專利名稱：控制苯丙醇生物合成通路的轉(zhuǎn)錄因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及控制苯丙醇(Phenylpropanoid)生物合成有關(guān)基因表達的技術(shù)。
隨著近年來植物分子生物學(xué)的進展，已經(jīng)能夠采用有義基因或反義基因來繁育具有有用特性，例如能抵抗疾病和蟲害或抵抗除草劑的植物。即，通過將表達所需特性有關(guān)的基因以有義方向或反義方向與允許在植物內(nèi)表達的啟動子連接成嵌合基因，然后將所得的嵌合基因作為載體引入植株，由此促進或抑制所需特性的表達。根據(jù)這樣的技術(shù)，已經(jīng)生產(chǎn)出了例如抗病蟲害的植物(其中以有義方向引入了來自蘇云金芽孢桿菌的殺蟲劑BT毒素基因)(D.A.Fischloff等人，生物技術(shù)(Bio/Technohogy),232:738-743(1987))和極耐保存的西紅柿(其中以反義方向引入了與茄類水果過熟有關(guān)的多聚半乳糖醛酸酶基因)(C.J.Smith等，自然(Nature)334,724-727(1988))。
使用這種技術(shù)時，在引入了有義基因的植株中(表達所需特性的基因以有義方向與啟動子融合)，所需特性的表達受到促進；相反，在引入了反義基因的植株中(表達所需特性的基因以反義方向與啟動子融合)，所需基因的表達受到抑制。引入反義基因抑制所需特性的表達是因為在植物細(xì)胞內(nèi)，以此反義基因為模板合成的RNA，與來自表達所需特性有關(guān)的植物本身基因的mRNA互補地結(jié)合，從而抑制了后續(xù)蛋白質(zhì)的合成。
但是，植物的許多基因形成一個多基因家族，而屬于此家族的基因表現(xiàn)出高度的核酸序列同源性。即使用反義方法來控制該族內(nèi)某一基因的表達，反義基因的RNA不可避免地與該家族中許多其它基因的mRNA隨機結(jié)合而控制其表達，使得不可能只控制所需單個基因的表達，因此引起了各種特征的抑制模式。所以，結(jié)果有時迥異于人們的期望。
而且，苯丙醇的生物合成通路是復(fù)雜的分支反應(yīng)系統(tǒng)，它只存在于植物中，而且它與細(xì)胞壁組份(例如木質(zhì)素、suberrin)、花色素、抗菌物質(zhì)等的生物合成有關(guān)。由生物合成通路得到的苯丙醇還可用作UV保護劑、殺蟲劑等。如果能夠準(zhǔn)確的促進或抑制有關(guān)苯丙醇生物合成的基因表達，就能夠控制該生物合成通路來產(chǎn)生木質(zhì)素含量低或含大量有用物質(zhì)的樹木。但是，這時，由于上述基因間的同源性問題，難以用反義方法來控制該基因的表達。例如，有報道稱，以反義方向引入在苯丙醇生物合成通路中起作用的了苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因或過氧化物酶(PRX)基因的轉(zhuǎn)化植物表現(xiàn)出多樣不同的控制結(jié)果(例如生長抑制)(M.M.Campbell和R.R.Sederoff,Plant Physiol.,110:3-13(1996))，還有，以反義方向引入了咖啡酸O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因的煙草中的木質(zhì)素含量變化不如預(yù)期的大(W.Ni等，Transgen.Res.,3:120-126(1994))。
考慮到上述問題，本發(fā)明目的之一是提供一種DNA和一種載體，它們能夠準(zhǔn)確的促進或抑制植物苯丙醇生物合成通路相關(guān)特定基因的表達。
為了克服上述問題，本發(fā)明的發(fā)明人進行了廣泛的研究。結(jié)果，發(fā)明人注意到了如下事實，即在苯丙醇生物合成通路相關(guān)特定基因(例如cynnamyl alcohol脫氫酶(CAD)基因、查爾酸合成酶(CHS)基因、4-香豆酸CoA連接酶(4CL)基因、PAL基因和PRX基因)的5’上游非翻譯區(qū)內(nèi)存在著控制這些基因表達的序列，而且這些基因之間的這些序列之間具有非常高的同源性。所以本發(fā)明人分離到了通過結(jié)合這些序列來促進基因轉(zhuǎn)錄的因子(后文稱為“轉(zhuǎn)錄因子”)，然后將編碼該因子的DNA以有義基因或反義基因引入植物，從而可準(zhǔn)確地促進或抑制上述基因的表達。這樣，就完成了本發(fā)明。
具體地說，本發(fā)明的上述以及其它目的的實現(xiàn)是通過分離和純化且具有SEQ ID NO:1核苷酸序列的DNA；分離和純化且在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與具有SEQ IDNO:1核苷酸序列的DNA雜交、并編碼控制苯丙醇生物合成通路轉(zhuǎn)錄因子的DNA；包含上述DNA的重組載體；還包含與上述DNA操作性融合的啟動子的重組載體；重組載體，其中上述DNA以有義或反義方向地與啟動子操作性融合；引入了上述DNA的植物細(xì)胞；由所述植物細(xì)胞再生而成的植物；產(chǎn)生所述植物細(xì)胞包括將上述DNA引入植物細(xì)胞的方法；來產(chǎn)生所述植物即包括由所述植物細(xì)胞再生植物的方法；分離和純化的上述DNA編碼的蛋白質(zhì)；以及分離和純化且編碼具有SEQ ID NO:2氨基酸序列蛋白質(zhì)的DNA。


圖1，圖示了實施例1所用效應(yīng)物的一部分，其中插入了Ntliml基因。
圖2圖示了實施例1所用報道基因的一部分，其中插入了含P-BOX序列的融合基因。
圖3顯示了各基因在煙草中的表達情況，所述煙草中以有義或反義方向引入了Ntliml基因。
以下將詳細(xì)說明本發(fā)明。
“分離和純化的”指，從天然產(chǎn)生這些生物分子的生物來源中純化分離得到的核酸或蛋白質(zhì)。
本發(fā)明使用的嚴(yán)謹(jǐn)條件是以6×SSC(0.9M NaCl,0.09M檸檬酸鈉)作為緩沖液，溫度為55℃。
苯丙醇生物合成通路廣泛存在于多種植物中，所以，許多植物都具有與此相關(guān)的基因(例如CAD基因)，而且具有一個控制所述基因表達的轉(zhuǎn)錄因子。所以，本發(fā)明的DNA可以通過常規(guī)方法從包括草本植物或木本植物的多種植物中分離得到(J.Samorook等，Molecullar Cloning，第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)，納入本文作參考)。本發(fā)明的DNA也可按照常規(guī)方法，例如磷酸三酯法(H.Hunkapiller等，Nature,310:105-111(1984)，納入本文作參考)來化學(xué)合成。
以上制得的DNA與可在植物中表達的啟動子(例如花椰菜花葉病病毒的35S啟動子(CaMV35S啟動子)、nopaline合成酶啟動子、核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亞基的啟動子)的下游區(qū)以有義方向或反義方向融合(J.Samorook等，Molecullar Cloning，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，納入本文作參考)。本發(fā)明的DNA與啟動子以有義方向融合是為了促進所需基因(本發(fā)明意欲促進或抑制其表達的基因)的表達，而當(dāng)它與啟動子以反義方向融合時則是為了抑制該基因的表達。促進所需基因表達的另一種方法是，將本發(fā)明DNA以有義方向與一啟動子融合，將所需基因與另一啟動子融合，將它們插入同一載體或分別插入不同載體后一起引入植物細(xì)胞。
與啟動子融合的DNA可以直接引入植物細(xì)胞，例如通過微注射法、電穿孔法、聚乙二醇法、融合法或高速沖擊穿透法(I.Portykus,Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.,42:205(1991)，納入本文作為參考)。或者，為了將該DNA插入用于將基因引入植物的質(zhì)粒后，通過能夠感染植物的病毒或細(xì)菌將該DNA間接引入植物細(xì)胞(I.Portykus,Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.,42:205(1991)，納入本文作為參考)。病毒的例子包括花椰菜花葉病病毒、芽孢病毒(gemini virus)、煙草花葉病病毒和可可花葉病病毒。細(xì)菌的例子包括根瘤土壤桿菌(后文稱為A.tumefaciens)和毛根土壤桿菌。采用A.tumefaciens通過土壤桿菌法將基因引入植物，可以使用諸如pBI101或pBI121(都由Clontech Laboratories,Inc.生產(chǎn))質(zhì)粒。
本發(fā)明中，所需基因的表達受到促進或抑制的植物可通過增殖或再生用上述方法引入了本發(fā)明DNA的植物細(xì)胞來得到。對于所述植物細(xì)胞的增殖或再生條件的合適選擇取決于植物的種類等因素(例如，就煙草而言，參見R.B.Horsch等，Science,227:1229-1231(1985)，納入本文作為參考)。
本發(fā)明DNA和插入了該DNA的載體可以促進或抑制CAD基因、CHS基因、4CL基因、PAL基因、FRX基因的表達。本發(fā)明的DNA和載體不僅可以控制上述基因的表達而且可以控制目前已知在其轉(zhuǎn)錄控制區(qū)具有上述共有序列的任何基因的表達。
對于可用本發(fā)明促進或抑制基因表達的植物沒有特殊的限定。主要說來，具有苯丙醇生物合成通路的植物適合于本發(fā)明。例如，除了煙草植物，還包括例如草本植物(例如稻米、arabidopsis、矮牽?；?和木本植物(例如白楊、桉樹、金合歡樹、雪松、松樹)。
在各種種類的植物中，從苯丙醇生物合成通路相關(guān)基因中發(fā)現(xiàn)了一段如表1所示的共有序列(共有序列欄內(nèi)的數(shù)字表示距離轉(zhuǎn)錄起始位點的距離(單位bp))。
表1
結(jié)合了上述基因內(nèi)該共有序列的轉(zhuǎn)錄因子彼此幾乎具有相同的結(jié)構(gòu)，而且，編碼這些轉(zhuǎn)錄因子的DNA被認(rèn)為具有一段相互同源的核苷酸序列。所以，本發(fā)明的DNA可以特異性的促進或抑制具有該共有序列的CAD基因、CHS基因、4CL基因、PAL基因和PRX基因中任何一個的表達，而不管轉(zhuǎn)錄因子所作用的植物種類或基因種類。
當(dāng)本發(fā)明DNA以有義方向引入植物時，在內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子之外，還通過引入DNA的表達合成了能與植物中上述共有序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。這對于引入基因的植物種類沒有限定。結(jié)果表現(xiàn)出為轉(zhuǎn)錄因子的表達水平總量的提高，而且，這些轉(zhuǎn)錄因子與共有序列以更高的頻率結(jié)合，使得啟動子區(qū)內(nèi)具有該序列的基因的表達得以促進。
另一方面，當(dāng)本發(fā)明DNA以反義方向引入植物時，以該基因作為模板合成的RNA與植物原有的轉(zhuǎn)錄因子基因所產(chǎn)生的mRNA互補結(jié)合，從而抑制了內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子的合成。結(jié)果，轉(zhuǎn)錄因子的表達水平的降低，使得難以引起共有序列的結(jié)合，所以，在啟動子區(qū)內(nèi)具有該序列的基因的表達受到抑制。
本發(fā)明還包括SEQ ID NO:1編碼的分離且純化的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列見SEQ ID NO:2。而且，本發(fā)明還包括編碼具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。這種核苷酸序列的具體例子見SEQ ID NO:1。利用SEQ ID NO:1和眾所周知的遺傳密碼子簡并性，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可以方便地推斷出編碼具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的蛋白質(zhì)的所有核苷酸序列。遺傳密碼可參見Stryer,Biochemistry第三版W.H.Freeman and Company(1988)，納入本文全部作為參考。
本發(fā)明使得特異性促進或抑制在5’非翻譯區(qū)具有特定共有序列的基因的表達成為可能。
換言之，本發(fā)明使得控制有關(guān)植物苯丙醇生物合成通路的基因(例如CAD基因、4CL基因、PAL基因和PRX基因)成為可能。
上述的CAD等是與苯丙醇生物合成通路尤其是木質(zhì)素生物合成通路相關(guān)的酶，所以，根據(jù)能夠控制上述基因表達的本發(fā)明，就有可能生產(chǎn)出有望成為紙張或紙漿原材料的樹木，例如生產(chǎn)木質(zhì)素含量低的樹木。
通過參考實施例，本發(fā)明將作更詳細(xì)地敘述。但應(yīng)理解這并不是對本發(fā)明的限制。
實施例1(1)煙草mRNA的分離與純化在從種子發(fā)芽后，將煙草在暖房中培養(yǎng)約1個月，取10g葉子在液氮中粉碎，用Chomcznski等(本文引作參考)的方法抽提其總RNA。
所得的總RNA溶解在含0.2％二乙基碳酸氫鹽的無菌水中，65℃保溫5分鐘，用等量的上樣緩沖液(20mM Tris-HCl,pH7.6,0.1M NaCl,1mM EDTA,0.1％SDS)稀釋2倍。將稀釋液上樣在已經(jīng)預(yù)先活化的寡聚dT纖維素柱上。用5至10倍柱體積的上樣緩沖液洗柱，然后用5倍柱體積的洗滌緩沖液(20mMTris-HCl,pH7.6,0.5M NaCl,1mM EDTA,0.1％SDS)洗柱。如下洗脫，即用2至3倍柱體積的洗脫緩沖液(10mM Tris-HCl,pH7.6,1mM EDTA,0.05％SDS)灌柱，得到10mg純化的mRNA。(2)制備cDNA文庫利用寡聚dT引物，按照本文參考引用的Gubler & Hoffman方法(Gubbler等，Gene,25:263-269(1983))，從(1)中獲得的mRNA合成cDNA。將所得的cDNA插入噬菌體DNAλgt11的EcoRⅠ位點，用λ噬菌體的包被蛋白(購自Statagene的“GeigapaekⅡ包裝提取物”)進行體外包裝，由此獲得一個重組的λ噬菌體。
另一方面，將大腸桿菌Y1090接種到10ml LBMM培養(yǎng)基(1％色氨酸，1％氯化鈉0.5％酵母提取物，10mM硫酸鎂和0.4％麥芽糖)中， 37℃搖動預(yù)培養(yǎng)12小時，預(yù)培后，離心分離收獲細(xì)胞，重懸在預(yù)先冷卻至4℃的10ml 10mM硫酸鎂中，使得它們?nèi)菀妆沪耸删w感染。將λ噬菌體與所得的大腸桿菌混合，然后將混合物37℃放置15分鐘，進行感染。(3)轉(zhuǎn)錄因子的篩選重組λ噬菌體感染的大腸桿菌Y-1090在含有1.5％瓊脂的LBMM培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)。約4小時后，在觀察到一個空斑產(chǎn)生后，將預(yù)先在10mM異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)中浸泡然后空氣干燥的尼龍濾膜(Hybond-N.由Amersham PharmaciaBiotech生產(chǎn))覆蓋在培養(yǎng)板上。37℃放置過夜后，從板上移取尼龍薄膜。將尼龍薄膜于4℃在含有5％脫脂奶的結(jié)合緩沖液(10mM Hepes,pH7.5,50mM NaCl,1mM EDTA)中浸泡1小時進行封閉，再浸泡結(jié)合緩沖液中，其中加入了用于結(jié)合印跡在尼龍薄膜濾膜上的轉(zhuǎn)錄因子的探針。探針與轉(zhuǎn)錄因子之間的結(jié)合反應(yīng)在4℃進行2小時。
作為用于結(jié)合反應(yīng)的探針，使用的是4CL基因或腰形豆的PAL基因或辣根的PRX基因5’上游非翻譯區(qū)內(nèi)存在的一段共有序列(P-BOX序列-CCACTTGAGTAC-)。即，合成一段具有P-BOX序列的雙鏈寡核苷酸，用地高辛配基(DIG)標(biāo)記后使用。
結(jié)合反應(yīng)后，將尼龍薄膜在結(jié)合緩沖液中室溫浸泡30分鐘進行3次洗滌，然后通過化學(xué)發(fā)光檢測法進行初次和二次篩選。結(jié)果，從1.0×106空斑中，測得一個陽性空斑，它產(chǎn)生了結(jié)合上述共有序列的蛋白質(zhì)。順便說一下，在該測試中，從合成雙鏈寡核苷酸的標(biāo)記到用化學(xué)發(fā)光法篩選主要是利用一市售試劑盒(Boehringer Mannheim GmbH生產(chǎn))按照非放射性同位素DIG核酸檢測法進行的。(4)測定編碼結(jié)合共有序列的蛋白質(zhì)的DNA的核苷酸序列根據(jù)常規(guī)方法從產(chǎn)生上述陽性空斑的噬菌體內(nèi)提取DNA。所得噬菌體DNA的插入部分(在(2)中，即插入了來自煙草的cDNA的部分)用含有λgt11的克隆位點的引物經(jīng)PCR擴增，然后進行瓊脂糖凝膠電泳，確定存在大約1kbp的DNA片段。將1kbp DNA片段在其末端磷?；?，然后將其插入質(zhì)粒pNoTA/T7(使用CLONING SYSTEM(5prime,3prime Inc.)的PRIMER PCR CLONERTM)。關(guān)于所得的重組質(zhì)粒DNA，使用DNA測序儀(“373S型DNA測序儀”，Perkin ElmerCorporation生產(chǎn))通過雙脫氧法來測定編碼所需蛋白的DNA的核苷酸序列。
該序列以SEQ ID NO:1表示，據(jù)推測含有約200個氨基酸。分子量約為25kDa。根據(jù)對該蛋白質(zhì)的同源性研究(SWISS-PROT Rel.34被用作數(shù)據(jù)庫)，該蛋白據(jù)推測由2個LIM結(jié)構(gòu)域，1個鋅指紋基序構(gòu)成。如果是這樣，該轉(zhuǎn)錄因子就是顯示LIM結(jié)構(gòu)域結(jié)合DNA的第一例。該蛋白被命名為“Ntliml”。(5)分離用于確認(rèn)DNA結(jié)合活性的Ntliml為了確認(rèn)如此篩選到的蛋白質(zhì)，即Ntliml有DNA結(jié)合能力，用大腸桿菌生產(chǎn)了必需數(shù)量的該蛋白質(zhì)。
將具有SEQ ID NO:1核苷酸序列的DNA片段(Ntliml基因)與Ntliml翻譯起始密碼子區(qū)或翻譯終止密碼子區(qū)融合，并用各含有限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ位點的兩個引物進行PCR擴增。用限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ消化所得的DNA片段后，將其插入表達質(zhì)粒pGEX-2TX(Pharmacia Biotech Ltd.生產(chǎn))的BamHⅠ位點，研究其連接位置的核苷酸序列，由此可以確認(rèn)插入DNA的方向和flame的準(zhǔn)確性，當(dāng)利用上述載體產(chǎn)生Ntliml時，在tac啟動子調(diào)控下所獲得的Ntliml是GST融合蛋白。
將如此制備的表達質(zhì)載體引入大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞(Toyobo Co.,Ltd.生產(chǎn))，所得的大腸桿菌培養(yǎng)在含100mg/l抗生素氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基(1％色氨酸、0.5％氯化鈉和0.5％酵母提取物)中，因此可挑選出具有Ntliml基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。將所得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞接種在1ml LB培養(yǎng)基中，37℃、200rpm預(yù)培過夜。然后在30ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(氨芐青霉素的濃度100mg/l)中37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)。當(dāng)OD600達到約1.0時，在培養(yǎng)基中加入IPTG使得其最終濃度達到2mM，然后繼續(xù)在37℃、100rpm振蕩培養(yǎng)。5小時后離心分離回收細(xì)胞，細(xì)胞懸浮在PPS緩沖液(140mM NaCl,2.7mM KCl.10.1mM Na2HPO4.1.8mMKH2PO4.PH7.3)中，將該懸液離心分離回收細(xì)胞。
由此獲得的細(xì)胞重懸在2ml PBS緩沖液中。將懸浮液經(jīng)超聲波處理來粉碎，離心(15,000g,15分鐘)分離出上清液(可溶性組份)。對可溶性組份進行SDS-聚丙烯酰胺電泳，以確認(rèn)所需蛋白即Ntliml-GST融合蛋白的表達。然后對可溶組分進行以下操作。
首先，在這組分中加入50％谷胱甘肽瓊脂糖4B漿液(Pharmacia Biotech Ltd.生產(chǎn))10μl，然后攪拌。然后，混合物室溫放置30分鐘，讓Ntliml-GST融合蛋白吸附到谷胱甘肽瓊脂糖4B上。離心回收吸附有所需蛋白質(zhì)的谷胱甘肽瓊脂糖4B，用PBS緩沖液洗滌3次，通過以下步驟，只有Ntliml從中被洗脫并分離。即如下進行Ntliml的洗脫和分離在回收并洗滌過的谷胱甘肽瓊脂糖4B中，加入19μl PBS緩沖液和1μl凝血酶蛋白酶(1切割單位在PBS中，可在16小時內(nèi)90％消化100μg GST融合蛋白的酶量)將其懸浮，讓所得的懸浮液室溫放置2小時，將反應(yīng)混合物離心分離(500g,5分鐘)出上清液，然后對上清液進行SDS-聚丙烯酰胺電泳。(6)確認(rèn)Ntliml的DNA結(jié)合能力采用電遷移率轉(zhuǎn)移試驗來確認(rèn)所分離的Ntliml的DNA結(jié)合能力。
將2μg純化的Ntliml溶解在10μl結(jié)合緩沖液(10mM Hepes,pH7.5,50mMNaCl,lmM EDTA)中。在所得的溶液中，加入上述(3)中所用含有P-BOX區(qū)的DIG-標(biāo)記的雙鏈合成寡核苷酸10nmol,2μg鮭精DNA作為探針，和載體DNA，所得的混合物室溫放置20分鐘。
用含1×TAE(6.7mM Tris-HCl,pH7.9,1mM EDTA,3.3mM乙酸鈉)的5％聚丙烯酰胺凝膠，在100V電壓下，對此反應(yīng)混合物進行電泳，直至游離探針走出凝膠前終止電泳。將電泳模式從凝膠印跡到一張尼龍濾膜上，進行類似于(3)的化學(xué)發(fā)光檢測。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)有一條帶遷移到了不同于Ntliml原先所示的電泳帶位置，由此證實存在DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。另一方面，當(dāng)1μmol非標(biāo)記探針(與用來檢測遷移條帶所用的探針完全相同，但是沒有用DIG標(biāo)記)加入上述反應(yīng)混合物中時，然后在同樣條件下進行電泳，遷移的條帶消失。所以，確定了Ntliml蛋白與P-BOX的結(jié)合是特異性的。(7)Ntliml調(diào)節(jié)表達活性的研究為了使Ntliml基因在植物內(nèi)表達，將含有Ntliml基因的DNA片段以有義鏈方向插入質(zhì)粒pBI221(Clontech Laboratories,Inc.生產(chǎn))的β葡糖醛酸酶基因所在位置，所得的質(zhì)粒被用作效應(yīng)物。圖1顯示插入了Ntliml基因的此效應(yīng)物的一部分的圖示。另一方面，將三份重復(fù)P-BOX序列在CaMV35s啟動子的-90bp處與EcoRV位點連接，并將3份重復(fù)G-BOX序列(-CCACGTGG-))(和P-BOX序列相似，通常天然存在于CAD基因等的5’非翻譯區(qū))與P-BOX序列融合，使得G-BOX序列位于上游。將所得的融合基因插入pUC19，以該質(zhì)粒作為報道質(zhì)粒。在此例中，為了更簡便地顯示Ntliml基因的功能，其表達易被檢測到的GUS基因被置于受Ntliml基因(而不是與苯丙醇生物合成相關(guān)的CAD等基因)作用的P-BOX序列的下游。此時，G-BOX序列被假定起著增強子的作用。圖2顯示插入了融合基因的報道基因的一部分的示意圖。
順便說一下，上述制備的兩種重組質(zhì)粒之一一旦引入大腸桿菌JM109的感受態(tài)細(xì)胞，即可通過培養(yǎng)大腸桿菌來擴增。最后，得到約1mg的各種質(zhì)粒DNA。大腸桿菌的培養(yǎng)是在37℃,LB培養(yǎng)基上，以200rpm的振蕩速度進行的。用常規(guī)方法從大腸桿菌中分離并純化質(zhì)粒DNA。
根據(jù)納入本文用作參考的Okada等(K.Okada等，Plant Cell Physiol.,27:619(1986))的方法，從煙草培養(yǎng)細(xì)胞BY-2制備了原生質(zhì)體。為了用電穿孔法將10μg報道質(zhì)?；驁蟮蕾|(zhì)粒和效應(yīng)物各10μg引入原生質(zhì)體，用一臺基因引入儀，Gene，對懸浮在1ml電穿孔緩沖液(5mM MES,30mM KCl,0.3M甘露醇，pH5.8)中的3×106個原生質(zhì)體施加電脈沖(200V,250μF)。使用的是Bio-RadLaboratories生產(chǎn)的脈沖儀。該原生質(zhì)體接受基因引入處理后，用0.4M甘露醇洗滌，并培養(yǎng)在原生質(zhì)體培養(yǎng)基(Murashige和Skoog培養(yǎng)基(Nippon Shinyaku Co.,Ltd.)，即在混合鹽中加入0.4M甘露醇制得)上25℃24小時，然后將其均質(zhì)化，并離心分離出可溶組份。用納入本文作參考用以的Jefferson等的方法(R.Jefferson等，EMBO J.,6:3901-3907(1997))測定GUS的活性。結(jié)果，在同時引入了報道質(zhì)粒和效應(yīng)物的原生質(zhì)體中，檢測到GUS基因的表達比只引入了報道質(zhì)粒的原生質(zhì)體高約3倍。這表明，由于來自效應(yīng)物Ntliml基因的Ntliml蛋白質(zhì)的作用，在報道質(zhì)粒中，連接在P-BOX序列下游區(qū)的GUS基因的表達被大大加強。換言之，Ntliml是一種轉(zhuǎn)錄因子，它結(jié)合P-BOX序列并促進受該P-BOX序列驅(qū)動的基因的表達。在植物內(nèi)以有義方向引入Ntliml基因，可促進受Ntliml調(diào)控的基因的表達。
實施例2(1)在煙草內(nèi)引入有義或反義的Ntliml基因按有義或反義方向，將Ntliml基因引入pBI121質(zhì)粒(Clontech Laboratories,Inc.)中，引入位置與實施例1的(7)制備效應(yīng)物時的洗脫。用限制性核酸內(nèi)切酶消化試驗測定了所得重組質(zhì)粒中插入Ntliml基因的方向后，用電穿孔法將該質(zhì)粒引入根瘤土壤桿菌EHA105(在10％甘油中，電脈沖為2500V,25μF)中。將根瘤土壤桿菌培養(yǎng)在含100mg/l卡那霉素的LB培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2天，選擇性地只獲得了引入了重組質(zhì)粒的那些桿菌。
將煙草(Nicotiana tabacum L cv.SR-1)用作引入Ntliml基因的植物。即，將一片無菌條件下培育的秧苗的葉子(約發(fā)芽后4周)切割成5mm的方形葉片，在引入了重組質(zhì)粒的根瘤土壤桿菌的培養(yǎng)液中浸1至3分鐘，令葉片的表皮向下以被根瘤土壤桿菌感染，從而將Ntliml基因引入葉片。用無菌紙巾之類擦去培養(yǎng)液后，將被感染的葉片放在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Murashige和Skoog基礎(chǔ)培養(yǎng)基，3％蔗糖，0.25％gellan gum,1mg/l乙酸亞萘酯，0.1mg/l芐基腺嘌呤)上，在25℃持續(xù)光照下培養(yǎng)3天。然后將培養(yǎng)后的葉片轉(zhuǎn)移到芽(shoot)形成培養(yǎng)基(Murashige和Skoog基礎(chǔ)培養(yǎng)基，3％蔗糖，0.25％gellan gum,0.1mg/l乙酸亞萘酯，1mg/l芐基腺嘌呤，100mg/l卡那霉素，500mg/l羧芐西林)中，在相同溫度、相同光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)，以分化出芽來，在芽形成培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周后，切下分化出的芽，移植到Murashige和Skoog基礎(chǔ)培養(yǎng)基(加入3％蔗糖，0.8％瓊脂或0.25％gellan gum)中，含有100mg/l卡那霉素和500mg/l羧芐西林，在相同溫度和條件下培養(yǎng)約4周以誘導(dǎo)出根。使用Metromix350(Scotts-Sierrea Horticulture Company生產(chǎn))作為培養(yǎng)土壤，將生根后的植株種植在25℃的暖房中。(2)對Ntliml基因轉(zhuǎn)化煙草的分析(2-1)PCR分析按照常規(guī)方法從(1)中培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化煙草葉中提取基因組DNA，進行PCR，用對應(yīng)于Ntliml基因中核苷酸序列的寡核苷酸作為引物。結(jié)果，從各個PCR樣品中都測得了Ntliml基因的擴增，而且確認(rèn)，用于分析的25個轉(zhuǎn)化體都具有有義或反義的Ntliml基因(其中13個個體是有義轉(zhuǎn)化體，12個是反義轉(zhuǎn)化體子)。(2-1)Northern雜交分析從已經(jīng)確認(rèn)存在Ntliml基因(2-1)的轉(zhuǎn)化煙草中挑選出兩株有義轉(zhuǎn)化體(Ntliml基因按有義方向引入)和兩株反義轉(zhuǎn)化體(Ntliml基因按反義方向引入)。從它們的莖中用酸胍苯酚氯仿法提取總RNA。作為對照，同時還從非轉(zhuǎn)化煙草中提取了總RNA。
使用含終濃度為0.66M的甲醛的1.2％瓊脂糖凝膠和1×MOPS緩沖液(20mM MOPS/pH7.0,5mM乙酸鈉，0.5M EDTA)，取10微克提取的總RNA進行電泳2小時60V。之后，將電泳模式從凝膠上印跡到一張尼龍濾膜上，對所得的尼龍濾膜進行Northern雜交。
按照實施例1(3)所述，用非放射性同位素DIG核酸檢測法進行Northern雜交，除了Ntliml基因之外使用了PAL基因(820bp)和4CL基因(610bp)作為探針，后兩者是通過PCR擴增煙草基因組DNA獲得的。圖3顯示了Northern雜交后上述尼龍濾膜的化學(xué)發(fā)光情況。
根據(jù)圖3發(fā)現(xiàn)，與非轉(zhuǎn)化的C(泳道5)相比，Ntliml基因的表達在有義轉(zhuǎn)化體OP1和OP2(泳道1和2)中較強，而在反義轉(zhuǎn)化體UP1和UP2(泳道3和4)中較弱。就有義轉(zhuǎn)化體OP1和OP2而言，PAL基因和4CL基因中所見的表達都比在非轉(zhuǎn)化體C中的強，這種傾向性在OP2中特別突出。另一方面，在反義轉(zhuǎn)化體UP2中，PAL基因和4CL基因各自的表達都幾乎被完全抑制。在反義轉(zhuǎn)化體UP1中，PAL基因和4CL基因各自的表達受抑制的程度沒有這么高，可能是因為該轉(zhuǎn)化體中反義基因的誘導(dǎo)量(在PAL基因和4CL基因的表達幾乎被完全抑制的UP2轉(zhuǎn)化子中，可能有許多Ntliml的反義基因拷貝被引入了植物的基因組內(nèi))，或者反義基因在植物基因組中的位置作用有很大影響。
根據(jù)上述結(jié)果，顯而易見的是，Ntliml基因，即本發(fā)明DNA，能夠促進或抑制PAL基因或4CL基因的表達。此外，從本發(fā)明DNA合成的轉(zhuǎn)錄因子通過結(jié)合所述基因的P-BOX或結(jié)合與P-BOX類似的5’非翻譯區(qū)共有序列而發(fā)揮功能，不僅對迄今上述PAL基因或4CL基因，而且對具有該共有序列的任一基因都能夠表現(xiàn)出促進作用。
參照具體的實施例對本發(fā)明進行了詳細(xì)的說明，然而對本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來說顯而易見的是，所進行各自種改變和修飾都在本發(fā)明的宗旨和范圍內(nèi)。
本文將下面的優(yōu)先權(quán)申請全部納入作為參考1998年3月31日的日本專利申請NO.Hei 10-125171。
序列表SEQ ID NO:1序列長度988序列類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型mRNA的cDNA最初來源生物體煙草組織類型葉特征名稱/代碼CDS位置100..702鑒定方法E名稱/代碼結(jié)構(gòu)域位置127..282鑒定方法S其它信息LIM結(jié)構(gòu)域是一種鋅指紋基序名稱/代碼結(jié)構(gòu)域位置1427..582鑒定方法S其它信息LIM結(jié)構(gòu)域是一種鋅指紋基序序列GAATTCGCGG CCGTTCCAAA AACCAAGTGC TAACACAAAG AAAGGGAAAG AGCCACAAAG 60ACCATTTTTG TTTTCTGTAA AACTTGCTCG TATATAGCC ATG GCT TTT GCA GGA 114ACC ACA CAG AAA TGC ATG GCA TGT GAC AAG ACT GTC TAT CTG GTT GAC 162AAA TTA ACT GCA GAT AAC AGA ATC TAT CAC AAA GCT TGT TTC AGA TGC 210CAT CAC TGC AAG GGC ACT GTC AAG CTT GGC AAC TAC AAT TCC TTT GAG 258GGA GTT CTA TAC TGT AGA CCA CAC TTT GAT CAG CTC TTC AAA CAA ACT 306GGC AGT TTG GAT AAA AGC TTT GAA GGT ACA CCA AAA ATT GTG AAG CCA 354CAG AAA CCC ATT GAC AGT GAG AAA CCA CAG GTA GCC AAA GTG ACA AGC 402ATG TTT GGT GGA ACA AGA GAG AAA TGT TTT GGC TGC AAG AAA ACT GTC 450TAC CCA ACA GAA AAG GTA TCA GCC AAT GGC ACG CCA TAC CAT AAG AGC 498TGC TTC CAA TGC AGC CAC GGA GGC TGT GTA ATA AGC CCT TCC AAC TAT 546ACC GCA CAT GAG GGG CGC TTA TAT TGT AAA CAT CAC CAT ATT CAA CTT594ATC AAG GAG AAG GGC AAC TTA AGC AAG CTT GAG GGT GAC CAT GAA ATG642AAT TCC ACG ACA ACA ACA GAA GTT ACT GCA GAG TCA TAC ACA GCC GAC690CAA GTT GAT TGA TCCTTATCTT TACCGCGATC ATGTATTACG TATCTGCTGT742TAGTTGTAAG AATCGAAGGC GTTCAGCAGC TTCCATGAAT GCACTTGCCT TGCCCCAGCG 802TATGTTTTAC TCTAATCTAG CTTCAATTAA TTTGATGTTG AACTATATAT TGTCTAGCTT 862TTGTGTGTAG ATTTTTGACC TTTGTTTGCT TGTGCTTCAC TTGTATTATG TGAATGTTGA 922ATGAGATTGA ATATAACATG GTTTTGCTGT CCCAGTGCAT GCAAATCTTT GAGCGGCCGC 982GAATTC 988SEQ ID NO:2序列長度200序列類型氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型蛋白序列Met Ala Phe Ala Gly Thr Thr Gln Lys Cys Met Ala Cys Asp Lys Thr 161 5 10 15Val Tyr Leu Val Asp Lys Leu Thr Ala Asp Asn Arg Ile Tyr His Lys 3220 25 30Ala Cys Phe Arg Cys His His Cys Lys Gly Thr Val Lys Leu Gly ASh 4835 40 45Tyr Asn Ser Phe Glu Gly Val Leu Tyr Cys Arg Pro His Phe Asp Gln 6450 55 60Leu Phe Lys Gln Thr Gly Ser Leu Asp Lys Ser Phe Glu Gly Thr Pro 8065 70 75 80Lys Ile Val Lys Pro Gln Lys Pro Ile Asp Ser Glu Lys Pro Gln Val 9685 90 95Ala Lys Val Thr Ser Met Phe Gly Gly Thr Arg Glu Lys Cys Phe Gly 112100 105 110Cys Lys Lys Thr Val Tyr Pro Thr Glu Lys Val Ser Ala Asn Gly Thr 128115 120 125Pro Tyr His Lys Ser Cys Phe Gln Cys Ser His Gly Gly Cys Val Ile 144130 135 140Ser Pro Ser Asn Tyr Thr Ala His Glu Gly Arg Leu Tyr Cys Lys His 160145 150 155 160His His Ile Gln Leu Ile Lys Glu Lys Gly Ash Leu Ser Lys Leu Glu 176165 170 175Gly Asp His Glu Met Asn Ser Thr Thr Thr Thr Glu Val Thr Ala Glu 192180 185 190Ser Tyr Thr Ala Asp Gln Val Asp 200195 200
權(quán)利要求
1．一種分離和純化的DNA，它具有的核苷酸序列包含SEQ ID NO:1.
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA，具有核苷酸序列SEQ ID NO:1。
3．一種分離和純化的DNA，它與核苷酸序列包含SEQ ID NO:1的DNA在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并且編碼控制苯丙醇生物合成通路的轉(zhuǎn)錄因子。
4．根據(jù)權(quán)利要求3所述的DNA，其中的嚴(yán)謹(jǐn)條件包括在55℃，在6×SSC中雜交。
5．一種重組載體，它包含權(quán)利要求1至4中任一項所述的DNA。
6．根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，它還包含與所述DNA操作性融合的啟動子。
7．根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組載體，其中DNA按有義方向與啟動子操作性連接。
8．根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組載體，其中DNA按反義方向與啟動子操作性連接。
9．一種植物細(xì)胞，其中引入了權(quán)利要求1至4中任一項所述的DNA。
10．一種植物，它由權(quán)利要求9所述的植物細(xì)胞再生而成。
11．一種分離和純化的蛋白質(zhì)，它由權(quán)利要求1至4中任一項所述的DNA編碼。
12．一種分離和純化的DNA，它編碼具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的蛋白質(zhì)。
全文摘要
一種分離且純化的、核苷酸序列包含SEQIDNO:1的DNA;一種分離且純化的DNA,與核苷酸序列包含SEQIDNO:1的DNA在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交,且編碼控制苯丙醇生物合成通路的轉(zhuǎn)錄因子;包含該DNA,按有義或反義方向與之操作性融合的啟動子的重組載體;引入了該DNA的植物細(xì)胞;由該植物細(xì)胞再生的植物;分離且純化的由該DNA編碼的蛋白質(zhì);和分離且純化的DNA,編碼氨基酸序列為SEQIDNO:2的蛋白質(zhì)。
文檔編號C12N15/29GK1232086SQ9910490
公開日1999年10月20日 申請日期1999年3月31日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月31日
發(fā)明者河岡明義, 海老沼宏安 申請人:日本制紙株式會社