涉及一種用于調(diào)節(jié)植物對(duì)病原體、生長(zhǎng)素和乙烯應(yīng)答的沉默元件。本發(fā)明還涉及特異結(jié)合于本發(fā)明的沉默元件的轉(zhuǎn)錄阻遏物，其包括以下被稱為“SEBF”的一種蛋白質(zhì)。B)現(xiàn)有技術(shù)簡(jiǎn)述作為對(duì)病原體感染的應(yīng)答，植物會(huì)被引發(fā)多種防御特異性事件。盡管正在發(fā)現(xiàn)信號(hào)級(jí)聯(lián)放大的主要成分，但是迄今為止，只鑒定出了極少的在轉(zhuǎn)錄水平整合這些信號(hào)的轉(zhuǎn)錄因子。PR基因是病原體侵入誘導(dǎo)的植物基因。這些基因被細(xì)劃分為11類。由于PR基因已經(jīng)被很好的表征，因而它們提供了用于研究防御基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的優(yōu)異模型。PR-10基因家族是PR基因類別中的一種。對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行的研究已經(jīng)鑒定出了在PR-10a基因調(diào)控中涉及的順式作用元件，其中所述的PR-10a基因是PR-10基因家族中的成員。位于核苷酸-135--105之間的誘導(dǎo)子(elicitor)應(yīng)答元件(ERE)對(duì)于誘導(dǎo)子誘導(dǎo)的PR-10a表達(dá)是必要且充分的。PBF-2，一種單鏈DNA結(jié)合因子，其可能在從ERE的PR-10a活化中發(fā)揮作用。已經(jīng)顯示，ERE的存在對(duì)PR-10a活化是充分的，去除位于-52--27之間的沉默元件(SE)會(huì)引起進(jìn)一步的活化作用，這一情況提示SE和ERE一起，參與了PR-10a的調(diào)控(Matton等，1993；Després等.，1995)。但是，全部SE活性所需的正確核酸序列尚未被提出。此外，特異結(jié)合于PR-10a的沉默元件(SE)的轉(zhuǎn)錄阻遏物的鑒定也并不知曉。因此，需要這樣的分離或純化的核酸，該核酸包含編碼全部SE活性的序列，并且其用于調(diào)節(jié)基因的活性、更具體是在植物應(yīng)答病原體中涉及的基因，，如PR-10a基因的活性。同樣需要這樣的方法和這樣的遺傳修飾植物在其中已經(jīng)引入了本發(fā)明的核酸，或者其中編碼全部SE活性的序列已經(jīng)被突變、刪除、或者沉默，從而調(diào)節(jié)了植物防御機(jī)制和對(duì)病原體的抗性。同樣長(zhǎng)期感覺(jué)需要這樣的轉(zhuǎn)錄阻遏物，其能夠調(diào)節(jié)植物防御機(jī)制和對(duì)病原體的抗性，更具體地需要這樣的轉(zhuǎn)錄阻遏物，其能夠特異結(jié)合到本發(fā)明的分離或純化的核酸上。同樣需要這樣的方法和遺傳修飾植物，其中本發(fā)明轉(zhuǎn)錄阻遏物的水平已經(jīng)得到了調(diào)節(jié)。同樣還需要這樣的有效方法和組合物，以調(diào)節(jié)植物對(duì)病原體的抗性或者耐受性，和/或調(diào)節(jié)植物對(duì)生長(zhǎng)素和/或?qū)σ掖嫉膽?yīng)答。本發(fā)明滿足了這些需要，本發(fā)明還滿足了其它的需要，所述的其它需要在本領(lǐng)域技術(shù)人員閱讀本發(fā)明說(shuō)明書時(shí)將是顯而易見的。發(fā)明簡(jiǎn)述依照第一方面，本發(fā)明涉及分離或者純化的核酸分子，其包含選自下面的序列a)在SEQIDNO21中列出的序列；b)與SEQIDNO21具有至少96％核苷酸序列同一性的核苷酸序列；和c)與編碼SEQIDNO22氨基酸序列的核酸具有至少75％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，以及含有這樣的核酸的克隆或表達(dá)載體。優(yōu)選地，所述的細(xì)胞和載體表達(dá)或者能夠指導(dǎo)由所述核酸編碼的肽的表達(dá)。在相關(guān)方面，本發(fā)明涉及包含選自下列氨基酸序列的分離或者純化的蛋白a)由先前定義的核酸所編碼的序列；b)與SEQIDNO22具有至少85％同一性的序列；c)與SEQIDNO22具有至少87％相似性的序列；d)SEQIDNO22中列出的序列；e)與由SEQIDNO21的核苷酸68-937所編碼的氨基酸序列具有至少85％同一性的序列；和f)與由SEQIDNO21的核苷酸68-937所編碼的氨基酸序列具有至少87％序列相似性的序列。本發(fā)明還涉及包含先前定義的任何核酸或者蛋白質(zhì)的組合物。在另一方面，本發(fā)明涉及植物蛋白質(zhì)核因子，其特別能夠介導(dǎo)對(duì)涉及植物防御機(jī)制的沉默元件的抑制。優(yōu)選地，所述的蛋白質(zhì)核因子是特異結(jié)合到BTGTCNC或者YTGTCNC序列上的植物轉(zhuǎn)錄阻遏物。最優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄阻遏物由此后被稱為“SEBF”的蛋白質(zhì)組成，其中“SEBF”代表沉默元件結(jié)合因子的縮寫。在一個(gè)實(shí)施方案中，描述了含有分離或者純化的SEBF蛋白或其功能性同系物的一種組合物。優(yōu)選地，所述的SEBF蛋白或同系物包含選自下面的氨基酸序列a)由具有與SEQIDNO21的核苷酸68-937至少85％同一性的序列的核酸編碼的序列；b)與SEQIDNO22具有至少85％同一性的序列；c)與SEQIDNO22具有至少87％相似性的序列；和d)SEQIDNO2中提供的序列。更優(yōu)選地，所述的SEBF蛋白純化自馬鈴薯，并且其具有的純化系數(shù)(purificationfactor)為大約90-大約20,700倍。依照另一方面，本發(fā)明涉及分離或者純化的核酸，其含有這樣的結(jié)合序列，蛋白質(zhì)核因子如PR-10a的沉默元件(SE)的轉(zhuǎn)錄阻遏物特異結(jié)合于所述的結(jié)合序列。優(yōu)選地，所述的結(jié)合序列含有序列BTGTCNC(SEQIDNO23)，更優(yōu)選為序列YTGTCNC(SEQIDNO24)。本發(fā)明還涉及分離或者純化的基因調(diào)控元件，其包含對(duì)于PR-10a的沉默元件(SE)在植物中的全部活性必需的核酸序列。優(yōu)選地，所述的基因調(diào)控元件由沉默元件組成，并且其包含序列GACTGTCAC(SEQIDNO26)或者序列BTGTCNC(SEQIDNO23)，更優(yōu)選為序列YTGTCNC(SEQIDNO24)。本發(fā)明還涉及包含所述基因調(diào)控元件的DNA構(gòu)建體，和包含所述基因調(diào)控元件或所述DNA構(gòu)建體的遺傳修飾的植物實(shí)體。依照相關(guān)方面，本發(fā)明涉及用于改變植物中基因表達(dá)的方法。該方法包含這樣的步驟在植物中改變核DNA結(jié)合蛋白結(jié)合到序列BTGTCNC。優(yōu)選的內(nèi)源性DNA結(jié)合蛋白的非限制性實(shí)例包括那些與SEBF具有至少48％同一性或者相似性的蛋白。更優(yōu)選地，所述的DNA結(jié)合蛋白由SEBF或具有與SEBF至少90％同一性或者相似性的功能性同系物組成。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，描述了一種用于增加目的基因表達(dá)的方法，該基因具有包含序列BTGTCNC的啟動(dòng)子區(qū)域。所述的方法包含這樣的步驟調(diào)節(jié)該基因的啟動(dòng)子區(qū)域以突變或刪除序列BTGTCNC。該基因可以是PR基因。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，描述了一種降低目的基因表達(dá)的方法，該基因具有缺乏序列BTGTCNC的啟動(dòng)子區(qū)域。所述的方法包含這樣的步驟以可操作連接的方式將序列BTGTCNC導(dǎo)入到啟動(dòng)子區(qū)域。在更具體的實(shí)施方案中，描述了一種植物性宿主(例如藻類，植物)，所述的植物性宿主被進(jìn)行了遺傳修飾，以使其表現(xiàn)出蛋白質(zhì)核因子的表達(dá)或者生物學(xué)活性發(fā)生改變，所述的蛋白質(zhì)核因子對(duì)序列BTGTCNC(SEQIDNO23)、優(yōu)選為YTGTCNC(SEQIDNO24)具有特異的結(jié)合活性，將變化的水平與相應(yīng)的未被遺傳修飾的植物性宿主進(jìn)行比較，所述的未被遺傳修飾的植物性宿主的內(nèi)源性水平未有變化。優(yōu)選的蛋白質(zhì)核因子是那些與SEBF具有至少48％同一性或者相似性的蛋白質(zhì)核因子。更優(yōu)選地，所述的蛋白質(zhì)核因子由SEBF或與SEBF具有至少90％的同一性或者相似性的功能性同系物組成。在一個(gè)甚至更具體的實(shí)施方案中，SEBF或同系物在植物性宿主中的表達(dá)或者生物學(xué)活性已經(jīng)被提高，使其顯示出選自下面的表型-對(duì)病原體的降低的抗性或者耐受性；-降低的生長(zhǎng)、生根和/或果實(shí)生產(chǎn)；-對(duì)生長(zhǎng)素除草劑(auxinicherbicide)的增加的抗性；-降低的乙烯生產(chǎn)；和-其果實(shí)成熟延遲和/或其果實(shí)受到保護(hù)而使其避免過(guò)成熟。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，SEBF或同系物在植物性宿主中的表達(dá)或者生物學(xué)活性已經(jīng)被降低，使其顯示出選自下面的表型-對(duì)病原體的增加的抗性或者耐受性；-增加的生長(zhǎng)、生根和/或果實(shí)生產(chǎn)；-對(duì)生長(zhǎng)素除草劑的增加的敏感性；-增加的乙烯生產(chǎn)；和-早期的果實(shí)成熟。本發(fā)明還包含用來(lái)獲得具有先前描述表型的植物性宿主的方法。典型地，這些方法包含在植物中調(diào)節(jié)(典型地，降低或者增加)SEBF或SEBF功能性同系物的表達(dá)或生物學(xué)活性這一步驟。本發(fā)明的另一相關(guān)方面涉及含有基因組的遺傳修飾的植物性宿主，其中的一種與在啟動(dòng)子區(qū)域存在或不存在序列BTGTCNC(SEQIDNO23)、優(yōu)選YTGTCNC(SEQIDNO24)相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄活性已經(jīng)被改變了。當(dāng)然，要將改變的生物學(xué)活性與相應(yīng)的未被遺傳修飾的植物性宿主進(jìn)行比較，所述的未被遺傳修飾的植物性宿主的內(nèi)源性生物學(xué)活性未有改變。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因的啟動(dòng)子區(qū)域包含序列BTGTCNC，并且所述的啟動(dòng)子區(qū)域已經(jīng)被遺傳修飾(例如突變、刪除)以使與序列BTGTCNC存在相關(guān)的抑制轉(zhuǎn)錄活性失活。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的啟動(dòng)子區(qū)域沒(méi)有序列BTGTCNC(SEQIDNO23)，而且此區(qū)域已經(jīng)被遺傳修飾以在其中以可操作的連接方式插入序列BTGTCNC。在另一方面，本發(fā)明涉及在植物中、特別是應(yīng)用于農(nóng)業(yè)的植物和具有園藝價(jià)值的植物中獲得特殊表型的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，描述了用于下述目的的方法-調(diào)節(jié)植物對(duì)病原體的抗性或者耐受性；-調(diào)節(jié)由生長(zhǎng)素控制的植物基因的誘導(dǎo)；-調(diào)節(jié)由植物生長(zhǎng)素控制的基因誘導(dǎo)；-增加植物的生長(zhǎng)、生根和/或果實(shí)生產(chǎn)；-調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的ACC合酶基因；-調(diào)節(jié)植物乙烯生產(chǎn)；和-調(diào)節(jié)植物質(zhì)體mRNAs的穩(wěn)定性、表達(dá)或活性。所有這些方法都包含這樣的步驟在植物中調(diào)節(jié)內(nèi)源性SEBF蛋白或者SEBF功能性同系物的表達(dá)或生物學(xué)活性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，描述了一種用于獲得表現(xiàn)出選自下列表型的遺傳修飾植物的方法-對(duì)病原體的增加的抗性或者耐受性；-增加的生長(zhǎng)、生根和/或果實(shí)生產(chǎn)；-對(duì)生長(zhǎng)素除草劑的增加的敏感性；-增加的乙烯生產(chǎn)；-早期的果實(shí)成熟；和-改變的質(zhì)體mRNAs的穩(wěn)定性、表達(dá)或活性。涉及所述表型的基因的啟動(dòng)子區(qū)域包含序列BTGTCNC(SEQIDNO23)，將所述植物的表型與相應(yīng)的未被遺傳修飾的植物相比較。所述的方法包含這樣的步驟對(duì)所述植物的基因組進(jìn)行遺傳修飾，以使與序列BTGTCNC存在相關(guān)的內(nèi)源性生物學(xué)活性失活。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，描述了一種用于獲得表現(xiàn)出選自下列表型的遺傳修飾植物的方法-對(duì)病原體的降低的抗性或者耐受性；-降低的生長(zhǎng)、生根和/或果實(shí)生產(chǎn)；-對(duì)生長(zhǎng)素除草劑的增加的抗性；-降低的乙烯生產(chǎn)；-其果實(shí)成熟延遲和/或其果實(shí)受到保護(hù)而使其避免過(guò)成熟；和-改變的質(zhì)體mRNAs的穩(wěn)定性、表達(dá)或活性。涉及所述表型的基因的啟動(dòng)子區(qū)域沒(méi)有序列BTGTCNC(SEQIDNO23)，將所述植物的表型與相應(yīng)的未被遺傳修飾的植物相比較。所述的方法包含這樣的步驟對(duì)所述植物的基因組進(jìn)行遺傳修飾，以在其中以可操作的連接方式插入序列BTGTCNC。在本發(fā)明的另外的實(shí)施方案中，描述了植物以及用來(lái)獲得所述植物的方法，表現(xiàn)出對(duì)病原體增加的(或者降低的)抗性或耐受性的植物；對(duì)其防御應(yīng)答的加快的(或者減緩的)誘導(dǎo)作用；對(duì)內(nèi)源性生長(zhǎng)素增加的(或者降低的)敏感性；和/或延遲的果實(shí)成熟或者提前的果實(shí)成熟。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，提供了一種用來(lái)調(diào)節(jié)植物對(duì)病原體的抗性或者耐受性的方法，其包含在植物中調(diào)節(jié)內(nèi)源性SEBF蛋白的表達(dá)或者生物學(xué)活性。更具體地，描述了一種用來(lái)增加植物對(duì)病原體的抗性或者耐受性的方法，其包含在植物中降低內(nèi)源性SEBF蛋白的表達(dá)或者生物學(xué)活性。減少內(nèi)源性SEBF蛋白的表達(dá)或者生物學(xué)活性可以通過(guò)下列方法來(lái)進(jìn)行，例如，通過(guò)在植物中表達(dá)SEBF的反義分子；通過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)SEBF水平或者活性的共抑制的蛋白；通過(guò)敲除或者化學(xué)突變編碼SEBF蛋白的基因；或者通過(guò)表達(dá)切割SEBFmRNA的核酶。該實(shí)施方案還描述了一種用來(lái)降低植物對(duì)病原體抗性或者耐受性的方法，其包含在植物中增加SEBF蛋白的表達(dá)或者生物學(xué)活性。增加內(nèi)源性SEBF蛋白的表達(dá)或者生物學(xué)活性可以通過(guò)例如在植物中引入可表達(dá)的SEBF編碼序列來(lái)實(shí)現(xiàn)。可以將該SEBF編碼序列處于可誘導(dǎo)的或者組成型表達(dá)的啟動(dòng)子控制之下。本發(fā)明還包含這樣的植物，所述的植物被遺傳修飾以使其在與相應(yīng)的未被遺傳學(xué)修飾的植物相比較時(shí)，具有對(duì)病原體增加的(或者降低的)抗性或者耐受性，其中，當(dāng)與相對(duì)應(yīng)的未被遺傳修飾植物相比，在所述遺傳修飾的植物中的內(nèi)源性SEBF蛋白的表達(dá)或者生物學(xué)活性被降低(或者增加)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供了一種用來(lái)調(diào)節(jié)植物對(duì)病原體抗性或者耐受性的方法，所述的植物在基因的啟動(dòng)子區(qū)域具有序列BTGTCNC(SEQIDNO23)，所述的方法包含在所述的植物中改變內(nèi)源性核DNA結(jié)合蛋白對(duì)序列BTGTCNC的結(jié)合。更具體地說(shuō)，該實(shí)施方案描述了一種用來(lái)增加植物對(duì)病原體抗性或者耐受性的方法，所述的植物在基因的啟動(dòng)子區(qū)域具有序列BTGTCNC(SEQIDNO23)，所述的方法包含在所述的植物中降低或者阻止內(nèi)源性核DNA結(jié)合蛋白對(duì)序列BTGTCNC的結(jié)合。該實(shí)施方案還描述了一種用來(lái)降低植物對(duì)病原體抗性或者耐受性的方法，該方法包含在所述的植物中，允許或者增加內(nèi)源性核DNA結(jié)合蛋白對(duì)包括序列BTGTCNC(SEQIDNO23)的基因的啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合。本發(fā)明還包含這樣的植物，所述的植物被這些方法進(jìn)行了遺傳修飾，以使其具有對(duì)病原體增加的(或者降低的)抗性或者耐受性。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，提供了這樣一種方法，該方法用來(lái)在植物中調(diào)節(jié)由生長(zhǎng)素控制的基因的誘導(dǎo)，所述的方法包含在植物中調(diào)節(jié)內(nèi)源性SEBF蛋白或者SEBF功能性同系物的表達(dá)或者生物學(xué)活性。更具體地說(shuō)，描述了一種用來(lái)增加植物生長(zhǎng)、生根和/或果實(shí)生產(chǎn)的方法，所述的方法包含在植物中降低內(nèi)源性SEBF蛋白或者SEBF功能性同系物的表達(dá)或者生物學(xué)活性。該實(shí)施方案還描述了一種用來(lái)增加植物對(duì)生長(zhǎng)素除草劑抗性的方法，此方法包含在植物中降低內(nèi)源性SEBF蛋白或者SEBF功能性同系物的表達(dá)或者生物學(xué)活性。本發(fā)明還包含被這些方法遺傳修飾的植物。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供了一種用來(lái)調(diào)節(jié)植物乙烯生產(chǎn)的方法，該方法包含在植物中調(diào)節(jié)內(nèi)源性SEBF蛋白或者SEBF功能性同系物的表達(dá)或者生物學(xué)活性。更具體地說(shuō)，描述了一種通過(guò)植物增加乙烯生產(chǎn)的方法，該方法包含在植物中降低內(nèi)源性SEBF蛋白或者SEBF功能性同系物的表達(dá)或者生物學(xué)活性。該實(shí)施方案還描述了一種通過(guò)植物降低乙烯生產(chǎn)的方法，該方法包含在植物中增加內(nèi)源性SEBF蛋白或者SEBF功能性同系物的表達(dá)或者生物學(xué)活性。本發(fā)明還包含被這些方法進(jìn)行了遺傳修飾以具有增加的(或者降低的)乙烯生產(chǎn)的植物。在上文中使用的植物性宿主，優(yōu)選由植物(單子葉植物或者雙子葉植物)組成、更優(yōu)選由蔬菜(vegetable)、豆科植物、樹、果樹、禾本科植物、谷類組成，甚至更優(yōu)選由馬鈴薯、番茄、煙草、棉花、稻屬、小麥、谷物、大麥、燕麥、油菜(canola)、大豆、豌豆、甘蔗、甜菜、草莓和香蕉。參照附圖，在對(duì)以下幾個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案的非限制性描述進(jìn)行閱讀以后，本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)顯而易見。附圖簡(jiǎn)述圖1是顯示SEBF結(jié)合于單鏈沉默元件的凝膠圖片。用10μg粗核制備物和20,000CPM的32P標(biāo)記的SE編碼鏈(泳道1；CS)或者非編碼鏈(泳道3；NCS)進(jìn)行EMSA。通過(guò)退火放射性標(biāo)記的非編碼和非標(biāo)記的(cold)編碼鏈來(lái)得到雙鏈探針(DS)。CS∶NCS的比率從4-6泳道分別為0.75∶1，1.5∶1和3∶1。在泳道2中沒(méi)有加入提取物。箭頭表明了CS，NCS和DS探針的位置以及SEBF在凝膠中的位移。圖2A，2B，2C和2D顯示了對(duì)馬鈴薯沉默元件(SE)的突變分析。圖2A本研究使用的報(bào)告基因構(gòu)建體(reporterconstruct)和突變寡核苷酸的示意圖。報(bào)告基因構(gòu)建體含有來(lái)自從-135到+136與編碼β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的細(xì)菌基因uidA融合的PR-10a啟動(dòng)子區(qū)域。顯示了誘導(dǎo)子應(yīng)答元件(ERE)，沉默元件(SE)和TATA盒的位置。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)用箭頭表示。野生型(WT；SEQIDNO45)和突變寡核苷酸m1-m5(SEQIDNOs1-5)之間的共同序列用虛線表示，突變的核苷酸用小寫字母表示。圖2B使用10μg的粗馬鈴薯塊莖核制備物和在圖2A中給出的、20,000CPM32P標(biāo)記的單鏈CS寡核苷酸所進(jìn)行的EMSA研究。圖2C使用10ng的純化的重組體SEBF和在圖2A中給出的20,000CPM32P標(biāo)記的單鏈CS寡核苷酸所進(jìn)行的EMSA研究。圖2D融合到uidA基因的PR-10a啟動(dòng)子的從-52到-27的序列被圖2A中給出的序列所取代。將所得到的質(zhì)粒經(jīng)電穿導(dǎo)入馬鈴薯葉原生質(zhì)體中，測(cè)定GUS活性。柱狀圖代表相對(duì)于野生型(WT＝1)的活性倍數(shù)。通過(guò)共電穿熒光素酶報(bào)告基因來(lái)校正轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果代表了來(lái)自6個(gè)單獨(dú)電穿孔最小值的平均值。誤差條線(errorbar)代表所述平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖3A，3B和3C所顯示的結(jié)果確定了共有SEBF結(jié)合位點(diǎn)。圖3A列出了用來(lái)精確描繪SEBF結(jié)合位點(diǎn)的寡核苷酸。用虛線表示野生型(SEQIDNO46)和突變體寡核苷酸m6-m20(SEQIDNOS6to20)之間的共同序列。突變的寡核苷酸用小寫字母表示。圖3B顯示SEBF結(jié)合到包含兩個(gè)突變核苷酸的寡核苷酸的EMSA。圖3C與圖3B一樣，只是寡核苷酸含有一個(gè)突變。使用10μg的粗核制備物和在圖3A中給出的20,000CPM32P標(biāo)記的單鏈寡核苷酸進(jìn)行研究。圖4是顯示SEBF純化的凝膠圖片。對(duì)來(lái)自每個(gè)SEBF純化步驟中的蛋白進(jìn)行考馬斯染色(泳道1-4)。將粗核提取物(粗；泳道1)加載到Q-瓊脂糖TM柱上。在兩輪親和純化(Aff.1，Aff.2；泳道3，泳道4)之前，在400mMNaCl(Q-seph；泳道2)洗脫SEBF。泳道5顯示了通過(guò)使用親和2純化的SEBF并將野生型編碼鏈作為放射性標(biāo)記的探針?biāo)M(jìn)行的southwestern(SW)實(shí)驗(yàn)。箭頭顯示了兩個(gè)純化的條帶。在左側(cè)顯示了分子量標(biāo)記。圖5顯示了SEBF的氨基酸序列(SEQIDNO22；GenBankTM登記號(hào)NoAF38431)。用箭頭表示轉(zhuǎn)運(yùn)肽切割的預(yù)測(cè)位點(diǎn)。兩個(gè)共有序列類型RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(cs-RBD)被加上了下劃線。用黑體顯示了通過(guò)氨基末端測(cè)序得到的氨基酸序列。圖6顯示了SEBF的細(xì)胞定位。將馬鈴薯葉分成胞質(zhì)、核和葉綠體。用12％的SDS-PAGE分離10μg的每個(gè)部分。將蛋白轉(zhuǎn)移到硝化纖維素上并用抗SEBF抗體來(lái)顯示SEBF的存在。第一泳道(10ng的重組體SEBF)顯示了用來(lái)免疫家兔的蛋白。將葉綠素(CHL)用作葉綠體標(biāo)記(數(shù)據(jù)用μg葉綠素表示[mg蛋白]-1)并將醇脫氫酶(ADH)作為胞質(zhì)標(biāo)記(數(shù)據(jù)表示為增加的OD[mg蛋白]-1[分]-1)。N.D不可檢測(cè)。圖7A，7B和7C顯示了SEBF的基因組結(jié)構(gòu)。圖7ASEBF的DNA印跡。在每個(gè)泳道上加載5μg消化的基因組DNA，并用圖7C中所示的來(lái)自SEBFcDNA的隨機(jī)標(biāo)記的XmnI片段進(jìn)行探查。在右側(cè)顯示了分子量標(biāo)記。圖7B對(duì)基因組DNA進(jìn)行的PCR分析。在圖7C中顯示了所述cDNA上寡核苷酸的位置(T-Z；泳道1-6)。泳道5和6，泳道3和4，以及泳道2和4的擴(kuò)增產(chǎn)物之間的大小差別，分別限定了內(nèi)含子1，2和3的大小。在右側(cè)顯示了分子量標(biāo)記。圖7C推導(dǎo)的SEBF基因組結(jié)構(gòu)。cDNA用線表示，編碼區(qū)用盒表示。氨基末端轉(zhuǎn)運(yùn)序列顯示成黑色。內(nèi)含子被顯示成從cDNA出現(xiàn)的三角。用字母命名在PCR反應(yīng)中使用的寡核苷酸(T，U，V，W，X，Y，Z；相應(yīng)于SEQIDNOS38-44)。從PCR分析圖7B推斷內(nèi)含子的位置和大小。用箭頭顯示限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)HinDIII(H)，EcoRI(E)，XmnI(Xn)。圖8顯示SEBF過(guò)表達(dá)抑制了PR-10a的表達(dá)。將前體SEBF的編碼序列(含有推定的轉(zhuǎn)運(yùn)肽)和對(duì)照蛋白的編碼序列每個(gè)插入質(zhì)粒pBI223D(效應(yīng)物質(zhì)粒(effectorplasmid))。將這些質(zhì)粒與圖2D中所述的報(bào)告基因質(zhì)粒(報(bào)告基因質(zhì)粒)共電穿孔到馬鈴薯葉原生質(zhì)體中。柱狀圖表示與過(guò)表達(dá)對(duì)照蛋白相比(對(duì)照＝100)，SEBF過(guò)表達(dá)對(duì)報(bào)告基因活性的影響。為了更容易參考圖2D給出了相對(duì)于野生型SE(WT＝1)的活性倍數(shù)。通過(guò)共電穿孔熒光素酶報(bào)告基因來(lái)校正轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果代表了來(lái)自3個(gè)單獨(dú)電穿孔最小值的平均值。誤差條線代表所述平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖9A和9B顯示了SEBF結(jié)合其它防御基因的啟動(dòng)子。圖9A列出了在此實(shí)驗(yàn)中使用的寡核苷酸。用小寫字母表示與PR-10a不同的核苷酸(SEQIDNO25和47；相應(yīng)于GenbankTMacc.No.M29041的核苷酸1426-1450)。在SEBF結(jié)合位點(diǎn)處加上了下劃線。ChtC2是來(lái)自馬鈴薯的幾丁質(zhì)酶基因(SEQIDNO48，相應(yīng)于GenbankTMacc.No.AF153195的核苷酸1264-1288)，CHN50是來(lái)自煙草的幾丁質(zhì)酶基因(SEQIDNO49，相對(duì)于GenbankTMacc.No.X51599的核苷酸1215-1239)。圖9B使用0.5μg的400mMQ-瓊脂糖凝膠部分和在圖9A中給出的20,000CPM32P標(biāo)記的單鏈寡核苷酸所進(jìn)行的EMSA研究。圖10顯示了SEBF(GenBankTMacc.No.AF38431)的DNA序列(SEQIDNO21)和蛋白序列(SEQIDNO22)。在DNA序列下面顯示了被翻譯的蛋白序列(見圖5；SEQIDNO22)。每個(gè)氨基酸都被顯示在密碼子的第一個(gè)核苷酸下面。圖11A，11B和11C顯示了SEBF結(jié)合到出現(xiàn)在大豆GH3啟動(dòng)子中的AuxRE序列。圖11AAuxRE(SEQIDNO55)與SEBF結(jié)合位點(diǎn)(SEQIDNO23)之間的比較。圖11B本研究中使用的寡核苷酸(SEQIDNOS50和51)。圖11C使用0.5μg的400mMQ-瓊脂糖TM部分和在圖11B中給出的20,000CPM32P標(biāo)記的寡核苷酸所進(jìn)行的EMSA研究。圖12A，12B和12C顯示了防御基因CHN50啟動(dòng)子中SE序列的功能性。圖12A使用0.5μg的400mMQ-瓊脂糖TM部分和在圖12C中給出的20,000CPM32P標(biāo)記的寡核苷酸所進(jìn)行的EMSA研究。圖12B將CHN50啟動(dòng)子或者其在圖12C中所示的突變版融合到uidA基因。將所得到的質(zhì)粒電穿孔入煙草葉原生質(zhì)體，測(cè)定GUS活性。通過(guò)共電穿孔熒光素酶報(bào)告基因來(lái)校正轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果代表了3個(gè)單獨(dú)電穿孔的最小值。誤差條線代表所述平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖12C本研究中使用的寡核苷酸(WT＝SEQIDNO52；M1＝SEQIDNO53；M2＝SEQIDNO54)。突變用小寫字母表示并且在下面加上了下劃線。用粗體字字符顯示SEBF結(jié)合位點(diǎn)。發(fā)明詳述A)定義為了更清楚更一致的理解本說(shuō)明書及權(quán)利要求書，包括這里給出的這些術(shù)語(yǔ)的范圍，在此提供了下列定義反義指的是能夠在植物中調(diào)控相應(yīng)基因表達(dá)的核酸分子。此處使用的反義分子還可以包括基因構(gòu)建體，該基因構(gòu)建體以與相對(duì)于它的或另一個(gè)啟動(dòng)子相反方向含有結(jié)構(gòu)基因組基因、cDNA基因或其部分。典型地，反義核酸序列不是蛋白合成的模板，但是其與其它分子(如基因或者RNA)中的互補(bǔ)序列相互作用，從而使那些分子的功能受到影響。化學(xué)衍生物如在這里使用的那樣，當(dāng)?shù)鞍?多肽包含額外的、通常并非該蛋白/多肽的一部分的化學(xué)“部分”時(shí)，該蛋白/多肽被稱為另一蛋白/多肽的“化學(xué)衍生物”，可以使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)加入所述的“部分”。這些“部分”可以提高蛋白/多肽的溶解性、吸收性、生物利用度、生物半壽期等等。通過(guò)使用這些“部分”，可以減少甚至消除任何不合需要的毒性和副作用。例如，可以將蛋白/多肽共價(jià)偶聯(lián)到生物相容的聚合物(聚乙烯醇，聚乙二醇等)上以提高穩(wěn)定性或者減少/增加其抗原性。防御基因應(yīng)答于病原體的挑戰(zhàn)而在植物中被誘導(dǎo)和/或涉及的一種基因。片段指的是分子如蛋白/多肽或者核酸的一部分，并且還指氨基酸或者核苷酸序列的任何部分。功能性同系物如通常理解和在此使用的那樣，指的是非天然的多肽或者核酸分子，該分子具有與天然多肽或者核酸分子的生物學(xué)活性實(shí)質(zhì)上相似的功能性生物學(xué)活性。優(yōu)選的功能性同系物是具有與天然多肽或者核酸分子“實(shí)質(zhì)上等同”(見后)序列的多肽或者核酸分子。所述的功能性同系物可以是天然存在的，或者可以通過(guò)使用本領(lǐng)域熟知的方法及原理，涉及天然存在的酶進(jìn)行一個(gè)或者多個(gè)氨基酸取代、刪除和/或添加而得到。蛋白的功能性同系物可以含有也可以不含有翻譯后修飾如共價(jià)連接的糖類，只要這樣的修飾對(duì)特定功能的實(shí)施并不是必需的。但是，應(yīng)該注意到，具有低于上面給出的相似性百分比的核苷酸或者氨基酸序列仍然能夠編碼具有所需活性的蛋白分子，這樣的蛋白分子可以仍然被認(rèn)為屬于本發(fā)明所包括的范圍內(nèi)，因?yàn)樗鼈兙哂行蛄斜Ｊ貐^(qū)域。術(shù)語(yǔ)“功能性同系物”指的是多肽或者核酸分子的“片段”、“區(qū)段”、“變體”、“類似物”或者“化學(xué)衍生物”。融合蛋白由雜交基因表達(dá)形成蛋白，所述的雜交基因由兩個(gè)基因序列組合而成。典型地，這是通過(guò)將cDNA克隆入其框架中具有一個(gè)已有基因的表達(dá)載體而實(shí)現(xiàn)的。遺傳修飾當(dāng)與術(shù)語(yǔ)“植物性宿主”或者“植物”一起使用的時(shí)候，其指的是將外源核酸引入一個(gè)或者多個(gè)植物性宿主(植物)細(xì)胞以產(chǎn)生遺傳修飾的植物性宿主或者植物。用于遺傳修飾植物性宿主如植物的方法在本領(lǐng)域?yàn)槿怂熘Ｔ谝恍┣闆r中，可以優(yōu)選永久的遺傳修飾，因?yàn)檫@樣，被遺傳修飾的植物可以被再生為完整的、有性能力的、能存活的遺傳修飾植物。被以永久方式遺傳修飾的植物優(yōu)選能夠自花授粉或者與其它同種植物之間進(jìn)行異花授粉，這樣，可以將被攜帶于種系的外源核酸插入或者殖入農(nóng)業(yè)上有用的植物變體中。內(nèi)源性或者內(nèi)源性水平指一種特定物質(zhì)或者一種特定物質(zhì)的濃度，所述的特定物質(zhì)通常在特定生長(zhǎng)時(shí)間和生長(zhǎng)階段被發(fā)現(xiàn)于植物中(內(nèi)在的)。該術(shù)語(yǔ)還包括可因突變產(chǎn)生的特定物質(zhì)或者蛋白的功能性同系物。在這里對(duì)化合物內(nèi)源性水平或者酶活性水平變化作出參照，所述改變涉及在正常的內(nèi)源性或已有水平之上或之下，所述的化合物水平或者酶活性升高或降低達(dá)30％、或者更優(yōu)選30，35，40，45或50％、或者甚至更優(yōu)選55，60，65，70或75％，或者還更優(yōu)選80，85，90，95％或更高?？梢允褂靡阎姆椒ê图夹g(shù)來(lái)測(cè)定化合物的水平或者酶的活性水平。表達(dá)指的是這樣過(guò)程，通過(guò)該過(guò)程，編碼信息的基因被轉(zhuǎn)化成在細(xì)胞中呈現(xiàn)并運(yùn)作的結(jié)構(gòu)。在cDNAs、cDNA片段和基因組DNA片段的情況下，轉(zhuǎn)錄的核酸隨后被翻譯成肽或蛋白以行使其功能，若有的話。術(shù)語(yǔ)“過(guò)表達(dá)”指的是與基準(zhǔn)表達(dá)水平相比，所測(cè)得的表達(dá)水平分別向上偏差，所述的基準(zhǔn)表達(dá)水平是建立于正常條件和正常功能水平下的表達(dá)水平。類似地，術(shù)語(yǔ)“過(guò)低表達(dá)(underpression)”指的是向下的偏差?！岸ㄎ槐磉_(dá)”的意思是使DNA分子被放置于這樣一段DNA序列的附近，所述的序列指導(dǎo)該序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯(即有利于其產(chǎn)生，例如，NAIP多肽、重組體蛋白或者RNA分子)。分離的或者純化的或者實(shí)質(zhì)上純凈的指的是“人工”改變其天然狀態(tài)，即如果其天然存在，則其已經(jīng)發(fā)生改變或者已經(jīng)被從原始環(huán)境中移出，或者兩種情況都發(fā)生。例如，天然存在于活有機(jī)體中的多核苷酸或者蛋白/多肽不是“分離的”；從其天然狀態(tài)的共存物質(zhì)中分離的、通過(guò)克隆，擴(kuò)增和/或化學(xué)合成而得到的相同的多核苷酸則如在此所用的術(shù)語(yǔ)那樣是“分離的”。另外，通過(guò)轉(zhuǎn)化、遺傳操作或者通過(guò)任何其它重組方法被引入到有機(jī)體中的多核苷酸或蛋白/多肽是“分離的”，即使它仍然存在于所述的有機(jī)體中。調(diào)節(jié)指的是這樣的過(guò)程，通過(guò)此過(guò)程，特定的變量被調(diào)節(jié)成確定的比例。核酸任何DNA、RNA序列或者具有一個(gè)或更多核苷酸的分子，包括編碼一個(gè)完全基因的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)用來(lái)包括所有的核酸，無(wú)論是天然存在還是非天然存在于特定細(xì)胞、組織或者有機(jī)體中的核酸。其包括DNA及其片段、RNA及其片段、cDNAs及其片段、表達(dá)的序列標(biāo)記、包括隨機(jī)化人工序列在內(nèi)的人工序列。植物或者植物實(shí)體指的是全部植物或者植物的一部分，其包含，例如，植物的細(xì)胞、植物的組織、外植體、或者植物的種子。該術(shù)語(yǔ)還將包括懸浮培養(yǎng)或者組織培養(yǎng)形式的植物，包括但不限于calli的培養(yǎng)物、原生質(zhì)體、胚、器官、細(xì)胞器等等。多肽指任何超過(guò)兩個(gè)氨基酸的鏈，不管其有沒(méi)有翻譯后修飾如糖基化作用或磷酸化作用。啟動(dòng)子區(qū)域指的是一段在特定基因調(diào)控中涉及的核苷酸序列。通常位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的5’位置。典型地，所述的啟動(dòng)子區(qū)域包括TATA盒和所有的調(diào)控元件(例如為了對(duì)特定基因進(jìn)行正確調(diào)控而對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控的沉默元件)?？剐曰蛘吣褪苄钥剐灾傅募?xì)胞或者有機(jī)體(如植物)由于病原體(如病毒、真菌、昆蟲等)侵襲，顯示出基本上沒(méi)有表型改變。耐受性指的是細(xì)胞或者有機(jī)體，盡管由于病原體的侵襲，可能呈現(xiàn)出一些表型改變，但是并不具有本質(zhì)上減少的生殖能力或者本質(zhì)上改變的新陳代謝。SEBF核酸指的是任何編碼這樣的植物多肽的核酸(見上)，在其它事情中，所述的植物多肽能夠介導(dǎo)對(duì)涉及植物防御機(jī)制的沉默元件的抑制并且能夠特異地結(jié)合到序列BTGTCNC或者YTGTCNC上，所述的植物多肽與SEQ.ID.NO23中所示的氨基酸序列具有至少90％、優(yōu)選至少95％、特別優(yōu)選100％的同一性或者相似性。當(dāng)涉及植物SEBF核酸的時(shí)候，更特別地涉及編碼SEQ.ID.NO23的SEQ.ID.NO22中闡述的核酸。SEBF蛋白或者SEBF多肽指的是由前述SEBF核酸編碼的多肽、其片段、或者功能性SEBF同系物。相似性/互補(bǔ)性在核酸序列的語(yǔ)境中，這些術(shù)語(yǔ)指的是在低等的、選擇地并且優(yōu)選中等的、和選則地并且最優(yōu)選高等嚴(yán)格(如下所定義)的條件下的可雜交相似性。特異結(jié)合指的是識(shí)別并結(jié)合蛋白的抗體，但是該抗體基本上不識(shí)別并結(jié)合樣品如生物學(xué)樣品中的其它分子，所述的樣品天然包含蛋白質(zhì)。實(shí)質(zhì)上相同指的是多肽或者核酸表現(xiàn)出與參照氨基酸或者核酸序列具有至少50，55，60，65，70，75％、優(yōu)選80或85％、更優(yōu)選90，95％、最優(yōu)選97％或99％同一性或相似性。對(duì)于多肽而言，對(duì)照序列的長(zhǎng)度通常為至少20個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少25，30或40個(gè)氨基酸，更優(yōu)選至少50或75個(gè)氨基酸，最優(yōu)選至少100個(gè)氨基酸。對(duì)于核酸而言，對(duì)照序列的長(zhǎng)度通常為至少50個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少60個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少75個(gè)核苷酸，最優(yōu)選100個(gè)核苷酸。典型地，使用具有其中指定的默認(rèn)參數(shù)的序列分析軟件(例如.，SequenceAnalysisSoftwarePackageoftheGeneticsComputerGroup，UniversityofWisconsinBiotechnologyCenter，1710UniversityAvenue，Madison，Owl53705)來(lái)測(cè)定序列同一性。該軟件程序通過(guò)給各種取代、刪除和其它修飾分配相似度來(lái)配比類似序列。保守的取代典型包括下列的取代甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸擑、異亮氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、精氨酸和苯丙氨酸、酪氨酸。嚴(yán)格為了定義嚴(yán)格的水平，便利地參照Maniatis等.(1982)第387-389頁(yè)、尤其是第11段。低等的嚴(yán)格在此被定義為在37-45℃處于4-6XSSC/1％(w/v)SDS中2-3小時(shí)。取決于雜交所涉及的核酸的來(lái)源及濃度，也可以使用選擇的嚴(yán)格條件如中等的嚴(yán)格條件或者高等的嚴(yán)格條件，中等的嚴(yán)格條件在此被認(rèn)為在大于或等于45℃處于1-4XSSC/0.5-1％(w/v)SDS中2-3小時(shí)；高等的嚴(yán)格條件在此被認(rèn)為在大于或等于60℃處于0.1-1XSSC/0.1-1.0％SDS中1-3小時(shí)。轉(zhuǎn)化的或者轉(zhuǎn)染的或者轉(zhuǎn)基因細(xì)胞指的是將外源的核酸、典型為基因或者基因調(diào)控序列，引入到整個(gè)植物或其一部分中?！稗D(zhuǎn)化”指的是用于將外源分子引入細(xì)胞的任何方法。農(nóng)桿菌屬轉(zhuǎn)化、PEG處理、脂轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、電穿孔、和沖擊式轉(zhuǎn)染(ballistictransformation)不過(guò)是可以使用的幾種教導(dǎo)而已。轉(zhuǎn)基因植物任何具有包含這樣的DNA序列的細(xì)胞的植物，所述的DNA序列已經(jīng)通過(guò)特定的方法被插入到細(xì)胞中，并且成為了由此細(xì)胞發(fā)育而成的植物基因組的一部分，優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因植物是那些用外源核酸轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，通過(guò)使用遺傳工程的方法，所述的外源核酸被引入到個(gè)體植物細(xì)胞的基因組中。載體一種自我復(fù)制的RNA或者DNA分子，其可被用來(lái)將RNA或者DNA片段從一個(gè)有機(jī)體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)有機(jī)體。載體對(duì)于操縱遺傳構(gòu)建體特別有用，而且不同的載體在克隆步驟中可以具有特別適于在接受體中表達(dá)蛋白的特性，而且不同的載體可以含有不同的選擇性標(biāo)記。細(xì)菌質(zhì)粒是常用的載體。優(yōu)選地，本發(fā)明的載體能夠促進(jìn)核酸轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞和/或促進(jìn)其整合入植物基因組。植物性宿主指的是包含葉綠體并且能夠進(jìn)行光合作用的細(xì)胞、組織、器官或者有機(jī)體。該術(shù)語(yǔ)意圖還將包括被加以修飾以得到這些功能的宿主。藻類和植物是植物性宿主的實(shí)例。創(chuàng)傷和應(yīng)激可誘導(dǎo)的基因由創(chuàng)傷或者非生物的應(yīng)激如紫外光、干旱、鹽度誘導(dǎo)的植物基因。B)發(fā)明概述本發(fā)明的發(fā)明者現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，只有9個(gè)核苷酸是PR-10a基因的沉默元件(SE)的全部活性所必需的，即序列GACTGTCAC(SEQIDNO26)。本發(fā)明的發(fā)明者還鑒定了一種核因子(此后確定為“SEBF”)，該核因子顯示出與序列BTGTCNC(SEQIDNO23)特異結(jié)合的序列。資料庫(kù)檢索顯示許多PR基因的啟動(dòng)子中存在此結(jié)合序列。本發(fā)明的發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)序列BTGTCNC與生長(zhǎng)素應(yīng)答元件的序列顯示出高度的序列相似性，這強(qiáng)烈提示該序列與SEBF在由植物激素生長(zhǎng)素及其功能類似物所誘導(dǎo)基因的調(diào)控中起作用。另外，本發(fā)明者已經(jīng)證明SEBF可以識(shí)別并結(jié)合相應(yīng)于大豆GH3基因的AuxRE的序列。本發(fā)明的發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)SEBF可以通過(guò)生長(zhǎng)素的作用參與乙烯合成的調(diào)控，這是因?yàn)镾EBF結(jié)合元件出現(xiàn)在ACC合酶基因的啟動(dòng)子中，該基因被生長(zhǎng)素所誘導(dǎo)并且編碼乙烯生物合成中的一種關(guān)鍵的酶一另一種植物激素。本發(fā)明的發(fā)明者還已經(jīng)對(duì)SEBF進(jìn)行了分子表征。SEBF蛋白被純化均勻、被部分化學(xué)測(cè)序，而且編碼SEBF的cDNA被分離并被測(cè)序。推導(dǎo)得到的SEBF氨基酸序列顯示出與葉綠體RNA結(jié)合蛋白具有高度的序列相似性。葉細(xì)胞的亞細(xì)胞劃分證實(shí)SEBF位于葉綠體和核，提示其在這兩個(gè)細(xì)胞區(qū)室中均發(fā)揮功能。重組體SEBF在瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中的過(guò)表達(dá)，引起PR-10a-uidA報(bào)告基因融合體出現(xiàn)SE-依賴性轉(zhuǎn)錄抑制，證實(shí)了SEBF作為轉(zhuǎn)錄阻遏物的作用。通過(guò)使用酵母雙雜交系統(tǒng)，本發(fā)明的發(fā)明者進(jìn)一步鑒定出了與SEBF相互作用的蛋白。其中的一種蛋白是Pti4，它是在植物病原體誘導(dǎo)的防御應(yīng)答過(guò)程中PR基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子。有趣的是，已知Pti4與腈水解酶相互作用，腈水解酶是一種涉及生長(zhǎng)素生物合成的酶。此外，Pti4是乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(EREBP)中的一員，已知EREBP涉及植物對(duì)乙烯的應(yīng)答。另外，在雙雜交研究中發(fā)現(xiàn)，SEBF與Pti4的ERF結(jié)構(gòu)域相互作用。ERF結(jié)構(gòu)域特別令人感興趣，因?yàn)樗谒幸蚁?yīng)答因子中都是保守的。本發(fā)明的發(fā)明者還已經(jīng)證明存在于煙草幾丁質(zhì)酶防御基因CHN50啟動(dòng)子中的SE元件能夠結(jié)合SEBF，而且在此元件中發(fā)生的防止SEBF結(jié)合的突變使轉(zhuǎn)錄被去阻遏(unblock)。這一結(jié)果特別令人感興趣，因?yàn)樵搯?dòng)子含有作為Pti4結(jié)合位點(diǎn)的GCC盒，而且乙烯可能通過(guò)與乙烯應(yīng)答因子如Pti4的結(jié)合來(lái)調(diào)控該啟動(dòng)子。C)含有特異結(jié)合序列的核酸本發(fā)明的第一方面提供了分離或純化的核酸，所述核酸包含蛋白質(zhì)核因子特異結(jié)合于上面的結(jié)合序列。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的結(jié)合序列為BTGTCNC(SEQIDNO23)，B相應(yīng)于任何除了A之外的核苷酸(即T，C或者G)，N相應(yīng)于A，T，C或者G。更優(yōu)選地，本發(fā)明的結(jié)合序列是YTGTCNC(SEQIDNO24)，Y相應(yīng)于嘧啶(pyridine)(即T或者C)。確切的結(jié)合序列可以取決于特定的基因和有機(jī)體而變化，如后文表5中所例舉。依照本發(fā)明的相關(guān)方面，提供了這樣的分離或純化的核酸，該核酸包含一段由含有對(duì)于PR-10a沉默元件的全部活性必需的核酸序列的基因調(diào)控元件組成的序列。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述的基因調(diào)控元件由沉默元件組成，而且其包含序列BTGTCNC(SEQIDNO23)，更優(yōu)選為序列YTGTCNC(SEQIDNO24)。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述的植物是馬鈴薯，而且所述的PR-10a沉默元件(SE)的必需序列是CTGTCAC(SEQIDNO25或47)。本發(fā)明還涉及包含上述基因調(diào)控元件和/或結(jié)合序列的DNA構(gòu)建體，和包含所述基因調(diào)控元件、所述結(jié)合序列和/或所述DNA構(gòu)建體的遺傳修飾的植物實(shí)體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將所述的調(diào)控元件有效連接到可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子上。如下文中實(shí)施例中所示，序列BTGTCNC被發(fā)現(xiàn)是稱為SEBF的PR-10a沉默元件(SE)的轉(zhuǎn)錄阻遏物的特異結(jié)合序列。因此，序列BTGTCNC是涉及基因活性調(diào)節(jié)的重要序列，所述的基因?qū)⑿蛄蠦TGTCNC整合到了它們的啟動(dòng)子區(qū)域。因此，本發(fā)明還涉及遺傳修飾的植物性宿主，其中與在該基因的啟動(dòng)子區(qū)域中存在或不存在序列BTGTCNC相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄活性已經(jīng)被改變了。因此，本發(fā)明的一個(gè)相關(guān)方面涉及用于在植物中改變基因表達(dá)的方法。所述的方法包含在所述植物中改變核DNA結(jié)合蛋白對(duì)序列BTGTCNC的結(jié)合這一步驟。盡管核DNA結(jié)合蛋白優(yōu)選由SEBF組成，但是，本領(lǐng)域地技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解SEBF并不是能夠結(jié)合到序列BTGTCNC的唯一蛋白質(zhì)核因子，因?yàn)槠渌鞍踪|(zhì)核因子也可能如此。優(yōu)選的核DNA結(jié)合蛋白的非限制性列表包括與SEBF具有至少48％的同一性或相似性的蛋白，更特別地那些列在下文表6中的蛋白。本發(fā)明還包括在低等的、優(yōu)選中等的、更優(yōu)選高等嚴(yán)格的條件下，與核酸序列BTGTCNC或與其互補(bǔ)序列雜交的序列。D)SEBF和其它結(jié)合到序列BTGTCNC上的多肽根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了分離或純化的核酸分子，該核酸分子編碼能夠特異結(jié)合到序列BTGTCNC(SEQIDNO23)、更優(yōu)選為序列YTGTCNC(SEQIDNO24)上的多肽。本發(fā)明還提供了能夠特異結(jié)合到序列BTGTCNC(SEQIDNO23)、更優(yōu)選為序列YTGTCNC(SEQIDNO24)上的、分離或純化的多肽。所述多肽以及所述結(jié)合序列(見表5)的同一性可以依賴于有機(jī)體而變化，而且可以依賴于活性將進(jìn)行調(diào)節(jié)的特定基因而變化。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的多肽與圖5中所示的氨基酸序列(SEQIDNO22)及其功能類似物具有至少80或85％、更優(yōu)選至少90或95％和甚至更優(yōu)選97％，99％或100％的同一性的氨基酸序列。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，所述的多肽具有由這樣的核酸編碼的氨基酸序列，所述的核酸與圖10中所示的核酸序列(SEQIDNO21)、與其可讀框(核苷酸68-973)、或與其片段具有至少80或85％、更優(yōu)選至少90，95％和甚至更優(yōu)選97％，99％或100％的同一性。更優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽還能夠調(diào)節(jié)將序列BTGTCNC或者YTGTCNC整合到其啟動(dòng)子區(qū)域的基因的活性。不需要做過(guò)多的實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員就應(yīng)該能夠確定編碼本發(fā)明多肽的準(zhǔn)確的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明多肽是被稱為“SEBF”的轉(zhuǎn)錄阻遏物。該SEBF的cDNA序列和預(yù)測(cè)的氨基酸序列顯示在圖10和“序列表”部分中。SEQIDNO21相應(yīng)于馬鈴薯的SEBFcDNA，SEQIDNO22相應(yīng)于所述蛋白的預(yù)測(cè)的氨基酸序列。馬鈴薯的SEBF基因編碼一種289個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的蛋白。Insilico分析顯示，馬鈴薯SEBF蛋白具有以下特征其分子量為大約30810g/mol，等電點(diǎn)為大約4.6；不穩(wěn)定指數(shù)為大約49；脂肪族指數(shù)為大約66.8；總平均的親水性(grandaverageofhydropathicity)(GRAVY)為大約-0.5。其還包含很多潛在的磷酸化位點(diǎn)(18絲氨酸，3蘇氨酸，和5酪氨酸)；還有10個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)。在變性條件下，在SDSPAGE上，其具有明顯的、約為28-約29kDa的分子量。其還具有轉(zhuǎn)錄阻遏物的生物學(xué)活性。進(jìn)行胚細(xì)胞研究來(lái)鑒定SEBF和其它已有序列的序列同一性。下文中的表1提供了顯示與SEBF相似的序列的列表(核苷酸對(duì)核苷酸)。表2提供了與SEBF同源的蛋白的列表(蛋白對(duì)蛋白)，表3提供了顯示與SEBF相似的預(yù)測(cè)蛋白的列表(蛋白對(duì)翻譯的核苷酸)?？梢酝ㄟ^(guò)任何適當(dāng)?shù)姆椒▉?lái)制備本發(fā)明的多肽和核酸分子、更具體是SEBF和/或是結(jié)合序列。例如當(dāng)條件合適的時(shí)候，它們可以通過(guò)化學(xué)合成來(lái)得到。也可以通過(guò)使用涉及克隆或者表達(dá)載體的生物學(xué)方法來(lái)制備它們。這些載體應(yīng)該包含整合目的核酸分子的多核苷酸序列，例如和/或包含編碼目的肽的多核苷酸序列。因此，本發(fā)明包括這樣的克隆或者表達(dá)載體，更具體地包括編碼SEQIDNO22的那些和包含SEQIDNO21的核苷酸68-937的那些。另外，可以使用諸如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和DNA雜交這樣的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)將額外的SEBF同系物克隆到其它植物物種中。因此，在一個(gè)相關(guān)的方面，本發(fā)明涉及用來(lái)體外生產(chǎn)多肽的方法，所述的多肽能夠特異結(jié)合序列BTGTCNC(SEQIDNO23)、更優(yōu)選為序列YTGTCNC(SEQIDNO24)，并且優(yōu)選具有轉(zhuǎn)錄阻遏物的生物學(xué)活性。該方法包括以下步驟1)在合適的培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)整合了前述表達(dá)載體的細(xì)胞，和任選地2)在培養(yǎng)基中收集由這些細(xì)胞產(chǎn)生的多肽。用來(lái)生產(chǎn)這樣的遺傳修飾的細(xì)胞的方法和用來(lái)在蛋白/肽生產(chǎn)中使用這些細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域?yàn)槿怂熘?，此處將不再進(jìn)行詳述。表1顯示與SEBF相似性(核苷酸對(duì)核苷酸)的核苷酸序列表2與SEBF相似的蛋白表3顯示與SEBF相似性(蛋白對(duì)翻譯的核苷酸)的預(yù)測(cè)蛋白E)SEBF抗體本發(fā)明的多肽和多核苷酸也可以用來(lái)生產(chǎn)能夠識(shí)別并結(jié)合其的多克隆或者單克隆抗體。因此，能夠特異結(jié)合SEBF蛋白和/或其功能性同系物，如其它植物物種中的SEBF同源蛋白的純化的抗體(單克隆或多克隆)也是本發(fā)明的特征。本發(fā)明的實(shí)施例部分描述了SEBF抗體的制備。該抗體還被用來(lái)測(cè)試煙草葉提取物，顯現(xiàn)出了28和29kDa的兩條濃條帶(可能分別相應(yīng)于cp29A和cp29B)。初步測(cè)試還表明所制備的SEBF抗體還識(shí)別鼠耳芥(Arabidopsisthaliana)中的同源蛋白。通過(guò)使用上述的SEBF蛋白或多肽，許多方法都可以用來(lái)制備本發(fā)明的抗體。例如，可以將所述的SEBF多肽或其片段給予動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生?；蛘?，這里使用的抗體可以是通過(guò)使用雜交瘤技術(shù)(見例如Hammerling等.，InMonoclonalAntibodiesandT-CellHybridomas，Elsevier，NY，1981)制備的單克隆抗體。SEBF抗體可以用于在植物中阻止SEBF的作用。例如，可以制造表達(dá)SEBF抗體(單鏈抗體除外)的轉(zhuǎn)基因植物。該抗體與SEBF的結(jié)合將會(huì)抑制其活性，從而導(dǎo)致處于SEBF控制下的基因去抑制。因此，優(yōu)選的抗體是“中和的”抗體?！爸泻偷摹笨贵w指的是能夠干擾SEBF多肽一切生物學(xué)活性的抗體，特別是能夠干擾SEBF抑制基因活性能力的抗體。優(yōu)選地，所述的中和抗體可以使SEBF多肽的能力降低50，55，60或者65％，更優(yōu)選為70，75，80或者85％，最優(yōu)選為90，95，99％或更多?？梢允褂冒切┰诖嗣枋龅脑趦?nèi)的任何標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試來(lái)評(píng)價(jià)可能中和的抗體。一旦產(chǎn)生，單克隆的和多克隆的抗體優(yōu)選通過(guò)蛋白印跡、免疫沉淀分析或者任何其它合適的方法來(lái)測(cè)試特異的SEBF識(shí)別。或者，可以將所述的抗體通過(guò)與質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽翻譯融合而將其特異地靶向質(zhì)體，從而引起對(duì)SEBF的質(zhì)體功能的特異抑制?？梢酝ㄟ^(guò)將所述抗體的表達(dá)處于可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的控制之下來(lái)控制其表達(dá)的時(shí)間，所述的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子例如可以通過(guò)雌激素處理誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。本發(fā)明因此還包括這樣的抗體和使用其的方法。用來(lái)生產(chǎn)抗體的方法在本領(lǐng)域?yàn)槿怂熘?。F)遺傳修飾的細(xì)胞和植物本發(fā)明還涉及植物性宿主，特別是植物，其被遺傳修飾以降低(或者增加)與在植物基因的調(diào)控/啟動(dòng)子區(qū)域存在(或不存在)序列BTGTCNC(SEQIDNO23)、更優(yōu)選為序列YTGTCNC(SEQIDNO24)相關(guān)的常規(guī)生物學(xué)活性。取決于將在下文中加以描述的具體用途，這樣的植物是有利的在該植物中，至少有一些細(xì)胞已經(jīng)被遺傳修飾而使序列BTGTCNC失活(突變、刪除等等)。在其它情況下，優(yōu)選將序列BTGTCNC或者YTGTCNC插入到所述植物的特定基因中。本發(fā)明還涉及被遺傳修飾以用來(lái)表達(dá)較高(或者較低)水平多肽的細(xì)胞和有機(jī)體，所述的多肽能夠特異結(jié)合序列BTGTCNC(SEQIDNO23)，更優(yōu)選為序列YTGTCNC(SEQIDNO24)(即細(xì)胞或者有機(jī)體內(nèi)源水平的調(diào)節(jié))。取決于將在下文中加以描述的具體用途，這樣的細(xì)胞、特別是植物細(xì)胞是有利的所述的細(xì)胞已經(jīng)被遺傳修飾而增加了至少一種能夠特異結(jié)合序列BTGTCNC或者YTGTCNC的多肽的水平，例如SEBF蛋白或功能性SEBF同系物。在其它情況下，可以優(yōu)選降低這些多肽的水平。在H部分中，描述了如何制備和/或使用這些遺傳修飾植物的具體實(shí)例。G)組合物本發(fā)明還涉及用于下列用途的組合物1)在植物中調(diào)節(jié)與存在(或不存在)序列BTGTCNC(SEQIDNO23)、更優(yōu)選為序列YTGTCNC(SEQIDNO24)相關(guān)的常規(guī)生物學(xué)活性，和/或2)在植物中調(diào)節(jié)能夠特異結(jié)合序列BTGTCNC(SEQIDNO23)，和更優(yōu)選為序列YTGTCNC(SEQIDNO24)的多肽的表達(dá)水平(即所述植物內(nèi)源性水平的調(diào)節(jié))。這樣的組合物應(yīng)包含有效數(shù)量的、與稀釋劑或載體相結(jié)合的、至少一種能夠直接或間接實(shí)現(xiàn)一種或者全部上述所需效果的化合物。除草劑是能夠通過(guò)結(jié)合和抑制特定植物蛋白的功能來(lái)影響植物生理和發(fā)育的小分子的實(shí)例。在施用本發(fā)明的組合物之后，對(duì)所述的化合物及其數(shù)量進(jìn)行選擇，這樣以致當(dāng)與不存在該組合物的相應(yīng)植物相比較時(shí)，在本發(fā)明中所用的植物中至少有一些細(xì)胞發(fā)生了所需的調(diào)節(jié)作用。依照本發(fā)明合適組合物的更具體的但非限制性實(shí)例將在下文的H部分給出。被適當(dāng)組合物處理過(guò)的植物可以表現(xiàn)出對(duì)病原體的誘導(dǎo)的抗性。取決于處理的時(shí)間，也可以將所述的組合物用于增加果實(shí)成熟和數(shù)量，或者用來(lái)誘導(dǎo)衰老。所述的載體或者稀釋劑可以是溶劑如水、油或者醇。所述的組合物還可以包含其它的活性制劑如肥料和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。如果需要，也可以在存在或不存在殺真菌劑或殺蟲劑的情況下，用乳化劑配制所述的誘導(dǎo)組合物。本發(fā)明實(shí)踐中使用的化合物的精確數(shù)量將取決于所需的應(yīng)答類型、所用的制劑和所處理的植物的類型。H)本發(fā)明用途的具體實(shí)例以下的實(shí)例是對(duì)本發(fā)明應(yīng)用的廣泛范圍進(jìn)行的描述，不是意圖限制了本發(fā)明的范圍。I-植物對(duì)病原體的增加的抗性或耐受性由于SEBF是防御應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄阻遏物，而且已經(jīng)在大量的防御基因中發(fā)現(xiàn)了其結(jié)合位點(diǎn)，已顯示所述防御基因的表達(dá)引起或者參與植物中的防御應(yīng)答，因此，抑制或者減少SEBF累積(和/或功能性SEBF同系物累積)和/或抑制或者減少常規(guī)的蛋白生物學(xué)活性能夠增加植物對(duì)病原體的抗性或能夠更快地誘導(dǎo)植物的防御機(jī)制。許多方法可以用來(lái)在所有植物物種中實(shí)現(xiàn)這種SEBF內(nèi)源水平的降低和/或SEBF生物學(xué)活性(和/或功能性SEBF同系物的活性或水平)的降低，這些方法包括通過(guò)在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)SEBF基因或其部分基因的反義拷貝；通過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)SEBF共抑制機(jī)制的正義拷貝(sensecopy)；通過(guò)在其中插入外源DNA分子來(lái)形成SEBF基因敲除；通過(guò)SEBF基因的化學(xué)誘變；通過(guò)表達(dá)切割SEBFmRNA的核酶；或者通過(guò)任何其它引起SEBF基因表達(dá)降低、SEBFmRNA累積的方法，和其它合適的方法。類似地，也可以遺傳修飾SEBF結(jié)合位點(diǎn)，使序列BTGTCNC(或者YTGTCNC)失活(移除、突變、刪除等)。將序列BTGTCNC(或者YTGTCNC)加入到目的基因的啟動(dòng)子中，會(huì)降低該特定基因的表達(dá)水平。在一些情況下，例如在內(nèi)源性SEBF活性非常弱的情況下，除了插入SE序列，可能還需要SEBF的過(guò)表達(dá)來(lái)使SE進(jìn)行正確的基因調(diào)控。另一方面，移除序列BTGTCNC(或者YTGTCNC)將會(huì)得到更高的序列表達(dá)。這樣的啟動(dòng)子改變?cè)赟EBF(和/或功能性SEBF同系物)水平無(wú)法改變的植物中是非常有用的。例如，從防御基因中移除該序列并在轉(zhuǎn)基因植物中引入該修飾基因，會(huì)引起該基因的組成型表達(dá)和引起對(duì)病原體更高的抗性。SEBF(和/或功能性SEBF同系物)的過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致植物對(duì)感染的抗性降低。這一性質(zhì)對(duì)于控制轉(zhuǎn)基因植物傳播也可以是有用的。例如，可以進(jìn)一步遺傳修飾已經(jīng)被設(shè)計(jì)成表達(dá)藥用化合物的轉(zhuǎn)基因植物以使其對(duì)病原體高度敏感。通過(guò)使用已知不會(huì)感染野生型植物的病原體來(lái)處理這些植物，將會(huì)很容易將它們從耕地中除去。II.修飾的植物對(duì)生長(zhǎng)素和乙烯的應(yīng)答i)生長(zhǎng)素生長(zhǎng)素是擴(kuò)散性生長(zhǎng)促進(jìn)植物激素。存在于大多數(shù)植物中的主要生長(zhǎng)素是吲哚-3-乙酸(IAA)。生長(zhǎng)素在低濃度下有活性，合成類似物2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和萘-1-乙酸(naphtalene-1-aceticacid)(NAA)被應(yīng)用于農(nóng)業(yè)以誘導(dǎo)生根和促進(jìn)果實(shí)的固定和發(fā)育。在高濃度下，生長(zhǎng)素抑制植物生長(zhǎng)并且通常被用作除草劑。吲哚-3-乙酸主要由L-色氨酸合成，但選擇的途徑涉及通過(guò)腈水解酶的作用來(lái)轉(zhuǎn)換吲哚-3-乙腈。由于生長(zhǎng)素活化控制乙烯生產(chǎn)的ACC合酶基因，所以高濃度的生長(zhǎng)素通常伴隨著乙烯生物合成速度的增加。如下文中實(shí)施例1中所示，生長(zhǎng)素應(yīng)答元件與SEBF的重疊。這說(shuō)明SEBF(和/或功能性SEBF同系物)能夠結(jié)合到生長(zhǎng)素應(yīng)答元件上。因此SEBF及其功能性同系物可以參與由生長(zhǎng)素控制的基因抑制。因此，可以通過(guò)調(diào)節(jié)SEBF(和/或功能性SEBF同系物的水平)的內(nèi)源水平來(lái)增加或者降低由生長(zhǎng)素控制的基因的誘導(dǎo)?？梢酝ㄟ^(guò)在上文I部分中描述的一種策略來(lái)降低SEBF水平。與其它植物相比，具有較低水平SEBF或者具有較低SEBF活性的植物可能具有對(duì)內(nèi)源性生長(zhǎng)素增加的敏感性，并且表現(xiàn)出增加的生長(zhǎng)、生根和果實(shí)數(shù)量，反之亦然。具有較低SEBF(和/或功能性SEBF同系物)內(nèi)源性水平或者具有較低SEBF活性的植物也可能變得更加敏感于用生長(zhǎng)素及其類似物對(duì)其進(jìn)行的外源處理。因此，與其它植物相比，可以使用更少的基于生長(zhǎng)素的除草劑來(lái)去除這些植物。這一性質(zhì)對(duì)于控制轉(zhuǎn)基因植物傳播也是有用的。例如，可以進(jìn)一步遺傳修飾已經(jīng)被設(shè)計(jì)成表達(dá)藥用化合物的轉(zhuǎn)基因植物，以使其對(duì)生長(zhǎng)素除草劑高度敏感。通過(guò)噴霧低劑量的生長(zhǎng)素除草劑，將會(huì)很容易從耕地中將這些植物去除?；蛘?，具有較高內(nèi)源性SEBF水平的植物如過(guò)表達(dá)SEBF基因的轉(zhuǎn)基因植物，可能對(duì)生長(zhǎng)素及其類似物的敏感性較低，從而給這些植物賦予了生長(zhǎng)素除草劑抗性。當(dāng)然，也可以考慮插入、刪除、突變SEBF結(jié)合位點(diǎn)序列以增加/降低SEBF的生物學(xué)活性并且相應(yīng)地調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)素應(yīng)答。ii)乙烯乙烯影響種子萌芽、生根和苗生長(zhǎng)、花發(fā)育、衰老和花與葉的脫落、和果實(shí)成熟。乙烯是引起果實(shí)過(guò)成熟的原因而且這是在果實(shí)收獲以后導(dǎo)致果實(shí)腐爛的重要原因。生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的ACC合酶，催化乙烯生物合成過(guò)程中的限速步驟。如下文中實(shí)施例1中所示，SEBF結(jié)合位點(diǎn)存在于馬鈴薯和許多植物物種的ACC合酶基因的啟動(dòng)子中(見表5)。這強(qiáng)烈提示SEBF調(diào)控ACC合酶基因的生長(zhǎng)素誘導(dǎo)。如下文實(shí)施例中所示，SEBF與Pti4之間的相互作用同樣支持該假說(shuō)，Pti4是乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白家族中的一員。因此具有較高內(nèi)源性SEBF(和/或功能性SEBF同系物)水平的植物，如過(guò)表達(dá)SEBF的轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)該能夠下調(diào)ACC合酶并能夠降低乙烯生產(chǎn)。乙烯生產(chǎn)的下降又會(huì)延遲果實(shí)成熟并防止果實(shí)過(guò)成熟。另一方面，具有較低內(nèi)源性SEBF水平或者較低SEBF活性的植物，如表達(dá)SEBF基因或其部分的反義拷貝的植物，可能表現(xiàn)出果實(shí)早熟。將序列BTGTCNC(或者YTGTCNC)加入目的基因的啟動(dòng)子中將會(huì)降低該特定基因的表達(dá)水平。相反，去除序列BTGTCNC(或者YTGTCNC)將會(huì)得到較高的序列表達(dá)。這樣的啟動(dòng)子改變?cè)谀切㏒EBF水平無(wú)法被改變的植物中是有用的。例如，從ACC合酶基因的啟動(dòng)子移除BTGTCNC(或者YTGTCNC)序列會(huì)增加乙烯產(chǎn)量。在經(jīng)過(guò)修飾作用以后，被修飾的啟動(dòng)子和編碼序列將被引入植物以生成轉(zhuǎn)基因植物。III.葉綠體功能降低SEBF在葉綠體中的濃度或者降低該細(xì)胞器中SEBF的生物學(xué)活性會(huì)導(dǎo)致該植物明顯的表型改變。如下文實(shí)施例1中所示，已經(jīng)顯示SEBF同系物在質(zhì)體中與RNA相互作用并穩(wěn)定RNA。因此，通過(guò)調(diào)節(jié)SEBF水平(和/或功能性SEBF同系物水平)來(lái)調(diào)節(jié)SEBF結(jié)合于其上的質(zhì)體mRNAs的表達(dá)應(yīng)該是可能的。這可能會(huì)使植物具有更好的光合速度或固碳速度，或者使植物能夠更好地適應(yīng)其環(huán)境。IV.蛋白模塊和其它研究手段如下文實(shí)施例中所示的那樣，SEBF可以被定位于兩個(gè)不同的區(qū)室中核和質(zhì)體。這說(shuō)明SEBF氨基酸序列包含含有定位信息的第一“標(biāo)記”(SEQIDNO22的氨基酸1-59)，該標(biāo)記可以指導(dǎo)SEBF到達(dá)質(zhì)體，和指導(dǎo)SEBF到達(dá)核的第二“標(biāo)記”。通過(guò)在所述的標(biāo)記和要被靶向這些細(xì)胞區(qū)室中的蛋白之間制造翻譯融合體，這些標(biāo)記可以被用來(lái)指導(dǎo)其它蛋白到達(dá)質(zhì)體或者核。初步證據(jù)還提示在植物受到創(chuàng)傷或者病原體激發(fā)的時(shí)候，SEBF從其DNA結(jié)合元件上釋放下來(lái)。可以利用這一特征來(lái)產(chǎn)生在不存在誘導(dǎo)事件的情況下嚴(yán)格調(diào)控的啟動(dòng)子系統(tǒng)。這可以通過(guò)將SEBF結(jié)合序列插入到已知的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子中來(lái)實(shí)現(xiàn)。然后這樣的遺傳修飾的啟動(dòng)子就會(huì)需要兩個(gè)誘發(fā)事件(其中一個(gè)是新引入的SEBF結(jié)合序列)來(lái)活化相關(guān)基因的表達(dá)。V.篩選調(diào)節(jié)SEBF結(jié)合的分子由于SEBF是一種結(jié)合分子，可以利用這一特征來(lái)篩查和/或鑒定這樣的新化合物該化合物抑制SEBF結(jié)合到其DNA元件(序列BTGTCNC)上；抑制SEBF結(jié)合到質(zhì)體或核mRNA上；抑制SEBF與另一蛋白的相互作用；和/或負(fù)面影響SEBF三維結(jié)構(gòu)(例如翻譯后修飾)?？梢酝ㄟ^(guò)電泳遷移率變動(dòng)試驗(yàn)、可以通過(guò)使用各種化學(xué)制劑處理植物的原位分析、或者可以通過(guò)任何其它本領(lǐng)域的已知技術(shù)來(lái)體外測(cè)定對(duì)SEBF結(jié)合活性的抑制。如前所述，能夠抑制SEBF結(jié)合活性的化合物具有許多用途，特別是用來(lái)增加植物對(duì)病原體的抗性或者誘導(dǎo)其防御應(yīng)答機(jī)制；用來(lái)增加植物對(duì)內(nèi)源生長(zhǎng)素的敏感性并因此增加該植物的生長(zhǎng)、生根和果實(shí)數(shù)量；用來(lái)增加植物對(duì)基于生長(zhǎng)素的除草劑的敏感性；和用來(lái)誘導(dǎo)果實(shí)成熟。類似地，如前所述，能夠增加SEBF結(jié)合活性的化合物具有許多用途，特別是用來(lái)降低植物對(duì)生長(zhǎng)素及其類似物的敏感性(從而給這些植物賦予生長(zhǎng)素除草劑抗性)；用來(lái)延遲果實(shí)成熟并防止因乙烯產(chǎn)生而導(dǎo)致的果實(shí)過(guò)成熟。實(shí)施例1以下的實(shí)施例描述了本發(fā)明應(yīng)用的廣闊范圍，不是意圖限制本發(fā)明的范圍。在未脫離本發(fā)明的主旨和范圍的條件下可以進(jìn)行修改和改變。盡管可以在實(shí)踐中使用任何類似或等同于此處所描述的那些的方法和材料來(lái)檢驗(yàn)本發(fā)明，但在此處僅描述優(yōu)選的方法和材料。a)導(dǎo)言作為對(duì)病原體感染的響應(yīng)，植物會(huì)被引發(fā)多種防御特異性事件，包括活性氧種類產(chǎn)生、G蛋白活化、細(xì)胞壁加固和誘導(dǎo)引起防御基因轉(zhuǎn)錄活化的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)(Dixon等.，1994；Blumwald等.1998)。盡管正在發(fā)現(xiàn)信號(hào)級(jí)聯(lián)的主要成分，但是只鑒定出了極少的在轉(zhuǎn)錄水平整合這些信號(hào)的轉(zhuǎn)錄因子。已經(jīng)被很好表征的、由病原體侵入誘導(dǎo)的PR基因提供了用于研究防御基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的良好模型?；谛蛄邢嗨菩裕琍R基因被細(xì)劃分為11類(VanLoon等.，1994)。PR-10基因家族被細(xì)劃分為兩組而且PR-10基因家族編碼小的、酸性的、15-18kD的細(xì)胞內(nèi)蛋白(Osmark等，1997)。盡管已經(jīng)證實(shí)PR-10蛋白具有RNA酶活性，但是它們與典型的RNA酶并不具有任何序列相似性(Moiseyev等.，1994；Swoboda等.，1996)。在馬鈴薯中，已經(jīng)鑒定出該家族中的三個(gè)成員，其中PR-10a是被表征得最好的。對(duì)表達(dá)進(jìn)行的研究已經(jīng)鑒定出了涉及PR-10a基因調(diào)控的順式作用元件。位于核苷酸-135--105之間的誘導(dǎo)子應(yīng)答元件(ERE)對(duì)于誘導(dǎo)子誘導(dǎo)的基因表達(dá)是必要且充分的(Matton等，1993；Després等.，1995；Desveaux等，2000)。PBF-2是一種單鏈DNA結(jié)合因子，其似乎在從ERE的PR-10a活化中發(fā)揮作用(Després等.，1995；Desveaux等，2000)。盡管ERE的存在對(duì)于PR-10a活化是充分的，但是去除位于-52--27之間的沉默元件(SE)，會(huì)引起進(jìn)一步的活化作用，這一情況提示該元件和ERE一起，參與了PR-10a的調(diào)控(Matton等，1993；Després等.，1995)。在本發(fā)明中，我們利用瞬時(shí)表達(dá)研究證實(shí)只有包含序列GACTGTCAC的這9個(gè)核苷酸對(duì)于全部SE活性是必需的。我們還鑒定出了一種核因子(SEBF)，該因子顯示出特異結(jié)合到序列BTGTCNC的序列。數(shù)據(jù)庫(kù)檢索顯示此序列存在于許多PR基因的啟動(dòng)子中。該序列還顯示出與生長(zhǎng)素應(yīng)答元件的序列有高度序列相似性，提示該序列與SEBF在由植物激素生長(zhǎng)素及其功能性類似物所誘導(dǎo)基因的調(diào)控中起作用。特別是，SEBF元件存在于ACC合酶基因的啟動(dòng)子中，該基因被生長(zhǎng)素所誘導(dǎo)并且編碼乙烯生物合成中的一種關(guān)鍵的酶——另一種植物激素。因此，SEBF可能通過(guò)生長(zhǎng)素的作用參與乙烯合成的調(diào)控。已經(jīng)從馬鈴薯塊莖中將SEBF純化均勻，對(duì)該蛋白的N-末端測(cè)序分離出了編碼SEBF的cDNA。推導(dǎo)得到的氨基酸序列顯示出與葉綠體RNA結(jié)合蛋白具有高度的序列相似性。葉細(xì)胞的亞細(xì)胞劃分證實(shí)SEBF同時(shí)位于葉綠體和核中，提示其在這兩個(gè)細(xì)胞區(qū)室中均發(fā)揮功能。重組體SEBF在瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中的過(guò)表達(dá)，引起PR-10a-uidA報(bào)告基因融合體出現(xiàn)SE-依賴性轉(zhuǎn)錄抑制，證實(shí)了SEBF作為轉(zhuǎn)錄阻遏物的作用。通過(guò)使用酵母雙雜交系統(tǒng)，我們鑒定出了與SEBF相互作用的蛋白。其中的一種蛋白是Pti4，它是在植物病原體誘導(dǎo)的防御應(yīng)答過(guò)程中PR基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子。已知Pti4與腈水解酶相互作用，腈水解酶是一種涉及生長(zhǎng)素生物合成的酶。此外，Pti4是乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(EREBP)中的一員，已知EREBP涉及植物對(duì)乙烯的應(yīng)答。b)材料與方法所有標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)操作均依照Sambrook等.(1989)進(jìn)行.植物材料馬鈴薯塊莖(Solanumtuberosum，肯納貝克河品種)來(lái)自魁北克農(nóng)業(yè)部研究站(theQuebecMinistryofAgriculture“LesBuissons”ResearchStation)(Pointe-aux-Outardes，Canada)。將塊莖儲(chǔ)存在4℃的黑暗條件下，使用前24小時(shí)將其至于室溫下。如Magnien等.(1980)所述，從培育在培育箱中的4-5周齡的馬鈴薯植物中分離葉肉原生質(zhì)體。在長(zhǎng)日照光周期條件下，從培育在環(huán)境培養(yǎng)箱(Conviron，Winnipeg，Canada)中的植物中分離馬鈴薯葉。GUS報(bào)告基因構(gòu)建體和分析用PCR寡核苷酸1(GCCAAGCTTTAGATAAAATGACACAAATGTCAAAAATGG；SEQIDNO27)和寡核苷酸2(CCACCCGGGGATCCAGCTTTGAAC；SEQIDNO28)來(lái)將-135位的XbaI位點(diǎn)替換成HinDIII位點(diǎn)，通過(guò)PCR擴(kuò)增質(zhì)粒p-135(Matton等.，1993)的PR-10a啟動(dòng)子片段來(lái)產(chǎn)生野生型(WT)構(gòu)建體。在用HinDIII和BamHI消化以后，將片段插入pBI201中。突變體m1先前已經(jīng)被描述過(guò)(pLP9，Desveaux等.，2000)。突變體m3，m4和m5是通過(guò)使用突變的寡核苷酸(圖2A)和PCR寡核苷酸2、用PCR產(chǎn)生的。用XbaI和BamHI切割PCR片段并將其插入上述的野生型質(zhì)粒。對(duì)于突變體m2，使用寡核苷酸1和寡核苷酸3(CAGTCCATGGTTAAATCAAC；SEQIDNO29)合成HinDIII/NcoIPCR片段。而后，使用寡核苷酸2和寡核苷酸4(TAACCATGACTGTCACTTG；SEQIDNO30)合成NcoI/BamHIPCR片段。將這些片段連接到用HinDIII和BamHI切割的pBI201中以產(chǎn)生突變體m2(SEQIDNO2)。使用下面的引物從煙草中擴(kuò)增CHN50啟動(dòng)子5’-GCCGCAAGTTTTCTGCAGTGTTTTTGCTC-3’(SEQIDNO31)和5’-GGTTTGGATCCAGTAGTAAAGTGGCGA-3’(SEQIDNO32)。用PstI和BamHI消化擴(kuò)增的DNA，隨后將其插入質(zhì)粒pBI201的相同位點(diǎn)。使用圖12C中所示的寡核苷酸和寡核苷酸CHN50R5’-ATGTCTACTCCTGCGCTCATT-3’(SEQIDNO33)，用ExSiteTM基于PCR的定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Stratagene)在啟動(dòng)子中產(chǎn)生突變。在Whatman/BiometraTgradientTM熱循環(huán)裝置儀中進(jìn)行擴(kuò)增。對(duì)所有的構(gòu)建體進(jìn)行測(cè)序以確保沒(méi)有被PCR插入的突變。先前已經(jīng)描述了瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)(Matton等.，1993)。使用由共電穿孔1μg質(zhì)粒pWB216(Barnes，1990)產(chǎn)生的熒光素酶活性，對(duì)電穿孔效率校準(zhǔn)所有的數(shù)值。將編碼全長(zhǎng)SEBF的序列插入到包含雙重CaMV35S增強(qiáng)子的pBI223D中。將5μg表達(dá)載體加入到測(cè)試中以用于反式阻抑研究。對(duì)照載體表達(dá)處于相同啟動(dòng)子控制下的、含有FK506-結(jié)合蛋白(FKBP；Pelletier等.，1998)的人融合蛋白。提取物的制備粗核提取物制備如下將250ml冷NEBH(10mMPIPES-KOH，pH6.0，1M2-甲基-2，4戊二醇，0.15mM精胺，0.5mM亞精胺，10mMMgCl2，14.3mMβ-巰基乙醇，0.1mMPMSF)中的200g馬鈴薯塊莖或者75g葉在混和器中以最大速度勻漿1分鐘。在4℃下傾析5分鐘后，在真空下用5層MiraclothTM過(guò)濾勻漿。將過(guò)濾物在SorvalGSA轉(zhuǎn)子中以5,000RPM的速度離心5分鐘以沉淀核。上清液作為胞質(zhì)部分。在NP-40緩沖液(10mMMES-NaOHpH6.0，260mM蔗糖，10mMNaCl，1mMEDTA，0.15mM精胺，0.5mM亞精胺，14.3mMβ-巰基乙醇，0.1％BSA和1％NP-40)中將核清洗三遍以去除細(xì)胞器和細(xì)胞骨架污染。將最終的沉淀重新懸于5ml的200mMNaClSEBF結(jié)合緩沖液(SBB10mMTris-HCl，pH7.5，1mMEDTA，14.3mMβ-巰基乙醇，可變的NaCl濃度)中。通過(guò)超聲處理將核破裂，將裂解物在15,000RPM下離心45分鐘。將上清液或者立刻用于SEBF純化或者在-70℃貯存在10％的甘油中。在此條件下，SEBF結(jié)合活性可以幾個(gè)月保持穩(wěn)定。葉綠體依照Gegenheimer(1990)的方法來(lái)制備。確定提取物中的酶活性按照Arnon(1949)測(cè)定葉綠素含量。分別按照Gross和apRees(1986)、Hucklesby等.(1972)、和Smith與apRees(1979)測(cè)定堿性焦磷酸酶、亞硝酸還原酶和醇脫氫酶。電泳遷移率變動(dòng)試驗(yàn)(EMSA)將蛋白提取物(200mMNaClSBB中)與20,000CPM的32P末端標(biāo)記的探針混和。結(jié)合反應(yīng)體系(40μl)含有100ng的poly(dI-dC)以消除非特異性結(jié)合。將該反應(yīng)體系置于冰上15分鐘。通過(guò)將混合物加載到5.7％的、在Tris-甘氨酸緩沖液(25mMTris，195mM甘氨酸)中制備的聚丙烯酰胺凝膠上，在4℃下施加200V的電壓2.5個(gè)小時(shí)來(lái)實(shí)現(xiàn)混合物的電泳分離。將凝膠置于柯達(dá)X-omatAR膠片上，在-70℃曝光過(guò)夜。從核提取物中純化SEBF將粗核提取物加載到在200mMNaClSBB中平衡的3mlQ-瓊脂糖TMFPLCTM(Amersham-PharmaciaBiotech)柱上。先用10體積的200mMNaClSBB、隨后用15體積的300mMNaClSBB清洗柱。SEBF被洗脫在4ml的400mMNaClSBB中。隨后對(duì)洗脫液進(jìn)行兩輪親和純化。親和珠的制備按照Desveaux等.(2000)，通過(guò)將生物素化的WTSE寡核苷酸與鏈霉抗生物素包被的順磁珠(Sigma)偶聯(lián)來(lái)制備。在使用前用400mMNaClSBB將珠子清洗兩遍。將20μl的EDTA500mMpH8.0、10μg的poly(dI-dC)和5μl的NP-40加入1ml的洗脫液中。將混合物加到親和珠上并置于冰上15分鐘，期間不時(shí)地混和一下。在利用磁鐵將珠子從溶液中分離出來(lái)以后，先將珠子在1ml的200mMNaClSBB中清洗，隨后將珠子在1ml的1MNaClSBB洗液中清洗。通過(guò)隨后兩次0.1ml的2MNaClSBB清洗，SEBF從珠子上被洗脫下來(lái)，并在37℃溫育5分鐘。用Ultrafree4TM離心濾器10KBioMaxTM(Millipore，Bedford，USA)將含有SEBF的洗脫液脫鹽。將1kg塊莖的等價(jià)物集中并用丙酮沉淀。將沉淀重懸于Laemmli溶解緩沖液(Laemmli1970)中，并加載到12％的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上。將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜(BIO-RAD)上并用考馬斯亮藍(lán)染色。切出條帶并用EasternQuebecProteomicsCoreFacility(Ste-Foy，Canada)對(duì)其進(jìn)行N-末端分析。通過(guò)對(duì)29kD條帶的N-末端分析，得到了序列VTLSDFDQIEEVEAGDDDEEEGGLSDEAGASYEERN？NPDL；SEQIDNO34)。Southwestern分析按照Vinson等.(1988)進(jìn)行操作。SEBF的克隆使用相應(yīng)于SEBF的N-末端序列的簡(jiǎn)并寡核苷酸(GTKACWYTITCIGATTTYGAYCA；SEQIDNO35)和cs-RBD特定引物(ARRTTWCCIACRAARATYTT；SEQIDNO36；Mieszczak等.，1992)(I對(duì)應(yīng)于肌苷)來(lái)生成141bp的SEBF的基因組PCR片段。特定引物GTTTGAGTGATGAAGGTGC(SEQIDNO37)衍生于該141bp片段的序列，使用Israel(1993)提出的方法將其用來(lái)探察馬鈴薯cDNA庫(kù)(Matton和Brisson，1989)。在使用基因特異引物和M13通用引物的PCR反應(yīng)中使用18,000個(gè)噬菌體的23個(gè)庫(kù)。兩個(gè)庫(kù)得到了大約1,000bp的PCR片段。對(duì)這些庫(kù)作進(jìn)一步的稀釋并重復(fù)操作，直到能夠分離出一個(gè)單一的噬菌斑。按照制造商的說(shuō)明書，通過(guò)使用ExAssistTM系統(tǒng)(Stratagene)來(lái)切出陽(yáng)性克隆。用ThermosequenaseTM(Amerham-PharmaciaBiothech)在循環(huán)測(cè)序反應(yīng)中對(duì)該克隆的雙鏈均進(jìn)行測(cè)序，所述反應(yīng)隨后在LI-CORTM自動(dòng)測(cè)序儀(LI-COR，Lincoln，USA)中進(jìn)行。本發(fā)明的發(fā)明者已經(jīng)于2001年12月10日在GenBankTM中公開了SEBF的核苷酸和氨基酸序列(SEQIDNOs21和22)，登記號(hào)為No.AF389431。Southern分析和基因組分析Ausubel等(2001)描述了用來(lái)提取基因組DNA和DNA印跡的步驟。下面的引物是根據(jù)煙草和鼠耳芥屬SEBF同系物(Ye等.，1991；Ohta等.，1995)中內(nèi)含子的預(yù)測(cè)位置設(shè)計(jì)的，并將其用于基因組DNA的PCR分析TGCCGTTCTGTCTTCACAATTCTTTTGCTTC(SEQIDNO38)；UCAACATCTCCAGCACGCTCAAAAAGCTCAG(SEQIDNO39)；VCCTCTGCTTCTTCCTGTAAGCTTGTCATAG(SEQIDNO40)；WCAGTTGAAGCCGCCTGTCAACAATTTAATG(SEQIDNO41)；XTTGACGGGAGGGCACTGAGGGTGAATTCTG(SEQIDNO42)；YGCTTTCAATTGCAT-CGTTGACCTCCTTAG(SEQIDNO43)；和ZGCTTCAGCAGGACTTACACGGATGGCCCTG(SEQIDNO44).抗體生產(chǎn)和蛋白印跡在質(zhì)粒pGEX-4T1TM(Amersham-PharmaciaBiotech)中將編碼SEBF的cDNA與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因融合。在BL21細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白(GST-SEBF)。裂解細(xì)胞以后，在谷胱甘肽柱上純化該融合蛋白(Smith和Johnson，1988)。用凝血酶(Amersham-PharmaciaBiotech)切割GST標(biāo)記并通過(guò)二次過(guò)谷胱甘肽柱將其從提出物中移除。依照Harlow和Lane(1988)進(jìn)行兔免疫。簡(jiǎn)單地說(shuō)使用50μg重組SEBF來(lái)免疫家兔，30天后二次注射150μg來(lái)增強(qiáng)免疫反應(yīng)。在二次注射后的第14天處死兔。對(duì)于蛋白印跡研究，使用1∶5000稀釋的SEBF抗血清，并根據(jù)制造商的說(shuō)明書用ECLTM檢測(cè)試劑盒(AmershamParmaciaBiotech)來(lái)揭示抗體—抗原的相互作用。酵母雙雜交篩選使用DupLEX-ATM酵母雙雜交系統(tǒng)(OriGene，Rockville，MD，USA)進(jìn)行雙雜交篩選。將編碼成熟SEBF的序列和LEX-ADNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域插入餌載體pEG202的框架中。在靶載體pJG4-5中制得的番茄cDNA文庫(kù)獲自美國(guó)農(nóng)業(yè)部的B.Baker(Zhang等.，1999)。依照制造商的說(shuō)明書，在株系EGY48中篩查5百萬(wàn)個(gè)克隆。重新轉(zhuǎn)化每個(gè)陽(yáng)性克隆以證實(shí)相互作用的真實(shí)性。隨后使用T7測(cè)序試劑盒(Amersham-PharmaciaBiotech)對(duì)這些陽(yáng)性克隆的雙鏈均進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)NCBITM的BLASTXTM程序鑒定翻譯的蛋白。c)結(jié)論SEBF的鑒定以前的研究在馬鈴薯PR-10a基因的啟動(dòng)子中鑒定出了一種負(fù)調(diào)控序列(SE)(Matton等.，1993；Després等.，1995)。因此，我們力求鑒定出一種能夠通過(guò)結(jié)合到該序列來(lái)調(diào)控PR-10a表達(dá)的核蛋白。由于PR-10a似乎在ERE被一種單鏈DNA(ssDNA)結(jié)合蛋白正調(diào)控(Desveaux等.，2000)，所以我們尋找能夠結(jié)合單鏈或者雙鏈形式SE的蛋白。將馬鈴薯塊莖的粗核提取物與單鏈或雙鏈放射性標(biāo)記的SE共培養(yǎng)，并通過(guò)電泳遷移率變動(dòng)試驗(yàn)(EMSA)來(lái)對(duì)其進(jìn)行分析。圖1證實(shí)一種叫做SEBF(代表SE結(jié)合因子)的核因子結(jié)合SE編碼鏈(泳道1)。SEBF不能結(jié)合非編碼鏈(泳道3)或者雙鏈DNA(泳道4-6)。這些結(jié)果表明SEBF是一種只能識(shí)別沉默元件一條鏈的ssDNA結(jié)合蛋白。我們先前已經(jīng)證明另一個(gè)PR-10a啟動(dòng)子的順式元件同樣與ssDNA結(jié)合蛋白相互作用。該元件位于-135--105之間、與ssDNA結(jié)合因子PBF-2相互作用(Després等.，1995；Desveaux等.，2000)，PBF-2已經(jīng)顯示在原生質(zhì)體中活化PR-10a-uidA報(bào)告基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄(Desveaux和Brisson，inpreparation)。因此。我們的資料提示單鏈DNA結(jié)合蛋白與PR-10a啟動(dòng)子的一個(gè)大的區(qū)域接觸。據(jù)報(bào)道，動(dòng)物中的幾種基因具有相似的情況(Rothman-Denes等的綜述1998)，并且通過(guò)對(duì)c-myc原癌基因啟動(dòng)子的研究闡明了這種情況，其中幾種類別的單鏈順式元件在體內(nèi)出現(xiàn)并且被不同的特異ssDNA結(jié)合因子所結(jié)合(Michelotti等.，1996)。SEBF對(duì)SE的結(jié)合與PR-10a的轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)對(duì)SE進(jìn)行突變分析以確定SEBF結(jié)合位點(diǎn)由哪些核苷酸組成、這些核苷酸在體內(nèi)是否對(duì)于PR-10a表達(dá)的調(diào)控是重要的。合成SE編碼鏈的突變型(圖2A)并在EMSA研究中將其用作探針(圖2B)。將同樣的突變也引入與編碼β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的uidA報(bào)告基因融合的PR-10a啟動(dòng)子中，并在瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)測(cè)定所得到的轉(zhuǎn)錄活性(圖2D)。如圖2B所示，與WT(SEQIDNO45)相比，SEBF與突變體m3(SEQIDNO3)和m4(SEQIDNO4)的結(jié)合明顯下降。相反，將這些突變引入PR-10a的啟動(dòng)子中會(huì)引起瞬時(shí)研究中的報(bào)告基因活性增加(圖2D，m3和m4)。在結(jié)合中表現(xiàn)出輕度增加(圖2B，m2(SEQIDNO2))或者降低(圖2B，m5(SEQIDNO5))的突變沒(méi)有顯示出改變的轉(zhuǎn)錄活性(圖2D，m2和m5)。使用其中80％的序列被改變的突變體m1(SEQIDNO1)，徹底破壞SEBF的結(jié)合(圖2B，m1)。這種結(jié)合的缺失與在瞬時(shí)研究中觀察到的最高的轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)(圖2D，m1)。因此，PR-10a啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性與體外SEBF與SE的結(jié)合是反向相關(guān)的。這提示SEBF是擔(dān)負(fù)SE介導(dǎo)的PR-10a抑制的反式作用因子。序列BTGTCNC定義了SEBF的DNA結(jié)合位點(diǎn)圖2中的結(jié)果顯示，SEBF結(jié)合位點(diǎn)位于序列GACTGTCAC(SEQIDNO26)中。為了進(jìn)一步描繪該元件，將額外的突變引入此區(qū)域并通過(guò)EMSA監(jiān)測(cè)其對(duì)SEBF結(jié)合的影響。如圖3所示，影響序列CTGTCAC(SEQIDNO25)的突變顯著降低了SEBF的結(jié)合(圖3B和3C，突變體m8(SEQIDNO8)，m9(SEQIDNO8)，m11(SEQIDNO11)，m13(SEQIDNO13)，m14(SEQIDNO14)，m15(SEQIDNO15)，m16.(SEQIDNO16)，m17(SEQIDNO17)，m18(SEQIDNO18))，而此區(qū)域之外的突變則不影響結(jié)合(圖3B和3C突變體m6(SEQIDNO6)，m7(SEQIDNO7)，m12(SEQIDNO12)，m20(SEQIDNO20))。在所述序列中只突變A不影響結(jié)合(圖3B和3C；突變體m12(SEQIDNO12)和m19(SEQIDNO19))。實(shí)際上，任何核苷酸都可以取代A而不影響SEBF結(jié)合(未顯示)。對(duì)SEBF結(jié)合位點(diǎn)的進(jìn)一步研究表明，可以用G或者T取代第一個(gè)C。在該特定位置唯一降低SEBF結(jié)合的核苷酸是A(圖3，m13(SEQIDNO13))。因此，共有SEBF結(jié)合位點(diǎn)是BTGTCNC(SEQIDNO23)、優(yōu)選為YTGTCNC(SEQIDNO24)，其中N是所有核苷酸，B是C，G或者T，Y是C或者T。SEBF結(jié)合位點(diǎn)存在于其它防御基因中表5列出了DNA數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索結(jié)果，其揭示SEBF結(jié)合位點(diǎn)存在于許多已知被病原體誘導(dǎo)的基因的啟動(dòng)子中。這些包括來(lái)自番茄和水稻的葡聚糖酶(GenBankTMacc.NosAF077340和X58877)；來(lái)自鼠耳芥屬，百慕大草(bermudagrass)，馬鈴薯，水稻和煙草的幾丁質(zhì)酶(GenBankTMacc.NosY14590，AF105426，AF153195，AF013581，X16938)；來(lái)自大麥和煙草的PR-1(GenBankTMacc.NosZ48728和X66942)以及來(lái)自蘋果，樺，歐芹和豌豆的PR-10(GenBankTMacc.NosAF020542，AJ289771，U48862和U31669)。以前鑒定的CHN50基因的阻遏物元件含有SEBF結(jié)合位點(diǎn)。在EMSA中對(duì)該元件進(jìn)行測(cè)試以確定其是否可以被SEBF識(shí)別。圖9和12A證實(shí)了SEBF可以結(jié)合CHN50基因的阻遏物元件，這表明SEBF在此其它防御基因的調(diào)控中發(fā)揮作用。另外，圖12B證實(shí)對(duì)SEBF的結(jié)合重要的殘基對(duì)CHN50基因的抑制起非常大的作用。另外，破壞SEBF結(jié)合的突變(M2，圖12A)引起CHN50基因的去抑制(M2，圖12B)。表5還顯示在許多創(chuàng)傷或者應(yīng)激反應(yīng)可誘導(dǎo)的基因中發(fā)現(xiàn)了SEBF結(jié)合位點(diǎn)。將所有這些結(jié)果綜合在一起，提示SEBF及其元件在植物防御應(yīng)答中、特別是在植物防御基因的調(diào)控中起作用。SEBF結(jié)合位點(diǎn)與AuxRE相似如表5所示，將SEBF結(jié)合位點(diǎn)(BTGTCNC)與其它調(diào)控序列進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與存在于組合物AuxRE中的生長(zhǎng)素應(yīng)答元件(TGTCTC；SEQIDNO55)具有很強(qiáng)的相似性。對(duì)公開的AuxRE的5’到TGTCTC的核苷酸進(jìn)行分析，結(jié)果揭示了其富集嘌呤(C或者T)，這提示SEBF可能結(jié)合大多數(shù)的AuxRE。另外，已經(jīng)顯示AuxRE在不存在生長(zhǎng)素的情況下抑制組成型增強(qiáng)子元件的作用(Ulmasov等.，1995)，而且不管有沒(méi)有生長(zhǎng)素存在，它們都似乎被一種尚未鑒定出來(lái)的、能夠與ARF因子相互作用的因子所占據(jù)(Ulmasov等.，1999)。SEBF最有可能對(duì)應(yīng)于這一因子的原因是1)其存在于葉和塊莖的核中；2)其作為轉(zhuǎn)錄阻遏物發(fā)揮作用(見下)；和3)其應(yīng)該結(jié)合大多數(shù)Aux-RE，作為例證SEBF結(jié)合到一種被最好表征的AuxRE上，該AuxRE是大豆GH3基因的D4元件(圖11；Ulmasov等.，1995)。同樣已知生長(zhǎng)素負(fù)調(diào)控幾種防御基因(Grosset等.，1989；Jouanneau等.，1991)。近來(lái)，分離出了一種鼠耳芥屬多效性突變體，其同時(shí)顯示出增加的病原體的易感性和生長(zhǎng)素不敏感性，這表明了在引起這些表型的通路之間復(fù)雜的相互作用(Mayda等.，2000)。這些結(jié)果，以及SEBF結(jié)合位點(diǎn)與AuxRE之間的很強(qiáng)的相似性，增加了SEBF可能還參與基因表達(dá)的激素調(diào)控的可能性。SEBF的純化使用由純化蛋白的氨基酸序列推導(dǎo)得出的信息，克隆出了SEBF的cDNA。利用陰離子交換層析和親和純化的結(jié)合，從塊莖核中純化出了SEBF。下面的表4顯示得到了純化了20,700倍的SEBF。表4從馬鈴薯塊莖中純化SEBF餾分全部蛋白全部活性a特異活性純化產(chǎn)率(mg)(pgDNA)(pgDNA/mg)(倍數(shù))(％)粗核1123.3×1062.9×1041100Q-Sephb1.153.0×1062.6×1069091Aff.1c4.0×10-3d2.3×1065.8×10820,00070Aff.2e3.5×10-3d2.1×1066.0×10820,70064a全部活性，通過(guò)測(cè)定在EMSA中SEBF結(jié)合的標(biāo)記探針和通過(guò)計(jì)算結(jié)合在每個(gè)餾分中的DNApg數(shù)來(lái)確定bQ-Seph.，Q-瓊脂糖Fast-FlowTM陰離子交換層析cAff.1，第一輪DNA親和層析d從著色的膠來(lái)估計(jì)eAff.2，第二輪DNA親和層析用SDS-PAGE和考馬斯染色對(duì)色譜餾分進(jìn)行分析，結(jié)果揭示了在多數(shù)純化餾分中的兩種不同的條帶29kD和28kD(圖4，泳道4)。為了確定這兩種條帶究竟哪一種具有DNA結(jié)合活性，將來(lái)自第二親和純化(Aff.2)的蛋白轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上并用野生型SE寡核苷酸探查。結(jié)果顯示兩種純化的蛋白可以獨(dú)立地與所述沉默元件相互作用(圖4，泳道5)。對(duì)兩種蛋白均進(jìn)行N-末端序列分析。SEBF的克隆由29kD蛋白的N-末端序列分析得到一段40個(gè)氨基酸的序列。對(duì)28kD蛋白的氨基末端測(cè)序顯示每個(gè)循環(huán)有不只一個(gè)氨基酸。但是，可以觀察到28kD蛋白與29kD蛋白有明顯的序列相似性，這表明28kD條帶含有降解形式的29kD蛋白。使用獲自29kD蛋白的氨基酸序列，精心設(shè)計(jì)PCR策略來(lái)克隆cDNA(見材料與方法)。圖10顯示了SEBFcDNA的序列(SEQIDNO21)，而其衍生于cDNA克隆的氨基酸序列(SEQIDNO22)顯示在圖10和圖5中。具有轉(zhuǎn)運(yùn)肽特性的59個(gè)氨基酸序列位于通過(guò)N-末端測(cè)序而確定的40個(gè)殘基(見圖5中的黑體部分)之前。出現(xiàn)在成熟蛋白N-末端區(qū)域的一個(gè)酸性區(qū)域位于兩個(gè)共有序列型RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(cs-RBD，圖5中的下劃線部分)之前。這些結(jié)構(gòu)域，也已知為RNA識(shí)別基序(RRM)，RNP共有序列(RNP-CS)或者RNA基序(Burd和Dreyfuss，1994)，它們被一個(gè)甘氨酸富集區(qū)分開。前已提及，數(shù)據(jù)庫(kù)檢索顯示了其與一個(gè)核編碼的葉綠體RNA結(jié)合蛋白家族具有高度序列相似性(見上文的表1-表3)。在SEBF中RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的存在以及與此結(jié)構(gòu)域相關(guān)聯(lián)的多種功能，提示SEBF也可能在RNA加工中起作用。已經(jīng)顯示，SEBF的煙草葉綠體同系物結(jié)合mRNA和含有內(nèi)含子的pre-tRNAs(Nakamura等.，1999)。同樣已經(jīng)顯示，它們給葉綠體中的mRNA賦予了穩(wěn)定性和核糖核酸酶保護(hù)(Nakamura等.，2001)。另外，象哺乳動(dòng)物的核編輯一樣，葉綠體中的RNA編輯也涉及hnRNPs的存在(Lau等.，1997；Hirose和Sugiura，2001)。因此，SEBF代表這樣的單鏈DNA結(jié)合因子它們能夠參與核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控并且能夠通過(guò)與RNA的結(jié)合在質(zhì)體中控制基因表達(dá)。為了確證cDNA編碼的蛋白在功能上與SEBF相對(duì)應(yīng)，在大腸桿菌中將該蛋白表達(dá)為GST融合體、純化并測(cè)試其與SE的結(jié)合。圖2C顯示重組體蛋白與SE寡核苷酸結(jié)合的結(jié)合特異性與天然SEBF相似(圖2B)。SEBF的細(xì)胞分布從分離的核中純化SEBF(表4)表明SEBF是一種核蛋白。然而，在重組體SEBF中的推定轉(zhuǎn)運(yùn)序列的存在提示，該蛋白也可能存在于質(zhì)體中。這使我們對(duì)SEBF的亞細(xì)胞定位進(jìn)行了研究。培養(yǎng)針對(duì)重組體SEBF的抗體，亞細(xì)胞部分來(lái)自馬鈴薯葉。通過(guò)酶測(cè)定確證每個(gè)部分的完整性。圖6顯示如預(yù)計(jì)的那樣，醇脫氫酶活性局限于胞質(zhì)部分。核沒(méi)有葉綠體的標(biāo)記—葉綠素，而且在胞質(zhì)部分只觀察到很少的污染。在核制備物中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)可以檢測(cè)得到的堿性焦磷酸酶或者亞硝酸還原酶活性。已知這兩種酶完全位于質(zhì)體中(Miflin，1974；Gross和apRees，1986)。對(duì)這些部分進(jìn)行的蛋白印跡分析表明，一種與SEBF免疫相關(guān)的蛋白出現(xiàn)在葉綠體和核中(圖6)。相應(yīng)于成熟型SEBF(圖6重組體SEBF)分子量的單一29kD條帶同時(shí)出現(xiàn)在這兩個(gè)細(xì)胞區(qū)室中。在任何部分中都沒(méi)有檢測(cè)到更高分子量的蛋白，提示即使SEBF以前體形式合成，它也會(huì)在核輸入前被肽酶有效地加工。SEBF的雙重定位在葉綠體中存在與SEBF大小相似、免疫相關(guān)的蛋白，這提示此蛋白被有效地靶向了這個(gè)細(xì)胞區(qū)室。這一觀點(diǎn)得到了以下證據(jù)的支持存在SEBFcDNA中編碼的推定的轉(zhuǎn)運(yùn)肽；對(duì)其它物種的研究已經(jīng)顯示SEBF同系物存在于葉綠體中(Ye等.，1991；Mieszczak等.，1992；Ohta等.，1995)。SEBF是單拷貝基因?yàn)榱伺懦撕腿~綠體SEBF可能是不同基因的產(chǎn)物的可能性，使用限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA，并將其用于DNA印跡分析。如圖7A所示，用SEBFcDNA片段探查基因組DNA產(chǎn)生了單個(gè)EcoRI條帶和兩個(gè)HinDIII條帶。這是單拷貝基因所能產(chǎn)生的預(yù)期結(jié)果，因?yàn)樵谔结槂?nèi)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)EcoRI位點(diǎn)和單個(gè)HinDIII位點(diǎn)。存在兩個(gè)XbaI片段是因?yàn)橛幸粋€(gè)XbaI位點(diǎn)在存在于基因的第三個(gè)內(nèi)含子(未顯示)。用PCR對(duì)馬鈴薯基因組DNA進(jìn)行分析導(dǎo)致在編碼SEBF的基因中鑒定出了三個(gè)內(nèi)含子(圖7B)。內(nèi)含子1、2和3分別位于SEQID21的核苷酸454-455、核苷酸556-557、和核苷酸869-870之間。在鼠耳芥屬和煙草中，這三個(gè)內(nèi)含子存在于SEBF同系物的相同位置(Ye等.，1991；Ohta等，1995)。這些結(jié)果清楚地表明在馬鈴薯基因組中只有一個(gè)拷貝的SEBF基因。由于在基因的5’端沒(méi)有內(nèi)含子存在(圖7C)，純化蛋白中不存在轉(zhuǎn)運(yùn)肽不能歸因于選擇性剪接。通過(guò)對(duì)5’RACE產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序可以證明這一點(diǎn)，測(cè)序結(jié)果全都顯示其序列與SEBF序列相同(未顯示)。在煙草和鼠耳芥屬中該基因的基因組結(jié)構(gòu)的保守性同樣支持這些結(jié)論。綜合在一起，所得到的結(jié)果表明核定位的SEBF是由單拷貝基因編碼的，而且轉(zhuǎn)運(yùn)肽不會(huì)被不同的剪接所消除。這提示核SEBF和葉綠體蛋白衍生于相同的前體。由于在核中只能檢測(cè)到成熟類型的SEBF，這還提示蛋白前體可能在葉綠體外被加工。在馬鈴薯中發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果淀粉磷酸化酶，其被作為前體合成，其在初期塊莖中被靶向造粉體但是卻以被加工的形式累積在年長(zhǎng)塊莖的胞質(zhì)中(Brisson等.，1989)。符合這些數(shù)據(jù)，Dahlin和Cline(1991)報(bào)道蛋白輸入質(zhì)體是被發(fā)育所調(diào)控的，在成熟的過(guò)程中伴隨著質(zhì)體喪失了其輸入前體的能力。通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)肽的磷酸化作用可以控制蛋白的差別輸入，已經(jīng)顯示轉(zhuǎn)運(yùn)肽的磷酸化作用降低了葉綠體輸入速度(Waegemann和Soll，1996)。在將來(lái)，確定SEBF在發(fā)育過(guò)程中的亞細(xì)胞定位是否改變將是很有意義的。不過(guò)，SEBF在葉綠體和核中的雙重定位，使這種蛋白成為在防御應(yīng)答過(guò)程中用于在這兩個(gè)亞細(xì)胞區(qū)室中調(diào)控代謝作用的理想候選物質(zhì)。以下的觀點(diǎn)已經(jīng)被很好地確立感染除了能夠活化核防御基因，還導(dǎo)致植物初級(jí)代謝中的主要變化，包括光合作用和RuBisCO合成的速率的降低(Tang等.，1996；Somssich和Hahlbrock，1998)。因此，在上述的兩個(gè)區(qū)室中，SEBF可能在協(xié)調(diào)由防御誘導(dǎo)的改變中發(fā)揮作用。SEBF能夠抑制轉(zhuǎn)錄SEBF對(duì)SE突變型的結(jié)合以及在原生質(zhì)體中作為負(fù)調(diào)控元件的它們的活性這兩者之間的關(guān)聯(lián)提示SEBF是介導(dǎo)SE依賴性抑制的因子。這一觀點(diǎn)通過(guò)在馬鈴薯原生質(zhì)體中共表達(dá)SEBF和各種報(bào)告基因構(gòu)建體而得到證實(shí)。盡管通過(guò)使用野生型啟動(dòng)子構(gòu)建體觀察到了抑制作用，但是報(bào)告基因的活性太弱了而且結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有意義(圖8WT)。這一結(jié)果是可以預(yù)料得到的，因?yàn)榫哂幸吧蚐E的啟動(dòng)子活性早已被完全抑制了。為了避免這一問(wèn)題，我們過(guò)表達(dá)SEBF和一種攜帶部分去抑制的突變體m4(見圖2D)的構(gòu)建體，重組體和純化的SEBF(圖2B和2C)對(duì)WT具有較低的親和力。我們預(yù)計(jì)過(guò)表達(dá)的SEBF將會(huì)補(bǔ)償其對(duì)所述突變體的較低的結(jié)合親和力。圖8證實(shí)，確實(shí)，與過(guò)表達(dá)對(duì)照蛋白FKBP觀察到的活性相比，當(dāng)SEBF過(guò)表達(dá)的時(shí)候，啟動(dòng)子活性下降了68％(圖8，m4)。當(dāng)過(guò)表達(dá)SEBF和不能結(jié)合SEBF的突變體m1(圖8，m1)的時(shí)候，觀察不到抑制作用，這證實(shí)所觀察到的抑制作用需要被SEBF結(jié)合的順式元件，而且這種抑制作用并不是因?yàn)榧せ顒┦芟藁蛘叻g阻斷而造成的。這些結(jié)果證實(shí)SEBF參與SE介導(dǎo)的PR-10a抑制，而且SEBF前體的表達(dá)導(dǎo)致核定位的活性。hnRNP屬于被最好表征的、在真核生物的基因表達(dá)調(diào)控中起作用的ssDNA結(jié)合蛋白。例如，已經(jīng)顯示hnRNPD及其同系物激活(Tay等.，1992；Tolnay等.，2000；Lau等.，2000)或者抑制從多種啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄(Kamada和Miwa，1992；Smidt等.，1995；Chen等.，1998)。另一種含有蛋白，人hnRNPA1的cs-RBD也已經(jīng)顯示抑制胸苷激酶基因的轉(zhuǎn)錄(Lau等.，2000)。因此，含有cs-RBDs的植物蛋白SEBF能夠充當(dāng)轉(zhuǎn)錄阻遏物就并不奇怪了。其它含有兩個(gè)cs-RBDs的植物蛋白如鼠耳芥屬FMV-3b，康乃馨CEBP-1，和煙草ACBF同樣能夠結(jié)合特異的調(diào)控順式元件(Didier和Klee，1992；Maxson和Woodson，1996；Séguin等.，1997)并因此代表潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子。與Pti4相互作用的SEBF使用酵母雙雜交系統(tǒng)來(lái)確定SEBF與哪些蛋白相互作用。在5種鑒定出來(lái)的相互作用因子中，兩種與SEBF相對(duì)應(yīng)，這表明該蛋白能夠形成多聚體；一種對(duì)應(yīng)于與DEAD盒樣RNA解旋酶具有相似性的蛋白(Itadani等.，1994)；和兩種相互作用因子對(duì)應(yīng)于番茄轉(zhuǎn)錄因子Pti4(Zhou等.，1997)。已知Pti4與在番茄中控制針對(duì)細(xì)菌病原體的防御應(yīng)答的Pto抗性基因之間相互作用。這些結(jié)果提示SEBF可能涉及被Pti4和Pto所調(diào)控的防御基因的調(diào)控。通過(guò)雙雜交篩選，還鑒定出了其它的相互作用因子(列在表6中)。SEBF可能對(duì)這些蛋白的調(diào)控和涉及這些相互作用因子的過(guò)程發(fā)揮作用。表5SEBF結(jié)合位點(diǎn)的出現(xiàn)基因有機(jī)體GenBankTMacc.No.序列防御基因PR-10a馬鈴薯M29041CTGTCACPR-10b馬鈴薯M29042CTGTCACPR-10(ypr10b)樺AJ289770CTGTCTCPR-10(ypr10a)樺AJ289771CTGTCACPR-10蘋果AF020542CTGTCACPR-10歐芹U48862TTGTCTC幾丁質(zhì)酶煙草X51599ATGTCTC幾丁質(zhì)酶馬鈴薯AF153195TTGTCAC幾丁質(zhì)酶百慕大草AF105426TTGTCTC幾丁質(zhì)酶鼠耳芥屬Y14590TTGTCTC葡聚糖酶水稻X58877CTGTCAC葡聚糖酶番茄AF077340CTGTCACPR-1煙草X66942TTGTCACCTGTCACPR-1大麥Z48728TTGTCAC滲透蛋白(PR-5)煙草S68111TTGTCAC滲透蛋白(PR-5)煙草D76437GTGTCAC過(guò)氧化物酶小麥X85230CTGTCAC交替氧化酶(Alternative伏都百合花Z15117CTGTCACoxidase)(Voodoolily)抗真菌蛋白天麻(GastrodiaAF334813CTGTCTCelata)乙烯產(chǎn)生ACC合酶番茄AF043122GTGTCACACC合酶綠豆AB018355CTGTCACACC合酶馬鈴薯3Z27235TTGTCAC馬鈴薯2Z27234ATGTCCCATGTCTC馬鈴薯1Z27233TTGTCCC(2x)基因有機(jī)體GenBankTMacc.No.序列TTGTCTCGTGTCACATGTCTCACC氧化酶香蕉AF030411TTGTCTC纖維素酶乙烯誘導(dǎo)的大豆U34754CTGTCTC創(chuàng)傷和應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)的黑芥子酶相關(guān)的蛋白B.napusAJ223307CTGTCACwun-1甜馬鈴薯X17554CTGTCACosr40g2(鹽應(yīng)激)水稻Y08987CTGTCAC代謝小核酮糖二磷酸羧化玉米U09743CTGTCAC酶-加氧酶(rubiscosmall)小核酮糖二磷酸羧化萊因哈德衣藻(C.X04472CTGTCAC酶-加氧酶reinhardtii)淀粉分支酶玉米AF072724CTGTCACADP-葡萄糖焦磷酸化大麥AJ239130CTGTCAC酶ADP-葡萄糖焦磷酸化馬鈴薯X96771CTGTCAC酶(2x)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白大麥AF189727CTGTCAC硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白大麥AF075270CTGTCAC葉綠素a/b-結(jié)合蛋白小麥X05823CTGTCAC其它CDPK水稻Y13658TTGTCTCCTGTCACLAP(花sp.)番茄Y08305CTGTCACMADS盒蛋白水稻AF204063CTGTCACGEG(水果sp.)非洲菊種間雜交AJ006273CTGTCAC(Gerberahybrida)表6通過(guò)雙雜交篩選鑒定的蛋白核苷酸BLASTaC.C.b蛋白BLASTaC.C.b相互作用強(qiáng)度Pti4mRNA，番茄3,00E-93Pti4，番茄5,00E-26強(qiáng)Pti4mRNA，番茄0Pti4，番茄4,00E-39強(qiáng)Pti4mRNA，番茄1,00E-101Pti4，番茄6,00E-25強(qiáng)cp29AmRNA，煙草9,00E-72cp29A，煙草1,00E-33中cp33mRNA，煙草5,00E-67cp33，煙草2E-28強(qiáng)B2mRNA，胡蘿卜3,00E-13B2，胡蘿卜4,00E-09中B2mRNA，胡蘿卜2,00E-46B2，胡蘿卜1,00E-57強(qiáng)B2mRNA，胡蘿卜5,00E-37B2，胡蘿卜3,00E-28強(qiáng)B2mRNA，胡蘿卜1,00E-25B2，胡蘿卜9,00E-31中B2mRNA，胡蘿卜2,00E-37B2，胡蘿卜4,00E-29中B2mRNA，胡蘿卜2,00E-15B2，胡蘿卜8,00E-17強(qiáng)B2mRNA，胡蘿卜7,00E-49B2，胡蘿卜7,00E-52中B2mRNA，胡蘿卜4,00E-13B2，胡蘿卜3,00E-10中B2mRNA，胡蘿卜9,00E-11B2，胡蘿卜2,00E-06強(qiáng)B2mRNA，胡蘿卜1,00E-16B2，胡蘿卜2,00E-11中無(wú)-B2-樣0,44弱無(wú)-B2-樣3,00E-09弱無(wú)-B2-樣2,00E-28弱無(wú)-B2-樣4,00E-25中無(wú)-B2-樣2,00E-15弱無(wú)-B2-樣2,00E-05中DB10mRNA，煙草DB10mRNA，煙草0,73無(wú)強(qiáng)DB10mRNA，煙草0RNA解旋酶，煙草2,00E-90強(qiáng)RZ-1mRNA，煙草1,00E-12RZ-1RNA結(jié)合蛋白，煙草0,075強(qiáng)a在非冗余(nr)GenBankTM數(shù)據(jù)庫(kù)上對(duì)核苷酸BLASTTM使用BLASTNTM程序并對(duì)蛋白BLASTTM使用BlastXTM所得的結(jié)果。bC.C確定性系數(shù)(CertaintyCoefficient)，其顯示此特定序列被隨機(jī)選擇的概率。c通過(guò)在含有X-gal的培養(yǎng)基上顯色來(lái)定性評(píng)價(jià)相互作用的強(qiáng)度。d)參考文獻(xiàn)ArnonD.I.(1949).PlantPhysiol241-15.AusubelF.M.etal.(2001).CurrentProtocolsinMolecularBiology.NewYork，Wiley.Barnes，W.M.(1990).Proc.Natl.Acad.Sci.USA879183-9187.BlumwaldE.etal.(1998).TrendsPlantSci.3342-346.BrissonN.etal.(1989)..PlantCell1559-566.BurdC.G.，DreyfussG.(1994).Science265615-621.ChenH，etal.(1998).J.Biol.Chem.27331352-31357.DahlinC.，ClineK.(1991).PlantCell31131-1140.DesprésC.，etal.(1995)PlantCell7589-598.DesveauxD.，etal.(2000)PlantCell121477-1490.DidierD.K.，KleeH.J.(1992).PlantMol.Biol.18977-979.DixonR.A.，etal.(1994).32479-501.GegenheimerP.(1990).MethodsEnzymol.182174-193.GrossP.，apRees，T.(1986).Planta167140-145.GrossetJ.，etal.(1990).PlantPhysiol.92520-527.Harlow，E.，Lane，D.(1988).Antibodiesalaboratorymanual.ColdSpringHarbor，NY，ColdSpringHarborLaboratoryPress.Hirose，T.，Sugiura，M.(2001).EMBOJ.201144-1152.HucklesbyD.P.，etal.(1972).Planta104220-233.Israel，D.I.(1993).Nucl.Ac.Res.212627-2631.Itadani，H.，etal.(1994).PlantMolBiol.24249-252.Jouanneau，J.-P.，etal.(1991).PlantPhysiol.96459-466.Kamada，S.andMiwa，T.(1992).Gene119229-236.Laemmli，U.K.(1970)Nature227680-685.Lau，P.P.，etal.(1997).J.Biol.Chem.2721452-1455.Lau，J.S.，etal.(2000).J.Cell.Biochem.79395-406.Magnien，E.，etal.(1980).PlantSci.Letters19231-241.Matton，D.P.，Brisson，N.(1989).Mol.Plant-MicrobeInteract.2325-331.Matton，D.P.，etal.(1993).PlantMol.Biol.22279-291.Maxson，J.M.，Woodson，W.R.(1996).PlantMol.Biol.31751-759.Mayda，E.，etal.(2000).PlantCell122119-2128.Michelotti，G.A.etal.(1996).Mol.Cell.Biol.162656-2669.Mieszczak，M.，etal.(1992).Mol.Gen.Genet.234390-400.Miflin，B.J.(1974).PlantPhysiol.54550-555.Moiseyev，G.P.，etal.(1994).Planta193470-472.Nakamura，T.etal.(1999).FEBSlett.460437-441.Nakamura，T.，etal.(2001).J.Biol.Chem.276147-152.Ohta，M.，etal.(1995).Plant.Mol.Bio.27529-539.Osmark，P.，etal.(1998).PlantMol.Biol.381243-1246.Pelletier，J.N.etal.(1998).Proc.Natl.Acad.Sci.USA9512141-12146.Rothman-Denes，L.B.，etal.(1998).ColdSpringHarborSymposiaonQuantitativeBiologyLXIII63-73.Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.，Maniatis，T.(1989).Molecularcloningalaboratorymanual，2ndedition.ColdSPringHarbor，NY.ColdSpringHarborLaboratoryPress.Séguin，A.，etal.(1997).PlantMol.Biol.35281-291.Smidt，M.P.，etal.(1995).Nucl.AcidsRes.232389-2395.Smith，A.M.，apReesT.(1979).Planta146327-334.Smith，D.B.，Johnson，K.S.(1988).Gene6731-40.Somssich，I.E.，Hahlbrock，K.(1998).TrendsPlantSci.386-90.Swoboda，I.，etal.(1996).Physiol.Plant.96433-438.Tang，X.，Rolfe，S.A.，Scholes，S.D.(1996).PlantCellEnv.19967-975.Tay，N.，etal.(1992).J.Virol.666841-6848.Tolnay，M.，etal.(2000).Biochem.J.348151-158.Ulmasov，T.，etal.(1995).PlantCell71611-1623.Ulmasov，T.，etal.(1999).Proc.Natl.Acad.Sci.USA965844-5849.VanLoon，L.C.，etal.(1994).PlantMol.Bio.Rep.12245-264.Vinson，C.R.，etal.(1988).GenesDev.2801-806.Waegemann，K.，Soll，J.(1996).J.Biol.Chem.2716545-6554.YeL.，etal.(1991).NuclAcidsRes.196485-6490.Zhang，Y.，etal.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA966523-6528Zhou，J.，etal.(1997).EMBOJ.163207-3218.盡管已經(jīng)描述了本發(fā)明的幾個(gè)實(shí)施方案，但是應(yīng)當(dāng)理解，還能夠?qū)Ρ景l(fā)明作進(jìn)一步的修飾，并且本申請(qǐng)意圖涵蓋本發(fā)明的任何變體、用途和改變，遵循本發(fā)明的通常原則，并包括來(lái)自本公開內(nèi)容的這樣的偏差，如在本領(lǐng)域中的知識(shí)或習(xí)慣性實(shí)踐內(nèi)，和如可適用于此前闡明的必要特征并在本發(fā)明的范圍內(nèi)和在后附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。序列表<110>蒙特利爾大學(xué)<120>植物轉(zhuǎn)錄阻遏物，結(jié)合其的蛋白質(zhì)核因子，及它們的應(yīng)用<130>000711-0042<150>PCT/CA02/00985<151>2002-06-27<150>U.S.60/303,780<151>2001-07-10<160>55<170>PatentInversion3.1<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>1tctagatcgaattccgctcgaccgg25<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>2catggactgtcacttgtttttttta25<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>3tctagaagatcacttgtttttttta25<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>4tctagactgtcgagtgtttttttta25<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>5tctagactgtcacaactttttttta25<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>6tcgcgactgtcacttgtttttttt24<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>7tctatcctgtcacttgtttttttt24<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>8tctagaaggtcacttgtttttttt24<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>9tctagactaccacttgtttttttt24<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>10tctagactgtcttttgtttttttt24<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>11tctagactgtcaagtgtttttttt24<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>12tctagactgtcactgttttttttt24<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>13tctagaatgtcacttgtttttttt24<210>14<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>14tctagacggtcacttgtttttttt24<210>15<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>15tctagactatcacttgtttttttt24<210>16<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>16tctagactgacacttgtttttttt24<210>17<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>17tctagactgtgacttgtttttttt24<210>18<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>18tctagactgtcgcttgtttttttt24<210>19<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>19tctagactgtcaattgtttttttt24<210>20<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>20tctagactgtcacgtgtttttttt24<210>21<211>1219<212>DNA<213>馬鈴薯<220><221>CDS<222>(68)..(937)<223><400>21gtttttctttttctgtcttcacaattcttttgcttcaataaaaaccttatcttcaacccc60ttctccaatggcttcttcttcttcttccctccatttcctttcacttaca109MetAlaSerSerSerSerSerLeuHisPheLeuSerLeuThr1510ccacaaacactcccaaaacccacttcccaaacaacttcaatttccttc157ProGlnThrLeuProLysProThrSerGlnThrThrSerIleSerPhe15202530ttttcacttcctccttcctctttaaacctttctttatcatcttcttca205PheSerLeuProProSerSerLeuAsnLeuSerLeuSerSerSerSer354045accccaagaaacttcgaatcttctcgttttgttcgtaaagtaaccctt253ThrProArgAsnPheGluSerSerArgPheValArgLysValThrLeu505560tctgattttgaccaaattgaggaagttgaggctggtgatgatgatgag301SerAspPheAspGlnIleGluGluValGluAlaGlyAspAspAspGlu657075gaggaggggggtttgagtgatgaaggtgcttcatatgaagaacgtaat349GluGluGlyGlyLeuSerAspGluGlyAlaSerTyrGluGluArgAsn808590gccaatcctgaccttaaaatctttgttggtaatttgcctttcagtgtt397AlaAsnProAspLeuLysIlePheValGlyAsnLeuProPheSerVal95100105110gacagtgcggctcttgctgagctttttgagcgtgctggagatgttgaa445AspSerAlaAlaLeuAlaGluLeuPheGluArgAlaGlyAspValGlu115120125atggttgaggttatctatgacaagcttacaggaagaagcagaggtttt493MetValGluValIleTyrAspLysLeuThrGlyArgSerArgGlyPhe130135140ggctttgtgacaatgtcctccaaagaggcagttgaagccgcctgtcaa541GlyPheValThrMetSerSerLysGluAlaValGluAlaAlaCysGln145150155caatttaatggctatgaaattgacgggagggcactgagggtgaattct589GlnPheAsnGlyTyrGluIleAspGlyArgAlaLeuArgValAsnSer160165170gggccagcaccacccaaaagggagaattctttcggggacaattcttct637GlyProAlaProProLysArgGluAsnSerPheGlyAspAsnSerSer175180185190taccagggaggtaggggtggagggagtatggacagttccaacagagtc685TyrGlnGlyGlyArgGlyGlyGlySerMetAspSerSerAsnArgVal195200205tacgtaggaaaccttgcatggagtgttgaccaacagcaacttgagacc733TyrValGlyAsnLeuAlaTrpSerValAspGlnGlnGlnLeuGluThr210215220ttgttcagtgagcaaggaaaggtcgtggatgccaaagtagtctatgat781LeuPheSerGluGlnGlyLysValValAspAlaLysValValTyrAsp225230235agagatagcggtagatcaaggggctttggatttgtaacatacagttcc829ArgAspSerGlyArgSerArgGlyPheGlyPheValThrTyrSerSer240245250gctaaggaggtcaacgatgcaattgaaagcttggatggtgttgaccta877AlaLysGluValAsnAspAlaIleGluSerLeuAspGlyValAspLeu255260265270ggtggcagggccatccgtgtaagtcctgctgaagctcgtccacccaga925GlyGlyArgAlaIleArgValSerProAlaGluAlaArgProProArg275280285cgtcaattctgaagattgtagccaacatctttttgaccgagaaaaggcttga977ArgGlnPhegggtccaggaggtgacgatagttgcagaaatgaatgagttatgaactttgcaacagctat1037cttaaacttgcgcggacaaactactctctacttctggactaactagagctctcaagtaaa1097ttagttttcgtaatgtatgttctgaaattgcctcaggaagaaattctgatcttgtaatat1157gattctatccatcacttgttgacagacaagacaatgaaaaagtttgatactcttcgaaaa1217ag1219<210>22<211>289<212>PRT<213>馬鈴薯<400>22MetAlaSerSerSerSerSerLeuHisPheLeuSerLeuThrProGln151015ThrLeuProLysProThrSerGlnThrThrSerIleSerPhePheSer202530LeuProProSerSerLeuAsnLeuSerLeuSerSerSerSerThrPro354045ArgAsnPheGluSerSerArgPheValArgLysValThrLeuSerAsp505560PheAspGlnIleGluGluValGluAlaGlyAspAspAspGluGluGlu65707580GlyGlyLeuSerAspGluGlyAlaSerTyrGluGluArgAsnAlaAsn859095ProAspLeuLysIlePheValGlyAsnLeuProPheSerValAspSer100105110AlaAlaLeuAlaGluLeuPheGluArgAlaGlyAspValGluMetVal115120125GluValIleTyrAspLysLeuThrGlyArgSerArgGlyPheGlyPhe130135140ValThrMetSerSerLysGluAlaValGluAlaAlaCysGlnGlnPhe145150155160AsnGlyTyrGluIleAspGlyArgAlaLeuArgValAsnSerGlyPro165170175AlaProProLysArgGluAsnSerPheGlyAspAsnSerSerTyrGln180185190GlyGlyArgGlyGlyGlySerMetAspSerSerAsnArgValTyrVal195200205GlyAsnLeuAlaTrpSerValAspGlnGlnGlnLeuGluThrLeuPhe210215220SerGluGlnGlyLysValValAspAlaLysValValTyrAspArgAsp225230235240SerGlyArgSerArgGlyPheGlyPheValThrTyrSerSerAlaLys245250255GluValAsnAspAlaIleGluSerLeuAspGlyValAspLeuGlyGly260265270ArgAlaIleArgValSerProAlaGluAlaArgProProArgArgGln275280285Phe<210>23<211>7<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>″B″表示″T″，″C″或″G″<220><221>misc_feature<222>(6)..(6)<223>″N″表示″A″，″T″，″C″或″G″<400>23btgtcnc<210>24<211>7<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>″Y″表示″T″或″C″<220><221>misc_feature<222>(6)..(6)<223>″N″表示″A″，″G″，″T″或″C″<400>24ytgtcnc7<210>25<211>7<212>DNA<213>馬鈴薯<400>25ctgtcac7<210>26<211>9<212>DNA<213>馬鈴薯<400>26gactgtcac9<210>27<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>27gccaagctttagataaaatgacacaaatgtcaaaaatgg39<210>28<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>28ccacccggggatccagctttgaac24<210>29<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>29cagtccatggttaaatcaac20<210>30<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>30taaccatggactgtcacttg20<210>31<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>31gccgcaagttttctgcagtgtttttgctc29<210>32<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>32ggtttggatccagtagtaaagtggcga27<210>33<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>33atgtctactcctgcgctcatt21<210>34<211>41<212>PRT<213>馬鈴薯<220><221>MISC_FEATURE<222>(37)..(37)<223>″Xaa″是未知的<400>34ValThrLeuSerAspPheAspGlnIleGluGluValGluAlaGlyAsp151015AspAspGluGluGluGlyGlyLeuSerAspGluAlaGlyAlaSerTyr202530GluGluArgAsnXaaAsnProAspLeu3540<210>35<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<220><221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>″n″相當(dāng)于一個(gè)修飾的堿基肌苷<220><221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>″n″相當(dāng)于一個(gè)修飾的堿基肌苷<400>35gtkacwytntcngatttygayca23<210>36<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<220><221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>″n″相當(dāng)于一個(gè)修飾的堿基肌苷<400>36arrttwccnacraaratytt20<210>37<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>37gtttgagtgatgaaggtgc19<210>38<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>38gccgttctgtcttcacaattcttttgcttc30<210>39<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>39caacatctccagcacgctcaaaaagctcag30<210>40<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>40cctctgcttcttcctgtaagcttgtcatag30<210>41<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>41cagttgaagccgcctgtcaacaatttaatg30<210>42<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>42ttgacgggagggcactgagggtgaattctg30<210>43<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>43gctttcaattgcatcgttgacctccttag29<210>44<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>44gcttcagcaggacttacacggatggccctg30<210>45<211>25<212>DNA<213>馬鈴薯<400>45tctagactgtcacttgtttttttta25<210>46<211>24<212>DNA<213>馬鈴薯<400>46tctagactgtcacttgtttttttt24<210>47<211>25<212>DNA<213>馬鈴薯<400>47tctagactgtcacttgtttttttta25<210>48<211>25<212>DNA<213>馬鈴薯<400>48aacatctgctttgtcaccctccttg25<210>49<211>25<212>DNA<213>煙草<400>49attaagccatgtctccatcatcttc25<210>50<211>7<212>DNA<213>馬鈴薯<400>50ctgtcac7<210>51<211>7<212>DNA<213>甘氨酸max<400>51ttgtctc7<210>52<211>21<212>DNA<213>煙草<400>52taagccatgtctccatcatct21<210>53<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>53taagccctgtctccatcatct21<210>54<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<400>54taagccatatctccatcatct21<210>55<211>6<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列被完整地合成<220><221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>n表示″A″，″T″，″C″或″G″<400>55tgtcnc6權(quán)利要求書(按照條約第19條的修改)1、一種轉(zhuǎn)化的或者轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，其包含a)在SEQIDNO21中列出的核酸序列；b)與SEQIDNO21具有至少96％核苷酸序列同一性的核苷酸序列；和c)與編碼SEQIDNO22的氨基酸序列的核酸具有至少75％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。2、一種克隆或者表達(dá)載體，其包含a)在SEQIDNO21中列出的核酸序列；b)與SEQIDNO21具有至少96％核苷酸序列同一性的核苷酸序列；和c)與編碼SEQIDNO22的氨基酸序列的核酸具有至少75％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。3、權(quán)利要求2的載體，其中所述的載體能夠在包含載體的細(xì)胞中指導(dǎo)由所述核酸編碼的多肽的表達(dá)。4、一種包含選自以下氨基酸序列的分離或純化的蛋白a)由SEQIDNO.21中列出的核酸編碼的序列；b)與SEQIDNO22具有至少85％同一性的序列；c)與SEQIDNO22具有至少87％相似性的序列；d)SEQIDNO22中列出的序列；e)與由SEQIDNO21中的核苷酸68-937編碼的氨基酸具有至少85％同一性的序列；和f)與由SEQIDNO21中的核苷酸68-937編碼的氨基酸序列具有至少87％序列相似性的序列。5、一種包含分離或純化的SEBF蛋白或其功能性同系物的組合物。6、權(quán)利要求5的組合物，其中所述的SEBF蛋白或同系物含有選自下面的氨基酸序列a)由具有與SEQIDNO21中的核苷酸68-937至少85％的同一性的序列的核酸編碼的序列；b)與SEQIDNO22具有至少85％同一性的序列；c)與SEQIDNO22具有至少87％相似性的序列；和d)SEQIDNO22中提供的序列。7、權(quán)利要求6的組合物，其中所述的SEBF蛋白或者同系物包含與SEQIDNO22100％相同的氨基酸序列。8、權(quán)利要求5-7中任何一項(xiàng)的組合物，其中所述的SEBF蛋白或者同系物由馬鈴薯SEBF蛋白組成。9、權(quán)利要求5或8的組合物，其中所述的SEBF蛋白純化自馬鈴薯，而且其中其具有的純化系數(shù)為大約90-大約20,700倍。10、一種特異結(jié)合SEBF蛋白的分離或純化的抗體。11、一種分離或純化的基因調(diào)控元件，其包含對(duì)基因PR-10a的沉默元件(SE)在植物中具有全部活性所必需的核酸序列。12、權(quán)利要求11的調(diào)控元件，其中其由沉默元件組成。13、權(quán)利要求11或12的調(diào)控元件，其中所述的核酸序列包含序列GACTGTCAC(SEQIDNO26)。14、權(quán)利要求11或12的調(diào)控元件，其中所述的核酸序列包含序列BTGTCNC(SEQIDNO23)。15、權(quán)利要求14的調(diào)控元件，其中所述的核酸序列本質(zhì)上由序列BTGTCNC(SEQIDNO23)組成。16、權(quán)利要求14或者15的調(diào)控元件，其中在所述序列BTGTCNC中，B由嘧啶組成。17、權(quán)利要求14-16中任何一項(xiàng)的調(diào)控元件，其中在所述序列BTGTCNC中，B由C組成并且N由A組成。18、一種DNA構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求11-17任意一項(xiàng)中的調(diào)控元件。19、權(quán)利要求18的DNA構(gòu)建體，其中所述的調(diào)控元件被有效連接到可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。20、一種遺傳修飾的植物實(shí)體，在其中已經(jīng)引入了權(quán)利要求11-17任何一項(xiàng)中的調(diào)控元件和/或權(quán)利要求19或20的DNA構(gòu)建體。21、一種在植物中改變基因表達(dá)的方法，其包含在所述植物中改變核DNA結(jié)合蛋白結(jié)合到序列BTGTCNC。22、權(quán)利要求21的方法，其中所述的內(nèi)源DNA結(jié)合蛋白選自由與SEBF(SEQIDNO22)具有至少48％同一性或相似性的蛋白組成的組。23、權(quán)利要求22的方法，其中所述的核DNA結(jié)合蛋白由SEBF(SEQIDNO22)組成或者由與SEBF具有至少90％同一性或相似性的蛋白組成。24、權(quán)利要求23的方法，用來(lái)改變PR基因的表達(dá)。25、一種用來(lái)增加目的基因表達(dá)的方法，所述的基因具有包含序列BTGTCNC的啟動(dòng)子區(qū)域，所述的方法包含突變所述基因的啟動(dòng)子區(qū)域以突變或者刪除序列BTGTCNC的步驟。26、一種用來(lái)降低目的基因表達(dá)的方法，所述的基因具有缺乏序列BTGTCNC的啟動(dòng)子區(qū)域，所述的方法包含以有效連接的方式將序列BTGTCNC引入到所述的啟動(dòng)子區(qū)域的步驟。27、一種含有基因組的、遺傳修飾的植物性宿主，其中，與在所述基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在或不存在序列BTGTCNC相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄活性已被改變，將所述被改變的轉(zhuǎn)錄活性與其中轉(zhuǎn)錄活性未被改變的、相應(yīng)的未被遺傳修飾的植物性宿主進(jìn)行比較。28、權(quán)利要求27的植物性宿主，其中所述的啟動(dòng)子區(qū)域包含序列BTGTCNC(SEQIDNO23)，而且其中所述的啟動(dòng)子區(qū)域已經(jīng)被遺傳修飾以使與序列BTGTCNC存在相關(guān)的抑制轉(zhuǎn)錄活性失活。29、權(quán)利要求27或28的植物性宿主，其中所述的啟動(dòng)子區(qū)域已經(jīng)被遺傳修飾以突變或者刪除所述序列BTGTCNC。30、權(quán)利要求27的植物性宿主，其中所述的啟動(dòng)子區(qū)域沒(méi)有序列BTGTCNC(SEQIDNO23)，而且其中所述宿主的啟動(dòng)子區(qū)域已經(jīng)被遺傳修飾以使所述序列BTGTCNC被以有效連接的方式插入其中。31、權(quán)利要求27-30任何一項(xiàng)中的植物性宿主，其中在所述序列BTGTCNC中，B由嘧啶組成。32、權(quán)利要求27-31任何一項(xiàng)中的植物性宿主，其中所述的植物性宿主由植物組成。33、權(quán)利要求32的植物性宿主，其中所述的植物選自蔬菜、豆科植物、樹、和谷類。34、權(quán)利要求32的植物性宿主，其中所述的植物選自馬鈴薯、番茄、煙草、棉花、水稻、小麥、玉米、大麥、燕麥、油菜、大豆、豌豆、甘蔗、甜菜、草莓和香蕉。35、一種用來(lái)獲得遺傳修飾的、呈現(xiàn)選自下列表型的植物的方法-對(duì)病原體的增加的抗性或者耐受性；-增加的生長(zhǎng)、生根和/或果實(shí)生產(chǎn)；-對(duì)生長(zhǎng)素除草劑的增加的敏感性；-增加的乙烯生產(chǎn)；-早期的果實(shí)成熟；其中在所述表型中涉及的基因的啟動(dòng)子區(qū)域包含序列BTGTCNC(SEQIDNO23)，而且其中將所述的表型與相應(yīng)的未被遺傳修飾的植物比較，所述的方法包含遺傳修飾所述植物的基因組以使與所述序列BTGTCNC存在相關(guān)的內(nèi)源轉(zhuǎn)錄活性失活的步驟。36、一種用來(lái)獲得遺傳修飾的、呈現(xiàn)選自下列表型的植物的方法-對(duì)病原體的降低的抗性或者耐受性；-降低的生長(zhǎng)、生根和/或果實(shí)生產(chǎn)；-對(duì)生長(zhǎng)素除草劑的增加的抗性；-降低的乙烯生產(chǎn)；-其果實(shí)成熟延遲和/或其果實(shí)受到保護(hù)而使其避免過(guò)成熟；和其中在所述表型中涉及的基因的啟動(dòng)子區(qū)域不含BTGTCNC(SEQIDNO23)，而且其中將所述的表型與相應(yīng)的未被遺傳修飾的植物比較，所述的方法包含遺傳修飾所述植物的基因組以使所述序列BTGTCNC被以有效連接的方式插入其中的步驟。37、一種植物性宿主，其被遺傳修飾以呈現(xiàn)具有特異結(jié)合BTGTCNC(SEQIDNO23)活性的蛋白質(zhì)核因子的表達(dá)或者生物學(xué)活性發(fā)生改變，其中將所述的改變水平與相應(yīng)的未被遺傳修飾的、其中所述的內(nèi)源性水平未被改變的植物性宿主相比較。38、權(quán)利要求37的植物性宿主，其中所述的多肽選自由與SEBF(SEQIDNO22)具有至少48％同一性或相似性的多肽組成的組。39、權(quán)利要求37或38的植物性宿主，其中所述的宿主由植物組成，而且其中所述的多肽由SEBF或者由與SEBF具有至少90％同一性或相似性的多肽組成。40、權(quán)利要求37的植物性宿主，其中SEBF或者與SEBF具有至少90％同一性或相似性的多肽的表達(dá)或者生物學(xué)活性已經(jīng)被增加了，而且其中所述的遺傳修飾的宿主呈現(xiàn)選自下列的表型-對(duì)病原體的降低的抗性或者耐受性；-降低的生長(zhǎng)、生根和/或果實(shí)生產(chǎn)；-對(duì)生長(zhǎng)素除草劑的增加的抗性；-降低的乙烯生產(chǎn)；和-其果實(shí)成熟延遲和/或其果實(shí)受到保護(hù)而使其避免過(guò)成熟；將其中所述的表型與其中SEBF的表達(dá)或生物學(xué)活性未被增加的、相應(yīng)的未被遺傳修飾的宿主比較。41、權(quán)利要求37的植物性宿主，其中SEBF或者與SEBF具有至少90％同一性或相似性的多肽的表達(dá)或者生物學(xué)活性已經(jīng)被降低了，而且其中所述的遺傳修飾的宿主呈現(xiàn)選自下列的表型-對(duì)病原體的增加的抗性或者耐受性；-增加的生長(zhǎng)、生根和/或果實(shí)生產(chǎn)；-對(duì)生長(zhǎng)素除草劑的增加的敏感性；-增加的乙烯生產(chǎn)；和-早期的果實(shí)成熟；將其中所述的表型與其中SEBF的表達(dá)或生物學(xué)活性未被增加的、相應(yīng)的未被遺傳修飾的宿主比較。42、權(quán)利要求37-41任何一項(xiàng)中的宿主，其中在所述序列BTGTCNC中，B由嘧啶組成。43、權(quán)利要求37-42任何一項(xiàng)中的宿主，其中的植物性宿主由選自蔬菜、豆科植物、樹、和谷類的植物組成。44、權(quán)利要求37-42任何一項(xiàng)中的宿主，其中的植物性宿主由選自馬鈴薯、番茄、煙草、棉花、水稻、小麥、玉米、大麥、燕麥、油菜、大豆、豌豆、甘蔗、甜菜、草莓和香蕉的植物組成。45、一種用來(lái)獲得選自下列結(jié)果的方法-調(diào)節(jié)植物對(duì)病原體的抗性或者耐受性；-調(diào)節(jié)由生長(zhǎng)素控制的植物基因的誘導(dǎo)；-調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)素控制的基因誘導(dǎo)；-增加植物的生長(zhǎng)、生根和/或果實(shí)生產(chǎn)；-調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的ACC合酶基因；-調(diào)節(jié)植物乙烯生產(chǎn)；和-調(diào)節(jié)植物質(zhì)體mRNAs的穩(wěn)定性、表達(dá)或活性；其中所述的方法包含下列步驟在所述植物中調(diào)節(jié)內(nèi)源性SEBF蛋白或者SEBF功能性同系物的表達(dá)或生物學(xué)活性。46、一種用來(lái)獲得選自下列結(jié)果的方法-增加的植物對(duì)病原體的植物抗性或者耐受性；-增加的植物生長(zhǎng)、生根和果實(shí)生產(chǎn)；-增加的植物對(duì)生長(zhǎng)素除草劑的敏感性；-增加的植物的乙烯生產(chǎn)；-誘導(dǎo)植物的果實(shí)早熟；其中所述的方法包含下列步驟在所述植物中降低內(nèi)源性SEBF蛋白或者SEBF功能性同系物的表達(dá)或生物學(xué)活性。47、一種用來(lái)獲得選自下列結(jié)果的方法-降低的植物對(duì)病原體的抗性或者耐受性；-降低的植物生長(zhǎng)、生根和果實(shí)生產(chǎn)；-增加的植物對(duì)生長(zhǎng)素除草劑的抗性；-降低的植物的乙烯生產(chǎn)；-延遲植物果實(shí)成熟和/或使植物果實(shí)受到保護(hù)而避免其過(guò)成熟；和其中所述的方法包含下列步驟在所述植物中增加內(nèi)源性SEBF蛋白或者SEBF功能性同系物的表達(dá)或者生物學(xué)活性。48、一種調(diào)節(jié)植物對(duì)病原體抗性或耐受性的方法，包含在所述植物中調(diào)節(jié)內(nèi)源性SEBF蛋白或者SEBF功能性同系物的表達(dá)或者生物學(xué)活性。49、一種增加植物對(duì)病原體抗性或耐受性的方法，包含在所述植物中降低內(nèi)源性SEBF蛋白或者SEBF功能性同系物的表達(dá)或者生物學(xué)活性。50、權(quán)利要求49的方法，其中通過(guò)實(shí)施選自下列的方法來(lái)降低所述內(nèi)源性SEBF蛋白或者所述SEBF功能性同系物的表達(dá)或生物學(xué)活性在所述植物中表達(dá)SEBF的反義分子；表達(dá)誘導(dǎo)SEBF水平或者活性的共抑制的蛋白；敲除或者化學(xué)突變編碼所述SEBF蛋白的基因；和表達(dá)切割SEBFmRNA的核酶。51、一種用來(lái)降低植物對(duì)病原體抗性或者耐受性的方法，包含在所述植物中增加SEBF蛋白或者SEBF功能性同系物的表達(dá)或者生物學(xué)活性。52、權(quán)利要求51的方法，其中通過(guò)在所述植物中引入可表達(dá)的SEBF編碼序列來(lái)增加所述內(nèi)源性SEBF蛋白或者SEBF功能性同系物的表達(dá)或生物學(xué)活性。53、權(quán)利要求52的方法，其中所述的SEBF編碼序列處于可誘導(dǎo)的或者組成型的啟動(dòng)子的控制下。54、一種被遺傳修飾以使其與相應(yīng)的未被遺傳修飾的植物相比，具有對(duì)病原體增加的抗性或者耐受性的植物，其中與相應(yīng)的未被遺傳修飾的植物相比，所述遺傳修飾植物中的內(nèi)源性SEBF蛋白或者SEBF功能性同系物的表達(dá)或生物學(xué)活性被降低了。55、權(quán)利要求54的植物，其中所述的植物選自蔬菜、豆科植物、樹、和谷類。56、權(quán)利要求54的植物，其中所述的植物選自馬鈴薯、番茄、煙草、棉花、水稻、小麥、玉米、大麥、燕麥、油菜、大豆、豌豆、甘蔗、甜菜、草莓和香蕉。57、一種被遺傳修飾以使其與相應(yīng)的未被遺傳修飾的植物相比，具有對(duì)病原體降低的抗性或者耐受性的植物，其中與相應(yīng)的未被遺傳修飾的植物相比，所述遺傳修飾植物中的內(nèi)源性SEBF蛋白或者SEBF功能性同系物的表達(dá)或生物學(xué)活性被增加了。58、一種用于調(diào)節(jié)植物對(duì)病原體抗性或者耐受性的方法，所述的植物在基因的啟動(dòng)子區(qū)域具有序列BTGTCNC(SEQIDNO23)，所述的方法包含在所述植物中改變內(nèi)源性核DNA結(jié)合蛋白與所述序列BTGTCNC的結(jié)合。59、權(quán)利要求58的方法，其中所述的內(nèi)源性核DNA結(jié)合蛋白選自由與SEBF(SEQ96IDNO22)具有至少48％同一性或相似性的蛋白組成的組。60、權(quán)利要求59的方法，其中所述的核DNA結(jié)合蛋白由SEBF(SEQIDNO22)或其功能性同系物組成。61、權(quán)利要求58-60任何一項(xiàng)中的方法，其中所述的植物選自蔬菜、豆科植物、樹、和谷類。62、權(quán)利要求58-60任何一項(xiàng)中的方法，其中所述的植物選自馬鈴薯、番茄、煙草、棉花、水稻、小麥、玉米、大麥、燕麥、油菜、大豆、豌豆、甘蔗、甜菜、草莓和香蕉。63、一種用于增加植物對(duì)病原體抗性或者耐受性的方法，所述的植物在基因的啟動(dòng)子區(qū)域具有序列BTGTCNC(SEQIDNO23)，所述的方法包含在所述植物中降低或阻止內(nèi)源性核DNA結(jié)合蛋白與所述序列BTGTCNC的結(jié)合。64、權(quán)利要求63的方法，其包含突變或者刪除所述序列BTGTCNC。65、權(quán)利要求63或64的方法，其中所述序列BTGTCNC位于防御基因的啟動(dòng)子區(qū)域。66、權(quán)利要求65的方法，其中所述的防御基因選自表5中所列的基因，包括Pr-10、Pr-10(ypr10a)、Pr-10(ypr10b)、Pr-10a、Pr-10b、幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、PR-1、滲透蛋白(PR-5)、過(guò)氧化物酶、交替氧化酶和抗真菌蛋白。67、一種用于降低植物對(duì)病原體抗性或者耐受性的方法，該方法包含在所述植物中允許或者增加內(nèi)源性核DNA結(jié)合蛋白結(jié)合到包含序列BTGTCNC(SEQIDNO23)的基因啟動(dòng)子區(qū)域。68、權(quán)利要求65的方法，其中所述的啟動(dòng)子區(qū)域沒(méi)有所述序列BTGTCNC(SEQIDNO23)，而且其中將所述序列BTGTCNC有效地插入到所述的啟動(dòng)子區(qū)域。69、權(quán)利要求68的方法，其中所述的插入降低了所述基因的表達(dá)。70、一種用來(lái)在植物中調(diào)節(jié)由生長(zhǎng)素控制的基因的誘導(dǎo)的方法，其包含在所述的植物中調(diào)節(jié)內(nèi)源性SEBF蛋白或SEBF功能性同系物的表達(dá)或者生物學(xué)活性。71、一種用來(lái)在植物中增加生長(zhǎng)、生根和/或果實(shí)產(chǎn)生的方法，其包含在所述植物中降低內(nèi)源性SEBF蛋白或SEBF功能性同系物的表達(dá)或者生物學(xué)活性。72、一種被遺傳修飾以使其與相應(yīng)的未被遺傳修飾的植物相比，具有增加的生長(zhǎng)、生根和/或果實(shí)產(chǎn)生的植物，其中與相應(yīng)的未被遺傳修飾的植物相比，所述遺傳修飾植物中的內(nèi)源性SEBF蛋白或者SEBF功能性同系物的表達(dá)或生物學(xué)活性被增加了。73、一種用來(lái)增加植物對(duì)生長(zhǎng)素除草劑抗性的方法，其包含在所述的植物中降低內(nèi)源性SEBF蛋白或SEBF功能性同系物的表達(dá)或者生物學(xué)活性。74、一種被遺傳修飾以使其與相應(yīng)的未被遺傳修飾的植物相比，具有對(duì)生長(zhǎng)素除草劑增加的抗性的植物，其中與相應(yīng)的未被遺傳修飾的植物相比，所述遺傳修飾植物中的內(nèi)源性SEBF蛋白或者SEBF功能性同系物的表達(dá)或生物學(xué)活性被增加了。75、一種用來(lái)調(diào)節(jié)植物乙烯產(chǎn)生的方法，其包含在所述的植物中調(diào)節(jié)內(nèi)源性SEBF蛋白或SEBF功能性同系物的表達(dá)或者生物學(xué)活性。76、一種用來(lái)增加植物生產(chǎn)乙烯的方法，其包含在所述的植物中降低內(nèi)源性SEBF蛋白或SEBF功能性同系物的表達(dá)或者生物學(xué)活性。77、一種被遺傳修飾以使其與相應(yīng)的未被遺傳修飾的植物相比，具有增加的乙烯生產(chǎn)的植物，其中與相應(yīng)的未被遺傳修飾的植物相比，所述遺傳修飾植物中的內(nèi)源性SEBF蛋白或者SEBF功能性同系物的表達(dá)或生物學(xué)活性被降低了。78、一種用來(lái)降低植物生產(chǎn)乙烯的方法，其包含在所述的植物中增加內(nèi)源性SEBF蛋白或SEBF功能性同系物的表達(dá)或者生物學(xué)活性。79、一種被遺傳修飾以使其與相應(yīng)的未被遺傳修飾的植物相比，具有減少的乙烯生產(chǎn)的植物，其中與相應(yīng)的未被遺傳修飾的植物相比，所述遺傳修飾植物中的內(nèi)源性SEBF蛋白或者SEBF功能性同系物的表達(dá)或生物學(xué)活性被降低了。權(quán)利要求1.一種分離的或者純化的核酸分子，其包含選自下述的序列a)在SEQIDNO21中列出的序列；b)與SEQIDNO21具有至少96％核苷酸序列同一性的核苷酸序列；和c)與編碼SEQIDNO22的氨基酸序列的核酸具有至少75％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。2.一種轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，其包含權(quán)利要求1的核酸。3.一種克隆或者表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求1的核酸。4.權(quán)利要求3的載體，其中所述的載體能夠在包含載體的細(xì)胞中指導(dǎo)由所述核酸編碼的多肽的表達(dá)。5.一種包含選自以下氨基酸序列的分離或純化的蛋白a)由權(quán)利要求1的核酸編碼的序列；b)與SEQIDNO22具有至少85％同一性的序列；c)與SEQIDNO22具有至少87％相似性的序列；d)SEQIDNO22中列出的序列；e)與由SEQIDNO21中的核苷酸68-937編碼的氨基酸具有至少85％同一性的序列；和f)與由SEQIDNO21中的核苷酸68-937編碼的氨基酸序列具有至少87％序列相似性的序列。6.一種包含分離或純化的SEBF蛋白或其功能性同系物的組合物。7.權(quán)利要求6的組合物，其中所述的SEBF蛋白或同系物含有選自下面的氨基酸序列a)由具有與SEQIDNO21中的核苷酸68-937至少85％的同一性的序列的核酸編碼的序列；b)與SEQIDNO22具有至少85％同一性的序列；c)與SEQIDNO22具有至少87％相似性的序列；和d)SEQIDNO22中提供的序列。8.權(quán)利要求PREC的組合物，其中所述的SEBF蛋白或者同系物包含與SEQIDNO22100％相同的氨基酸序列。9.權(quán)利要求6-8中任何一項(xiàng)的組合物，其中所述的SEBF蛋白或者同系物由馬鈴薯SEBF蛋白組成。10.權(quán)利要求6或9的組合物，其中所述的SEBF蛋白純化自馬鈴薯，而且其中其具有的純化系數(shù)為大約90-大約20700倍。11.一種特異結(jié)合SEBF蛋白的分離或純化的抗體。12.一種分離或純化的基因調(diào)控元件，其包含對(duì)基因PR-10a的沉默元件(SE)在植物中具有全部活性所必需的核酸序列。13.權(quán)利要求12的調(diào)控元件，其中其由沉默元件組成。14.權(quán)利要求12或13的調(diào)控元件，其中所述的核酸序列包含序列GACTGTCAC(SEQIDNO26)。15.權(quán)利要求12或13的調(diào)控元件，其中所述的核酸序列包含序列BTGTCNC(SEQIDNO23)。16.權(quán)利要求15的調(diào)控元件，其中所述的核酸序列本質(zhì)上由序列BTGTCNC(SEQIDNO)組成。17.權(quán)利要求15或者16的調(diào)控元件，其中在所述序列BTGTCNC中，B由嘧啶組成。18.權(quán)利要求15-17中任何一項(xiàng)的調(diào)控元件，其中在所述序列BTGTCNC中，B由C組成并且N由A組成。19.一種DNA構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求12-18任意一項(xiàng)中的調(diào)控元件。20.權(quán)利要求19的DNA構(gòu)建體，其中所述的調(diào)控元件被有效連接到可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。21.一種遺傳修飾的植物實(shí)體，在其中已經(jīng)引入了權(quán)利要求12-18任何一項(xiàng)中的調(diào)控元件和/或權(quán)利要求19或20的DNA構(gòu)建體。22.一種在植物中改變基因表達(dá)的方法，其包含在所述植物中改變核DNA結(jié)合蛋白結(jié)合到序列BTGTCNC。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述的內(nèi)源DNA結(jié)合蛋白選自由與SEBF(SEQIDNO22)具有至少48％同一性或相似性的蛋白組成的組。24.權(quán)利要求23的方法，其中所述的核DNA結(jié)合蛋白由SEBF(SEQIDNO22)組成或者由與SEBF具有至少90％同一性或相似性的蛋白組成。25.權(quán)利要求24的方法，用來(lái)改變PR基因的表達(dá)。26.一種用來(lái)增加目的基因表達(dá)的方法，所述的基因具有包含序列BTGTCNC的啟動(dòng)子區(qū)域，所述的方法包含突變所述基因的啟動(dòng)子區(qū)域以突變或者刪除序列BTGTCNC的步驟。27.一種用來(lái)降低目的基因表達(dá)的方法，所述的基因具有缺乏序列BTGTCNC的啟動(dòng)子區(qū)域，所述的方法包含以有效連接的方式將序列BTGTCNC引入到所述的啟動(dòng)子區(qū)域的步驟。28.一種含有基因組的、遺傳修飾的植物性宿主，其中，與在所述基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在或不存在序列BTGTCNC相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄活性已被改變，將所述被改變的轉(zhuǎn)錄活性與其中轉(zhuǎn)錄活性未被改變的、相應(yīng)的未被遺傳修飾的植物性宿主進(jìn)行比較。29.權(quán)利要求28的植物性宿主，其中所述的啟動(dòng)子區(qū)域包含序列BTGTCNC(SEQIDNO23)，而且其中所述的啟動(dòng)子區(qū)域已經(jīng)被遺傳修飾以使與序列BTGTCNC存在相關(guān)的抑制轉(zhuǎn)錄活性失活。30.權(quán)利要求28或29的植物性宿主，其中所述的啟動(dòng)子區(qū)域已經(jīng)被遺傳修飾以突變或者刪除所述序列BTGTCNC。31.權(quán)利要求28的植物性宿主，其中所述的啟動(dòng)子區(qū)域沒(méi)有序列BTGTCNC(SEQIDNO23)，而且其中所述宿主的啟動(dòng)子區(qū)域已經(jīng)被遺傳修飾以使所述序列BTGTCNC被以有效連接的方式插入其中。32.權(quán)利要求28-31任何一項(xiàng)中的植物性宿主，其中在所述序列BTGTCNC中，B由嘧啶組成。33.權(quán)利要求28-32任何一項(xiàng)中的植物性宿主，其中所述的植物性宿主由植物組成。34.權(quán)利要求33的植物性宿主，其中所述的植物選自蔬菜、豆科植物、樹、和谷類。35.權(quán)利要求33的植物性宿主，其中所述的植物選自馬鈴薯、番茄、煙草、棉花、水稻、小麥、玉米、大麥、燕麥、油菜、大豆、豌豆、甘蔗、甜菜、草莓和香蕉。36.一種用來(lái)獲得遺傳修飾的、呈現(xiàn)選自下列表型的植物的方法-對(duì)病原體的增加的抗性或者耐受性；-增加的生長(zhǎng)、生根和/或果實(shí)生產(chǎn)；-對(duì)生長(zhǎng)素除草劑的增加的敏感性；-增加的乙烯生產(chǎn)；-早期的果實(shí)成熟；其中在所述表型中涉及的基因的啟動(dòng)子區(qū)域包含序列BTGTCNC(SEQIDNO23)，而且其中將所述的表型與相應(yīng)的未被遺傳修飾的植物比較，所述的方法包含遺傳修飾所述植物的基因組以使與所述序列BTGTCNC存在相關(guān)的內(nèi)源轉(zhuǎn)錄活性失活的步驟。37.一種用來(lái)獲得遺傳修飾的、呈現(xiàn)選自下列表型的植物的方法-對(duì)病原體的降低的抗性或者耐受性；-降低的生長(zhǎng)、生根和/或果實(shí)生產(chǎn)；-對(duì)生長(zhǎng)素除草劑的增加的抗性；-降低的乙烯生產(chǎn)；-其果實(shí)成熟延遲和/或其果實(shí)受到保護(hù)而使其避免過(guò)成熟；和其中在所述表型中涉及的基因的啟動(dòng)子區(qū)域不含BTGTCNC(SEQIDNO23)，而且其中將所述的表型與相應(yīng)的未被遺傳修飾的植物比較，所述的方法包含遺傳修飾所述植物的基因組以使所述序列BTGTCNC被以有效連接的方式插入其中的步驟。38.一種植物性宿主，其被遺傳修飾以呈現(xiàn)具有特異結(jié)合BTGTCNC(SEQIDNO23)活性的蛋白質(zhì)核因子的表達(dá)或者生物學(xué)活性發(fā)生改變，其中將所述的改變水平與相應(yīng)的未被遺傳修飾的、其中所述的內(nèi)源性水平未被改變的植物性宿主相比較。39.權(quán)利要求38的植物性宿主，其中所述的多肽選自由與SEBF(SEQIDNO22)具有至少48％同一性或相似性的多肽組成的組。40.權(quán)利要求38或39的植物性宿主，其中所述的宿主由植物組成，而且其中所述的多肽由SEBF或者由與SEBF具有至少90％同一性或相似性的多肽組成。41.權(quán)利要求38的植物性宿主，其中SEBF或者與SEBF具有至少90％同一性或相似性的多肽的表達(dá)或者生物學(xué)活性已經(jīng)被增加了，而且其中所述的遺傳修飾的宿主呈現(xiàn)選自下列的表型-對(duì)病原體的降低的抗性或者耐受性；-降低的生長(zhǎng)、生根和/或果實(shí)生產(chǎn)；-對(duì)生長(zhǎng)素除草劑的增加的抗性；-降低的乙烯生產(chǎn)；和-其果實(shí)成熟延遲和/或其果實(shí)受到保護(hù)而使其避免過(guò)成熟；將所述的表型與其中SEBF的表達(dá)或生物學(xué)活性未被增加的、相應(yīng)的未被遺傳修飾的宿主比較。42.權(quán)利要求38的植物性宿主，其中SEBF或者與SEBF具有至少90％同一性或相似性的多肽的表達(dá)或者生物學(xué)活性已經(jīng)被降低了，而且其中所述的遺傳修飾的宿主呈現(xiàn)選自下列的表型-對(duì)病原體的增加的抗性或者耐受性；-增加的生長(zhǎng)、生根和/或果實(shí)生產(chǎn)；-對(duì)生長(zhǎng)素除草劑的增加的敏感性；-增加的乙烯生產(chǎn)；和-早期的果實(shí)成熟；將所述的表型與其中SEBF的表達(dá)或生物學(xué)活性未被增加的、相應(yīng)的未被遺傳修飾的宿主比較。43.權(quán)利要求38-42任何一項(xiàng)中的宿主，其中在所述序列BTGTCNC中，B由嘧啶組成。44.權(quán)利要求38-43任何一項(xiàng)中的宿主，其中的植物性宿主由選自蔬菜、豆科植物、樹、和谷類的植物組成。45.權(quán)利要求38-43任何一項(xiàng)中的宿主，其中的植物性宿主由選自馬鈴薯、番茄、煙草、棉花、水稻、小麥、玉米、大麥、燕麥、油菜、大豆、豌豆、甘蔗、甜菜、草莓和香蕉的植物組成。46.一種用來(lái)獲得選自下列結(jié)果的方法-調(diào)節(jié)植物對(duì)病原體的抗性或者耐受性；-調(diào)節(jié)由生長(zhǎng)素控制的植物基因的誘導(dǎo)；-調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)素控制的基因誘導(dǎo)；-增加植物的生長(zhǎng)、生根和/或果實(shí)生產(chǎn)；-調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的ACC合酶基因；-調(diào)節(jié)植物乙烯生產(chǎn)；和-調(diào)節(jié)植物質(zhì)體mRNAs的穩(wěn)定性、表達(dá)或活性；其中所述的方法包含下列步驟在所述植物中調(diào)節(jié)內(nèi)源性SEBF蛋白或者SEBF功能性同系物的表達(dá)或生物學(xué)活性。47.一種用來(lái)獲得選自下列結(jié)果的方法-增加的植物對(duì)病原體的植物抗性或者耐受性；-增加的植物生長(zhǎng)、生根和果實(shí)生產(chǎn)；-增加的植物對(duì)生長(zhǎng)素除草劑的敏感性；-增加的植物的乙烯生產(chǎn)；-誘導(dǎo)植物的果實(shí)早熟；其中所述的方法包含下列步驟在所述植物中降低內(nèi)源性SEBF蛋白或者SEBF功能性同系物的表達(dá)或生物學(xué)活性。48.一種用來(lái)獲得選自下列結(jié)果的方法-降低的植物對(duì)病原體的抗性或者耐受性；-降低的植物生長(zhǎng)、生根和果實(shí)生產(chǎn)；-增加的植物對(duì)生長(zhǎng)素除草劑的抗性；-降低的植物的乙烯生產(chǎn)；-延遲植物果實(shí)成熟和/或使植物果實(shí)受到保護(hù)而避免其過(guò)成熟；和其中所述的方法包含下列步驟在所述植物中增加內(nèi)源性SEBF蛋白或者SEBF功能性同系物的表達(dá)或者生物學(xué)活性。49.一種調(diào)節(jié)植物對(duì)病原體抗性或耐受性的方法，包含在所述植物中調(diào)節(jié)內(nèi)源性SEBF蛋白或者SEBF功能性同系物的表達(dá)或者生物學(xué)活性。50.一種增加植物對(duì)病原體抗性或耐受性的方法，包含在所述植物中降低內(nèi)源性SEBF蛋白或者SEBF功能性同系物的表達(dá)或者生物學(xué)活性。51.權(quán)利要求50的方法，其中通過(guò)實(shí)施選自下列的方法來(lái)降低所述內(nèi)源性SEBF蛋白或者所述SEBF功能性同系物的表達(dá)或生物學(xué)活性在所述植物中表達(dá)SEBF的反義分子；表達(dá)誘導(dǎo)SEBF水平或者活性的共抑制的蛋白；敲除或者化學(xué)突變編碼所述SEBF蛋白的基因；和表達(dá)切割SEBFmRNA的核酶。52.一種用來(lái)降低植物對(duì)病原體抗性或者耐受性的方法，包含在所述植物中增加SEBF蛋白或者SEBF功能性同系物的表達(dá)或者生物學(xué)活性。53.權(quán)利要求52的方法，其中通過(guò)在所述植物中引入可表達(dá)的SEBF編碼序列來(lái)增加所述內(nèi)源性SEBF蛋白或者SEBF功能性同系物的表達(dá)或生物學(xué)活性。54.權(quán)利要求53的方法，其中所述的SEBF編碼序列處于可誘導(dǎo)的或者組成型的啟動(dòng)子的控制下。55.一種被遺傳修飾以使其與相應(yīng)的未被遺傳修飾的植物相比，具有對(duì)病原體增加的抗性或者耐受性的植物，其中與相應(yīng)的未被遺傳修飾的植物相比，所述遺傳修飾植物中的內(nèi)源性SEBF蛋白或者SEBF功能性同系物的表達(dá)或生物學(xué)活性被降低了。56.權(quán)利要求55的植物，其中所述的植物選自蔬菜、豆科植物、樹、和谷類。57.權(quán)利要求54的植物，其中所述的植物選自馬鈴薯、番茄、煙草、棉花、水稻、小麥、玉米、大麥、燕麥、油菜、大豆、豌豆、甘蔗、甜菜、草莓和香蕉。58.一種被遺傳修飾以使其與相應(yīng)的未被遺傳修飾的植物相比，具有對(duì)病原體降低的抗性或者耐受性的植物，其中與相應(yīng)的未被遺傳修飾的植物相比，所述遺傳修飾植物中的內(nèi)源性SEBF蛋白或者SEBF功能性同系物的表達(dá)或生物學(xué)活性被增加了。59.一種用于調(diào)節(jié)植物對(duì)病原體抗性或者耐受性的方法，所述的植物在基因的啟動(dòng)子區(qū)域具有序列BTGTCNC(SEQIDNO23)，所述的方法包含在所述植物中改變內(nèi)源性核DNA結(jié)合蛋白與所述序列BTGTCNC的結(jié)合。60.權(quán)利要求59的方法，其中所述的內(nèi)源性核DNA結(jié)合蛋白選自由與SEBF(SEQIDNO22)具有至少48％同一性或相似性的蛋白組成的組。61.權(quán)利要求60的方法，其中所述的核DNA結(jié)合蛋白由SEBF(SEQIDNO22)或其功能性同系物組成。62.權(quán)利要求59-61任何一項(xiàng)中的方法，其中所述的植物選自蔬菜、豆科植物、樹、和谷類。63.權(quán)利要求59-61任何一項(xiàng)中的方法，其中所述的植物選自馬鈴薯、番茄、煙草、棉花、水稻、小麥、玉米、大麥、燕麥、油菜、大豆、豌豆、甘蔗、甜菜、草莓和香蕉。64.一種用于增加植物對(duì)病原體抗性或者耐受性的方法，所述的植物在基因的啟動(dòng)子區(qū)域具有序列BTGTCNC(SEQIDNO23)，所述的方法包含在所述植物中降低或阻止內(nèi)源性核DNA結(jié)合蛋白與所述序列BTGTCNC的結(jié)合。65.權(quán)利要求64的方法，其包含突變或者刪除所述序列BTGTCNC。66.權(quán)利要求64或65的方法，其中所述序列BTGTCNC位于防御基因的啟動(dòng)子區(qū)域。67.權(quán)利要求66的方法，其中所述的防御基因選自表5中所列的基因，包括Pr-10、Pr-10(ypr10a)、Pr-10(ypr10b)、Pr-10a、Pr-10b、幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、PR-1、滲透蛋白(PR-5)、過(guò)氧化物酶、交替氧化酶和抗真菌蛋白。68.一種用于降低植物對(duì)病原體抗性或者耐受性的方法，該方法包含在所述植物中允許或者增加內(nèi)源性核DNA結(jié)合蛋白結(jié)合到包含序列BTGTCNC(SEQIDNO23)的基因啟動(dòng)子區(qū)域。69.權(quán)利要求66的方法，其中所述的啟動(dòng)子區(qū)域沒(méi)有所述序列BTGTCNC(SEQIDNO23)，而且其中將所述序列BTGTCNC有效地插入到所述的啟動(dòng)子區(qū)域。70.權(quán)利要求69的方法，其中所述的插入降低了所述基因的表達(dá)。71.一種用來(lái)在植物中調(diào)節(jié)由生長(zhǎng)素控制的基因的誘導(dǎo)的方法，其包含在所述的植物中調(diào)節(jié)內(nèi)源性SEBF蛋白或SEBF功能性同系物的表達(dá)或者生物學(xué)活性。72.一種用來(lái)在植物中增加生長(zhǎng)、生根和/或果實(shí)產(chǎn)生的方法，其包含在所述植物中降低內(nèi)源性SEBF蛋白或SEBF功能性同系物的表達(dá)或者生物學(xué)活性。73.一種被遺傳修飾以使其與相應(yīng)的未被遺傳修飾的植物相比，具有增加的生長(zhǎng)、生根和/或果實(shí)產(chǎn)生的植物，其中與相應(yīng)的未被遺傳修飾的植物相比，所述遺傳修飾植物中的內(nèi)源性SEBF蛋白或者SEBF功能性同系物的表達(dá)或生物學(xué)活性被增加了。74.一種用來(lái)增加植物對(duì)生長(zhǎng)素除草劑抗性的方法，其包含在所述的植物中降低內(nèi)源性SEBF蛋白或SEBF功能性同系物的表達(dá)或者生物學(xué)活性。75.一種被遺傳修飾以使其與相應(yīng)的未被遺傳修飾的植物相比，具有對(duì)生長(zhǎng)素除草劑增加的抗性的植物，其中與相應(yīng)的未被遺傳修飾的植物相比，所述遺傳修飾植物中的內(nèi)源性SEBF蛋白或者SEBF功能性同系物的表達(dá)或生物學(xué)活性被增加了。76.一種用來(lái)調(diào)節(jié)植物乙烯產(chǎn)生的方法，其包含在所述的植物中調(diào)節(jié)內(nèi)源性SEBF蛋白或SEBF功能性同系物的表達(dá)或者生物學(xué)活性。77.一種用來(lái)增加植物生產(chǎn)乙烯的方法，其包含在所述的植物中降低內(nèi)源性SEBF蛋白或SEBF功能性同系物的表達(dá)或者生物學(xué)活性。78.一種被遺傳修飾以使其與相應(yīng)的未被遺傳修飾的植物相比，具有增加的乙烯生產(chǎn)的植物，其中與相應(yīng)的未被遺傳修飾的植物相比，所述遺傳修飾植物中的內(nèi)源性SEBF蛋白或者SEBF功能性同系物的表達(dá)或生物學(xué)活性被降低了。79.一種用來(lái)降低植物生產(chǎn)乙烯的方法，其包含在所述的植物中增加內(nèi)源性SEBF蛋白或SEBF功能性同系物的表達(dá)或者生物學(xué)活性。80.一種被遺傳修飾以使其與相應(yīng)的未被遺傳修飾的植物相比，具有減少的乙烯生產(chǎn)的植物，其中與相應(yīng)的未被遺傳修飾的植物相比，所述遺傳修飾植物中的內(nèi)源性SEBF蛋白或者SEBF功能性同系物的表達(dá)或生物學(xué)活性被降低了。全文摘要本申請(qǐng)描述了植物基因調(diào)控元件及其應(yīng)用。更具體地，描述了用于調(diào)節(jié)植物應(yīng)答病原體、生長(zhǎng)素和乙烯的沉默元件。本發(fā)明還描述了特異結(jié)合于本發(fā)明的沉默元件的轉(zhuǎn)錄阻遏物。提供了一種新的、被稱為“SEBF”的轉(zhuǎn)錄阻遏物的核苷酸以及氨基酸序列。文檔編號(hào)C12N15/82GK1564870SQ02817739公開日2005年1月12日申請(qǐng)日期2002年6月27日優(yōu)先權(quán)日2001年7月10日發(fā)明者諾曼德·布里森,博伊爾·布里安申請(qǐng)人:蒙特利爾大學(xué)