專利名稱：一種與植物育性相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種與植物育性相關(guān)的蛋白質(zhì)及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物育性是與作物產(chǎn)量直接相關(guān)的因子之一。育性決定遺傳基礎(chǔ)的研究，對糧食安全具有重要意義。轉(zhuǎn)基因水稻植株的成功和水稻基因組測序工作的完成為研究發(fā)現(xiàn)新的水稻育性相關(guān)基因提供了有利條件。通過RNAi等分子生物學(xué)手段，對水稻中一些參與育性決定的基因進(jìn)行功能研究，對提高水稻產(chǎn)量具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種與植物育性相關(guān)的蛋白質(zhì)及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的與植物育性相關(guān)的蛋白質(zhì)，來源于水稻，名稱為0sY14，是如下 (a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物育性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。序列表中的序列1由135個氨基酸殘基組成。編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述基因具體可為如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列2自5’端第1至408位核苷酸所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼植物育性相關(guān)蛋白的DNA分子；3)與1)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼植物育性相關(guān)蛋白的DNA 分子。所述嚴(yán)格條件可為在0. IXSSPE(或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。序列表中的序列2由408個核苷酸組成。含有上述基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或重組病毒，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍?？捎矛F(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA 片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo) (Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用所述基因構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動子或組成型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動子、 玉米的泛素啟動子⑴biquitin)，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外，
3使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子， 這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的， 可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。本發(fā)明所提供的應(yīng)用是利用上述蛋白質(zhì)的編碼基因培育轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是降低目的植物中所述蛋白質(zhì)的編碼基因的表達(dá)，得到育性低于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。所述育性降低具體可體現(xiàn)為結(jié)實率降低。所述降低目的植物中所述蛋白質(zhì)的編碼基因的表達(dá)是通過將如下式I所示的DNA 片段導(dǎo)入目的植物中實現(xiàn)的SEQ 正向-X-SEQ 反向(I)所述SEQ丨自是序列表中序列2中包括第87-408位核苷酸的任何一段；所述SEQfi^1的序列與所述SEQmW序列反向互補(bǔ)；所述X是所述SEQ1^1與所述SEQfi^1之間的間隔序列，在序列上，所述X與所述SEQ
^向及所述SEQfi^1均不互補(bǔ)。所述SEQ1^1的核苷酸序列具體可為序列2中第87-408位核苷酸。所述式I所示的DNA片段具體可為用BamHI和&icl從重組載體pTCK303_0sY14i 中切下的小片段。其核苷酸序列可為序列表中的序列3。所述降低目的植物中所述蛋白質(zhì)的編碼基因的表達(dá)量可通過將如下重組表達(dá)載體pTCK303-0sY14i導(dǎo)入目的植物中實現(xiàn)的將序列2中第87-408所示DNA沿著從SpeI至 SacI的方向插在載體PTCK303的SpeI和McI位點間，得到的重組載體記作中間重組載體； 將序列2中第87-408位核苷酸的反向互補(bǔ)序列所示的DNA沿著從KpnI至BamHI的方向插在所述中間重組載體的KpnI和BamHI位點間，得到的重組載體pTCK303_0sY14i。所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物具體可為水稻。實驗證明，降低本發(fā)明的0sY14的表達(dá)量，可以降低植物的育性，說明0sY14是與植物育性相關(guān)的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所得到的育性降低的轉(zhuǎn)基因植物，可作為篩選可提高植物育性基因的模型，理解育性決定的分子機(jī)理。


圖1為0sY14的PCR電泳圖。左側(cè)泳道為Marker DL2000，右側(cè)泳道為0sY14基因的PCR產(chǎn)物圖 2 為 OsYH-RNAi 的 PCR 電泳圖。左側(cè)泳道為Marker DL2000，右側(cè)泳道為0sY14_RNAi的PCR產(chǎn)物
圖3為pTCK303_0sY14i相關(guān)片段的結(jié)構(gòu)示意圖。圖4為野生型與轉(zhuǎn)基因植株結(jié)實率的比較。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例l、0sY14的制備用如下引物從水稻中擴(kuò)增0sY14的編碼基因0sY14F(ATGGCTGCGGTGACCAACG)和 OsY 14R(CTCAGTATCTTCTCCTCGGTG)。取水稻葉片提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA并以其為模板進(jìn)行擴(kuò)增，得到長度約為400bp的DNA片段(圖1)。擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pGEM-T Easy載體上， 得到重組載體pGEM-T-0sY14。經(jīng)克隆測序，獲得408bp的cDNA片段(其核苷酸序列如序列2)，它含有完整的開放閱讀框，共編碼含有136個氨基酸的蛋白質(zhì)(其氨基酸序列如序列 1)，將其命名為0sY14。實施例2、培育育性降低的轉(zhuǎn)基因水稻1、OsYH-RNAi 載體構(gòu)建由于基因組掃描，發(fā)現(xiàn)0sY14為單拷貝基因，因此根據(jù)已獲得的0sY14的cDNA片段設(shè)計特異引物，構(gòu)建RNAi載體以達(dá)到特異性敲除0sY14的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。首先用如下引物從 pGEM-T-0sY14 中 PCR 擴(kuò)增 0sY14_RNAi :0sY14RNAiF(TAGGTACCACTAGTTGAAGGATGGATTGTGCTAG)和 0sY14RNAiR(ATGGATCCGAGCTCAGTATCTTCTCCTCGGTG)。PCR 擴(kuò)增得到 322bp 的片段(圖 2)。 回收該長度為322bp的片段，然后通過兩步酶切和鏈接，即一半回收產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶 SpeI和SacI酶切后，連到用限制性內(nèi)切酶SpeI和SacI酶切回收的pTCK303載體(Zhen Wang,Changbin Chen,Yunyuan Xu,Rongxi Jiang,Ye Han,Zhihong Xu,Kang Chong (2004)A practical vector for efficient knockdownof gene expression in rice (Oryza sativa L.). Plant Molecular BiologyReporter 22 :409-417 ；公眾可從中國科學(xué)院植物研究所獲得)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，克隆、測序并提取質(zhì)粒，獲得中間重組載體；再用外酶KpnI和 BamHI分別對另一半回收產(chǎn)物和中間重組載體進(jìn)行雙酶切，分別純化后進(jìn)行連接反應(yīng)，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 α克隆測序，得到pTCK303-0sY14i (圖3)。pTCK303_0sY14i含有位于 Rice Intron 一側(cè)的序列2中第87-408位核苷酸所示的OsYH-RNAi及位于Ricehtron另一側(cè)的OsYH-RNAi的反向互補(bǔ)片段。pTCK303-0sY14i含有序列3所示的DNA片段。將pTCK303_0sY14i通過根癌農(nóng)桿菌EHA105的介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻品種中花10號。具體的方法如下取水稻品種中花10號(以下簡稱野生型水稻，以WT表示)種子，70%乙醇水溶液消毒1分鐘，無菌水沖洗2-3遍；再用0. 的升汞溶液振蕩消毒10分鐘以上，無菌水沖洗4-5遍，然后在無菌條件下分離出幼胚，接在NB培養(yǎng)基(N6鹽分和維生素，500mg/ L谷氨酰胺，500mg/L脯氨酸，300mg/L水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2mg/L2，4-D，7g/L瓊脂， PH 5.8)上，于25°C暗培養(yǎng)2周，得到水稻W(wǎng)T幼胚的愈傷組織。將愈傷組織切成小塊，在 ΝΒα5(ΝΒ培養(yǎng)基，0.5mg/L 2，4_D)培養(yǎng)基上培養(yǎng)2_3周。農(nóng)桿菌經(jīng)劃線活化后，挑取單菌落，搖至對數(shù)期，再按1 100的比例搖菌至0D600 = 0. 5，6000rpm離心10分鐘，收集菌體重懸于AAM-AS (AAM鹽分和氨基酸，500mg/L水解酪蛋白，0. 5mg/L 2,4-D, 100uM/L乙酰丁香酮，pH 5. 2)培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)好的成熟胚愈傷組織剪成小塊收集到一個培養(yǎng)皿中，倒于農(nóng)桿菌的AAM-AS中侵染20分鐘，倒出菌液，用濾紙吸干，然后倒入NB2C(NB培養(yǎng)基，10g/L葡萄糖，lOOuM/L乙酰丁香酮，pH 5. 2)中，25°共培養(yǎng)3天。共培養(yǎng)后的愈傷組織用頭孢霉素300mg/L的無菌水中沖洗3-4遍，濾紙吸干，轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基I (ΝΒα 5培養(yǎng)基，25mg/L潮霉素，600mg/L頭孢霉素)上，25°共培養(yǎng)2周。后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基II (ΝΒα5培養(yǎng)基，50mg/L潮霉素，300mg/L頭孢霉素)上，繼續(xù)篩選2代，2周/代。將篩選得到的抗性愈傷組織放入帶有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中干燥1天，接種到分化培養(yǎng)基RE1 (MS培養(yǎng)基，lmg/L 6BA, 0. 5mg/L激動素，0. 2mg/L玉米素，0. 25mg/LNAA，50mg/L潮霉素)上暗培養(yǎng)1周，再轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)1周。 然后轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基RE2 (MS培養(yǎng)基，lmg/L 6BA，0. 5mg/L激動素，0. 2mg/L玉米素，0. 5mg/ LNAA，50mg/L潮霉素)上光下培養(yǎng)2周。待小苗張到2cm左右高時將小苗轉(zhuǎn)移入生根培養(yǎng)基 (1/2MS培養(yǎng)基，0. 2mg/LNAA)。待小苗長至IOcm左右時打開容器封口膜，煉苗2_3天，將陽性小苗移至人工氣候室栽培，共得到了 7株陽性TO代轉(zhuǎn)基因水稻，分別命名為Ha、3-lc、 4-2a、5-la、6-lb、7-8b和8_la。同時設(shè)轉(zhuǎn)入pTCK303的稻品種中花10號作為對照。根據(jù)載體上帶有的潮霉素序列設(shè)計引物對所有組培苗進(jìn)行了基因組DNA的 PCR檢測，結(jié)果顯示它們?nèi)繛殛栃缘霓D(zhuǎn)基因植株。進(jìn)一步通過Real-Time RT-PCR分析(所用引物對的序列為 YHRNAiExF :5，-GAAGGATGGATTGTGCTAGTC-3，；YHRNAiExR 5’ -GCATTCTAAAGCACCATCATCAC-3’)，精確地定量了 0sY14在這些轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)情況，結(jié)果表明在不同的RNAi株系中0sY14基因的表達(dá)量下降的幅度不同，在60% -90% 之間變動(表1)。轉(zhuǎn)基因植物與其受體水稻在株型和營養(yǎng)生長等方面沒有明顯的差異， 但是在生殖生長發(fā)育中卻有不同，主要表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因植株的結(jié)實率普遍下降，其幅度為 20% -70% (圖4)，具體結(jié)實率結(jié)果如表2。其中，結(jié)實率按照如下方法測定選取每一轉(zhuǎn)基因植株上三個小穗，分別統(tǒng)計每一小穗上的飽滿和干癟籽粒數(shù)目并計算飽滿籽粒的比率， 結(jié)實率=飽滿籽粒數(shù)/總籽粒數(shù)，每株三個小穗結(jié)實率的平均數(shù)代表該株結(jié)實率，并以轉(zhuǎn)入pTCK303的稻品種中花10號結(jié)實率作為對照。表1轉(zhuǎn)基因水稻實時定量表達(dá)檢測
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物育性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因為如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列2自5’端第1至408位核苷酸所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼植物育性相關(guān)蛋白的DNA分子；3)與1)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼植物育性相關(guān)蛋白的DNA分子；含有所述基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或重組病毒。
4.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是降低目的植物中權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的編碼基因的表達(dá)，得到育性低于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述育性降低體現(xiàn)為結(jié)實率降低。
6.如權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述降低目的植物中權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的編碼基因的表達(dá)是通過將如下式I所示的DNA片段導(dǎo)入目的植物中實現(xiàn)的SEQ正向反向(I)所述SEQI 是序列表中序列2中包括第87-408位核苷酸段；所述SEQ的序列與所述SEQmW序列反向互補(bǔ)；所述X是所述SEQ1^1與所述SEQfi^1之間的間隔序列，在序列上，所述X與所述SEQ1向及所述SEQfi^1均不互補(bǔ)。
7.如權(quán)利要求4或5或6所述的方法，其特征在于所述SEQ1^1的核苷酸序列是序列 2中第87-408位核苷酸。
8.如權(quán)利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于所述式I所示的DNA片段的核苷酸序列為序列表中的序列3。
9.如權(quán)利要求4-8中任一所述的方法，其特征在于所述降低目的植物中權(quán)利要求1 所述蛋白質(zhì)的編碼基因的表達(dá)是通過將如下重組表達(dá)載體pTCK303-0sY14i導(dǎo)入目的植物中實現(xiàn)的將序列2中第87-408位核苷酸所示DNA沿著從SpeI至McI的方向插在載體PTCK303的SpeI和McI位點間，得到的重組載體記作中間重組載體；將序列2中第 87-408位核苷酸的反向互補(bǔ)序列所示的DNA的沿著從KpnI至BamHI的方向插在所述中間重組載體的KpnI和BamHI位點間，得到的重組載體pTCK303_0sY14i。
10.如權(quán)利要求4-9中任一所述的方法，其特征在于所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物具體可為水稻。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與植物育性相關(guān)的蛋白質(zhì)及其編碼基因與應(yīng)用。該蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物育性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。實驗證明，降低本發(fā)明的OsY14的表達(dá)量，可以降低植物的育性，說明OsY14是與植物育性相關(guān)的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所得到的育性降低的轉(zhuǎn)基因植物，可作為篩選可提高植物育性基因的模型。
文檔編號C12R1/91GK102206261SQ20111008761
公開日2011年10月5日 申請日期2011年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月8日
發(fā)明者公丕昌, 賀超英 申請人:中國科學(xué)院植物研究所