專利名稱：：與慢性乙型肝炎病程進(jìn)展相關(guān)的cxcl10基因多態(tài)性及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及乙型肝炎病毒(HepatitisBvims,HBV)慢性感染者病程進(jìn)展的個(gè)體易感性及其遺傳學(xué)檢測(cè)方法。具體地，本發(fā)明涉及與HBV慢性感染者病程進(jìn)展相關(guān)的易感基因CZO:70的基因型檢測(cè)方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及上述易感基因基因型的檢測(cè)試劑盒，以及該試劑盒的應(yīng)用。另外，本發(fā)明還涉及上述檢測(cè)方法和易感基因在HBV慢性感染者病程進(jìn)展的預(yù)警以及遺傳咨詢中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：HBV在世界范圍內(nèi)是最常見的導(dǎo)致急性或慢性肝炎的致病因子，特別是在一些亞洲和非洲國(guó)家。在HBV慢性感染期，HBV特異的CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)會(huì)引起肝損傷和募集非特異性T細(xì)胞。這種在y-干枕素(interferon-^,IFN-y)誘導(dǎo)下的對(duì)非特異性CD4+或CD8+T細(xì)胞的募集現(xiàn)象在產(chǎn)生爆發(fā)性肝炎的轉(zhuǎn)基因小鼠中和人類急性乙肝的潛伏期都被證實(shí)。趨化因子配體10chemokine(C-X-Cmotif)ligand10,CXCi^0是HBV轉(zhuǎn)基因小鼠和急性HBV感染的黑猩猩肝臟中誘導(dǎo)表達(dá)的效應(yīng)基因。CXCL10通過與CXCL3結(jié)合激活T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞。最近的研究表明，與非病毒性肝病患者相比，慢性乙肝患者肝臟中高表達(dá)CXCL10。Harvey等人的研究也表明，CXCL10在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)，并且與慢性丙肝患者組織學(xué)嚴(yán)重程度及肝小葉炎癥反應(yīng)相關(guān)。越來越多的研究表明CXCLIO在HBV特異的T細(xì)胞或非特異炎癥細(xì)胞的肝內(nèi)募集、抗病毒或致病機(jī)制中起重要作用。而該基因的多態(tài)性可能改變其表達(dá)或結(jié)合活性，從而影響肝損傷和疾病嚴(yán)重程度。因而，我們假設(shè)CZCZJ0是HBV慢性感染者病程進(jìn)展的候選易感基因，該基因內(nèi)的遺傳多態(tài)性能影響HBV慢性感染者的病程進(jìn)展。
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明人首先對(duì)CXCX/0基因約4.2Kb的基因組區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，發(fā)掘了21個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SingleNucleotidePolymorphisms,SNPs)，然后通過連鎖不平衡分析，選擇了其中2個(gè)標(biāo)簽SNPs進(jìn)行了基因分型，最后通過標(biāo)簽SNP與疾病表型的遺傳關(guān)聯(lián)分析來考察該基因的多態(tài)性與乙肝嚴(yán)重程度的相關(guān)性。發(fā)明人通過基于醫(yī)院的病例-對(duì)照研究，進(jìn)行了大量的臨床和實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)，以及大樣本的統(tǒng)計(jì)分析，判明攜帶含-201A等位的基因型的男性HBV攜帶者病程進(jìn)展更為迅速，更易導(dǎo)致肝損傷，最終發(fā)生更為嚴(yán)重的肝病。因此本發(fā)明鑒定了與乙肝病程進(jìn)展相關(guān)的一種新的易感基因及易感基因型。3本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)與乙肝病程進(jìn)展關(guān)聯(lián)的易感位點(diǎn)CZCZ/OG-201A的方法，該方法為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法。本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)多態(tài)性位點(diǎn)G-201A的引物對(duì)。本發(fā)明進(jìn)一歩提供了分別用于檢測(cè)與乙肝病程進(jìn)展關(guān)聯(lián)的基因的G-201A位點(diǎn)的試劑盒，以及上述試劑盒在慢性乙肝病程進(jìn)展預(yù)警中的應(yīng)用。一、如上所述，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)與慢性乙肝病程進(jìn)展關(guān)聯(lián)的cro:70基因的G-201A位點(diǎn)的方法，該方法為PCR-RFLP，具體的說，包括了如下步驟1、對(duì)CXC丄70基因中與G-201A位點(diǎn)呈絕對(duì)連鎖不平衡的C-1596T位點(diǎn)所在區(qū)域設(shè)計(jì)基因序列特異性引物，并對(duì)樣本基因組DNA進(jìn)行熱啟動(dòng)和梯度的特異性PCR擴(kuò)增；2、對(duì)PCR產(chǎn)物以限制性內(nèi)切酶^k/I進(jìn)行切割，并以瓊脂糖凝膠電泳分析內(nèi)切酶消化產(chǎn)物的帶型，以此判明G-201A位點(diǎn)的基因型。二、另一方面，本發(fā)明還提供了與乙肝病程進(jìn)展關(guān)聯(lián)的易感基因型，即CXC丄70基因的-201八0和-201八八基因型為乙肝病程進(jìn)展的易感基因型，并提供了一種通過檢測(cè)CXC丄70基因的G-201A基因型來判定人群或個(gè)體對(duì)乙肝病程進(jìn)展易感性的方法。該方法包括1、對(duì)CXa:/0基因中與G-201A位點(diǎn)呈絕對(duì)連鎖不平衡的C-1596T位點(diǎn)所在區(qū)域設(shè)計(jì)基因序列特異性引物，并對(duì)樣本基因組DNA進(jìn)行熱啟動(dòng)和梯度的特異性PCR擴(kuò)增；2、對(duì)PCR產(chǎn)物以限制性內(nèi)切酶I進(jìn)行切割，并以瓊脂糖凝膠電泳分析內(nèi)切酶消化產(chǎn)物的帶型，以此判明CXC丄川基因G-201A的基因型；3、當(dāng)基因型表現(xiàn)為-201AG或-201AA時(shí)，則表明該個(gè)體病程進(jìn)展更為迅速，更易導(dǎo)致肝損傷，最終發(fā)生更為嚴(yán)重的肝病。三、檢測(cè)CYC"O基因G-201A位點(diǎn)基因型的特異性引物對(duì)的序列為正向引物5'-GCAGATACTGTCTCAGAACCTGGTA-3'反向引物5'-TGTCACCATCTCTCATTTTGATTGT-3'四、本發(fā)明進(jìn)一步提供了檢測(cè)與乙肝病程進(jìn)展關(guān)聯(lián)的CXCL/0基因的G-201A位點(diǎn)的試劑盒，其內(nèi)裝有一個(gè)或多個(gè)容器，容器內(nèi)裝有用以檢測(cè)G-201A位點(diǎn)基因型的一種或多種組分。與之同時(shí)提供的可以是經(jīng)政府食品與藥品監(jiān)督管理部門審核的、有關(guān)藥品或生物制品制造、使用及銷售方面的信息。例如，在DNA的PCR擴(kuò)增方法實(shí)施中，檢測(cè)樣品的G-201A位點(diǎn)的基因型試劑盒，含有PCR引物對(duì)(5'-GCAGATACTGTCTCAGAACCTGGTA-3'和5'-TGTCACCATCTCTCATTTTGATTGT-3')，dNTPs，用于PCR反應(yīng)的DNA聚合酶及其緩沖液等。本領(lǐng)域技術(shù)人員己知，以上的組分僅是示意性的，所述用于PCR反應(yīng)的DNA聚合酶可以是TaqDNA聚合酶，例如，HotStarTaq酶Kle加w片段，TthDNA聚合酶，VENTDNA聚合酶等能夠用于PCR擴(kuò)增的酶。但為保證特異性擴(kuò)增，除了引物和反應(yīng)條件的優(yōu)化外，應(yīng)優(yōu)選HotStarTaq酶。在PCR產(chǎn)物的RFLP分析中，該試劑盒可含有JftaI及其緩沖液，該基因片段的^"I酶切圖譜等。使用方法說明如下1、PCR擴(kuò)增對(duì)樣品基因組DNA(其具體制備方法參見實(shí)施例)，用本發(fā)明提供的引物，按照如下反應(yīng)體系和條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增25pi反應(yīng)體系為10ng基因組DNA，2^tM引物，2.5mMdNTP，0.6UTaKaRaEXTaqDNA聚合酶以及10XEXTaqBuffer(含Mg2+)。95。C15min預(yù)變性后進(jìn)行2個(gè)階段的擴(kuò)增，其變性和延伸條件一致，均為94°C30s和72°C30s，在第一階段的13個(gè)循環(huán)中，退火溫度從63。C開始每個(gè)循環(huán)降0.5。C，第二階段擴(kuò)增的退火溫度則固定在57。C，最后的72'C延伸時(shí)間為7min。特異性的PCR產(chǎn)物(499bp)以1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。2、RFLP分析對(duì)經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定的PCR產(chǎn)物，按照如下反應(yīng)體系和條件進(jìn)行限制性內(nèi)切酶的切割消化10的反應(yīng)體系為3|dlPCR產(chǎn)物DNA,4單位限制性內(nèi)切酶^wI,10x緩沖液1^和雙蒸餾水。限制性酶切反應(yīng)終止后，將樣品進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳，從而進(jìn)行基因型判定。其中，基因型區(qū)分的依據(jù)是，499bp的PCR產(chǎn)物以；aaI限制性內(nèi)切酶消化后，-1596TT(即-201AA)純合子被切割為兩條片段，長(zhǎng)度分別為174bp和325bp;而純合子-1596C/C(即-201GG)則因?yàn)闆]有酶切位點(diǎn)而在消化后只出現(xiàn)499bp—個(gè)條帶；-1596C/T(即-201A/G)雜合子經(jīng)消化后，不同長(zhǎng)度的該三個(gè)片段均出現(xiàn)。五、本發(fā)明還提供了與乙肝病程進(jìn)展關(guān)聯(lián)的基因G-201A基因型的檢測(cè)方法及其在HBV慢性感染人群預(yù)警中的應(yīng)用。例如，由于本發(fā)明證實(shí)了基因的G-201A基因型與乙肝的病程進(jìn)展存在關(guān)聯(lián)，因此，在HBV慢性感染人群的預(yù)警中，就需要對(duì)所咨詢的對(duì)象進(jìn)行CZC丄70基因G-201A基因型進(jìn)行分析，以判斷該對(duì)象是否攜帶有易感基因型-201AG或-201AA(表現(xiàn)為病程進(jìn)展更為迅速，更易導(dǎo)致肝損傷，最終發(fā)生更為嚴(yán)重的肝病)。對(duì)具有基因型-201AG或-201AA的個(gè)體，則可對(duì)之進(jìn)行科學(xué)的干預(yù)，例如建議及早進(jìn)行治療性預(yù)防等，這樣可以針對(duì)性地降低這些易感人群的乙肝病程迅速進(jìn)展的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1該實(shí)施例設(shè)計(jì)并合成了一套引物對(duì)，并且在該引物對(duì)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了一種檢測(cè)與乙肝病程進(jìn)展關(guān)聯(lián)的CXCXW基因的G-201A基因型的方法。1、基因組DNA的提取采取本領(lǐng)域酚/氯仿法提取外周血白細(xì)胞的基因組DNA。1)取檸檬酸鈉或EDTA-Na2抗凝全血5ml(盡量不用肝素抗凝)，置于50ml有蓋離心管；2)加入3-5倍體積冷蒸餾水，反復(fù)顛倒混勻，冰中放置5分鐘，4'C2000rpm離心20分鐘；3)緩慢傾倒上清，沉淀加入預(yù)冷的0.1。/。Triton-X100(體積同上)，輕柔混勻沉淀，如上離心，棄上清；4)沉淀加入4ml裂解液(50MmTris-Cl-10mMEDTA,pH8.0)，徹底打碎沉淀，然后加入10%SDS至終濃度為0.5%,混勻；5)加入蛋白酶K(10mg/ml)至終濃度為200嗎/ml，混勻，55°C3小時(shí)或37。C過夜消化(以過夜消化為佳)；6)加入等體積平衡酚，倒轉(zhuǎn)混勻，4000rpm離心IO分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至另一個(gè)有蓋離心管；7)轉(zhuǎn)移上層水相，重復(fù)酚抽提一次；8)轉(zhuǎn)移上層水相，加入等體積的氯仿異戊醇(24:1)，倒轉(zhuǎn)混勻，4000rpm離心10分鐘；9)轉(zhuǎn)移上層水相，加入1/10體積的3mol/L乙酸鈉(pH5.2)和2.5倍體積預(yù)冷的無水乙醇混勻；10)置液氮冷凍10分鐘或-20。C60分鐘后，4000rpm離心10分鐘；11)以70%乙醇洗滌沉淀12次，吹干或真空抽干；12)以0.5mlTE(10mMTris-Cl-EDTA，pH8.0)或蒸餾水溶解DNA沉淀，電泳檢測(cè)DNA片段大小，或測(cè)260/280nmOD比值。2、PCR擴(kuò)增用本發(fā)明提供的擴(kuò)增與G-201A位點(diǎn)絕對(duì)連鎖不平衡的C-1596T所在區(qū)域的引物對(duì)，按照如下反應(yīng)體系和條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增25pd反應(yīng)體系為10ng基因組DNA，2引物，2.5mMdNTP，0.6UTaKaRaEXTaqDNA聚合酶以及10XEXTaqBuffer(含Mg2+)。950C15min預(yù)變性后進(jìn)行2個(gè)階段的擴(kuò)增，其變性和延伸條件一致，均為94°C30s和72°C30s，在第一階段的13個(gè)循環(huán)中，退火溫度從63。C開始每個(gè)循環(huán)降0.5。C，第二階段擴(kuò)增的退火溫度則固定在57°<:，最后的72'C延伸時(shí)間為7min。特異性的PCR產(chǎn)物(499bp)以1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。對(duì)經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定的PCR產(chǎn)物，按照如下反應(yīng)體系和條件進(jìn)行限制性內(nèi)切酶的切割消化lO)al的反應(yīng)體系為3MlPCR產(chǎn)物DNA,4單位限制性內(nèi)切酶;aa1,10x緩沖液1^1,和雙蒸餾水。限制性酶切反應(yīng)終止后，將樣品進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳，從而進(jìn)行基因型判定。其中，基因型區(qū)分的依據(jù)是,499bp的PCR產(chǎn)物以力aI限制性內(nèi)切酶消化后，-1596TT(即-201AA)純合子被切割為兩條片段，長(zhǎng)度分別為174bp和325bp:而純合子-1596C/C(即-201GG)則因?yàn)闆]有酶切位點(diǎn)而在消化后只出現(xiàn)499bp—個(gè)條帶-1596C/T(即-201A/G)雜合子經(jīng)消化后，不同長(zhǎng)度的該三個(gè)片段均出現(xiàn)。實(shí)施例2該實(shí)施例用實(shí)施例1建立起來的方法，對(duì)1147例慢性進(jìn)展期乙肝患者，1253例無癥狀HBV攜帶者的CXC丄/0基因的G-201A基因型進(jìn)行了分析。1、試驗(yàn)對(duì)象本研究包括了1147例慢性進(jìn)展期乙肝患者，1253例無癥狀HBV攜帶者(從2001年2月至2006年3月分別收集于北京市傳染病醫(yī)院[613份]和重慶市西南醫(yī)院[1787份])。所有HBV感染者均是HBsAg和抗-HBcIgG陽性至少12個(gè)月。所有攜帶者在研究期間均通過肝功能檢査、血清標(biāo)志物檢測(cè)、超聲波/計(jì)算機(jī)斷層掃描成像、其中376例(15.7%)進(jìn)行了肝組織活檢。所有受試者沒有HCV、HDV和HIV共感染的血清學(xué)證據(jù)。在收集組織標(biāo)本或血樣的同時(shí)，每個(gè)研究對(duì)象均簽署知情同意書并提供詳細(xì)的臨床和社會(huì)人口學(xué)資料。2、CXC丄川基因G-201A位點(diǎn)基因型的確定基因G-201A位點(diǎn)基因型的頻率分布如表1所示。在總體人群中，與-201GG基因型攜帶者相比，-201AG或AA基因型攜帶者病程進(jìn)展更為迅速，更易導(dǎo)致肝損傷，最終發(fā)生更為嚴(yán)重的肝病，比數(shù)比(Oddsratio,OR)為1.50[95%置信區(qū)間(95%CI)=1.20-1.87;P<0.001，見表l]。在北京和重慶這兩個(gè)獨(dú)立人群中的結(jié)果相似(見表l)?；谛詣e的分層分析表明，上述關(guān)聯(lián)只存在于男性中，OR值為1.53[95%置信區(qū)間(95%CI)=1.19-1.98;P=0.001，見表2]。上述關(guān)聯(lián)在經(jīng)過多重檢驗(yàn)校正后仍然具有顯著性意義。因此，用本發(fā)明的方法解析了CICZJO基因G-201A位點(diǎn)基因型與HBV攜帶者病程進(jìn)展的易感性之間的相關(guān)性。應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，但所作改動(dòng)或修改的等價(jià)形式同樣落在本申請(qǐng)權(quán)利書所限定的范圍之內(nèi)。7無癥狀和有癥狀HBV攜帶者中CXCXJ0基因G-201A位點(diǎn)基因型的分布無癥狀HBV攜帶者有癥狀HBV攜帶者-^^^^抬基因型n0.(%)no.(o/0)_P值注OR,比值比(oddsratio);CI,置信區(qū)間(confidenceinterval)'按顯形模型分析，GG為參考組。數(shù)據(jù)經(jīng)過logistic回歸分析，并進(jìn)行了年齡、性別和飲酒狀態(tài)的校正。表2不同性別人群的進(jìn)展性肝損傷風(fēng)險(xiǎn)與CXCXM基因G-201A位點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注OR,比值比(oddsratio);CI，置信區(qū)間(confidenceinterval)*按顯形模型分析，GG為參考組。數(shù)據(jù)經(jīng)過logistic回歸分析，并進(jìn)行了年齡、性別和飲酒狀態(tài)的一交正。參考文獻(xiàn)1.DengG,ZhouG，ZhangR，ZhaiY,ZhaoW，YanZ,DengC,YuanX,XuB,DongX,ZhangX,ZhangX,YaoZ，ShenY，QiangB,WangY，HeF.RegulatorypolymorphismsinthepromoterofCXCLIOgeneanddiseaseprogressioninmalehepatitisBvimscarriers.GWraenfeTO/og,=283=330241(85.4)255(77.7)O駕1.73(1.03-2.93)40(14.2)70(21.4)1(0.4)3(0.9)0.0750.116n=970w=817793(82.4)619(76.5)0.0041.45(U3-.87)165(17.1)178(22.0)5(0.5)12(1.5)0.0910.125n=1253m=11471034(83.0)874(76.9)<0.0011.50(1.20-1.87)205(16.5)248(21.8)6(0.5)15(1.3)0.0870.122北京人群重慶人群總體人群G/GG/AA/AAalleleAalleleGAAkAGAA2008;Inpress.2.LeeWM.HepatitisBvirusinfection.NEnglJMed1997;337:1733-1745.3.LaiCL，RatziuV,YuenMF,etal.ViralhepatitisB.Lancet2003;362:2089-2094.4.CoursagetP,YvonnetB,ChotardJ,etal.Age-andsex-relatedstudyofhepatitisBviruschroniccarrierstateininfantsfromanendemicarea(Senegal).JMedVirol1987;22:1-5.5.MainiMK,BoniC,LeeCK，etal.Theroleofvirus-specificCD8(+)cellsinliverdamageandviralcontrolduringpersistenthepatitisBvirusinfection,JExpMed2000;191:1269-1280.6.AndoK,MoriyamaT,GuidottiLQetal.MechanismsofclassIrestrictedimmunopathology.Atransgenicmousemodeloffulminanthepatitis.JExpMed1993;178:1541-1554.7.WebsterGJ,ReignatS,MainiMK，etal.IncubationphaseofacutehepatitisBinman:dynamicofcellularimmunemechanisms.Hepatology2000;32:1117-1124.8.KakimiK,LaneTE,WielandS，etal.Blockingchemokineresponsivetogamma-2/interferon(IFN)-gammainducibleproteinandmonokineinducedbyIFN-gammaactivityinvivoreducesthepathogeneticbutnottheantiviralpotentialofhepatitisBvirus-specificcytotoxicTlymphocytes.JExpMed2001;194:1755-1766.9.WielandS,ThimmeR,PurcellRH,etal.GenomicanalysisofthehostresponsetohepatitisBvimsinfection.ProcNatlAcadSciUSA2004;101:6669-6674.10.DufourJH,DziejmanM，LiuMT,etal.IFN-gamma-inducibleprotein10(IP-10;CXCL10)-deficientmicerevealaroleforIP-10ineffectorTcellgenerationandtrafficking.JImmunol2002;168:3195-3204.11.LiuL，CallahanMK，HuangD，etal.ChemokinereceptorCXCR3:anunexpectedenigma.CurrTopDevBiol2005;68:149-181.12.PatzwahlR,MeierV，RamadoriG,etal.Enhancedexpressionofinterferon-regulatedgenesintheliverofpatientswithchronichepatitisCvirusinfection:detectionbysuppression-subtractivehybridization.JVirol2001;75:1332-1338.13.DengG,ZhouG,ZhaiY,etal.AssociationofestrogenreceptoralphapolymorphismswithsusceptibilitytochronichepatitisBvirusinfection*Hepatology2004;40:318-326.14.ZhaiY,ZhouG，DengG，etal.EstrogenreceptoralphapolymorphismsassociatedwithsusceptibilitytohepatocellularcarcinomainhepatitisBviruscarriers.Gastroenterology2006;130:2001-2009.序列表<110>中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所<120>與慢性乙型肝炎病程進(jìn)展相關(guān)的CXCXM基因多態(tài)性及其檢測(cè)方法<160>2<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1GCAGATACTGTCTCAGAACCTGGTA25<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2TGTCACCATCTCTCATTTTGATTGT2權(quán)利要求1、一種通過檢測(cè)CXCL10基因的G-201A位點(diǎn)來判定慢性乙型肝炎患者病程進(jìn)展的方法。其特征在于當(dāng)某一慢性乙型肝炎患者的CXCL10基因的G-201A位點(diǎn)表現(xiàn)為-201AG或-201AA基因型時(shí)，則表明該患者病程進(jìn)展更為迅速，更易導(dǎo)致肝損傷，最終發(fā)生更為嚴(yán)重的肝病。2、一種檢測(cè)CICiJO基因的G-201A位點(diǎn)的基因型的方法。該方法為PCR-RFLP法，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法，其特征在于包括以下方面(1)對(duì)包含與G-201A位點(diǎn)呈絕對(duì)連鎖不平衡狀態(tài)的C-1596T位點(diǎn)的CATX70基因序列，設(shè)計(jì)特異性的引物，其序列為正向引物見序列表中序列l(wèi);反向引物見序列表中序列2。(2)對(duì)包含與G-201A位點(diǎn)呈絕對(duì)連鎖不平衡的C-1596T位點(diǎn)的C義C丄川基因區(qū)域，以所設(shè)計(jì)引物，通過熱啟動(dòng)和梯度的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，以基因特異性引物進(jìn)行DNA擴(kuò)增。(3)對(duì)PCR產(chǎn)物以限制性內(nèi)切酶I進(jìn)行切割，并以瓊脂糖凝膠電泳分析內(nèi)切酶消化產(chǎn)物的帶型，以此判明G-201A位點(diǎn)的基因型。3、一種與慢性乙型肝炎病程進(jìn)展關(guān)聯(lián)的CXOJ0基因的G-201A位點(diǎn)的檢測(cè)試劑盒，包括擴(kuò)增用基因特異性引物、dNTPs、用于PCR反應(yīng)的DNA聚合酶及其緩沖液的一種或多種，以及用于測(cè)序的試劑中的一種或多種。4、如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法或其試劑盒在乙型肝炎慢性感染人群疾病嚴(yán)重程度的預(yù)警以及遺傳咨詢中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及與慢性乙型肝炎病程進(jìn)展相關(guān)的易感基因CXCL10的G-201A位點(diǎn)的檢測(cè)方法。所述方法為PCR-RFLP法(即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及檢測(cè)上述易感位點(diǎn)的試劑盒及其應(yīng)用。另外，本發(fā)明將基因的G-201A位點(diǎn)與慢性乙型肝炎病程進(jìn)展的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)聯(lián)系起來，確定了CXCL10是慢性乙型肝炎病程進(jìn)展的一個(gè)新型易感基因，為乙型肝炎慢性感染人群疾病嚴(yán)重程度的預(yù)警提供了新的遺傳咨詢內(nèi)容。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101519685SQ20081000647公開日2009年9月2日申請(qǐng)日期2008年2月29日優(yōu)先權(quán)日2008年2月29日發(fā)明者周鋼橋,灝楊,蕓翟,賀福初申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所