專(zhuān)利名稱(chēng)：一種莜麥病程相關(guān)蛋白基因及其編碼的蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物中與抗病害相關(guān)的基因序列及其編碼的氨基酸序列，尤其涉及莜麥(裸燕麥)的一種病程相關(guān)蛋白基因序列。
背景技術(shù)：
植物在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)受到一些病原微生物的侵襲，?？烧T發(fā)植物產(chǎn)生抗病機(jī)制。從作用方式看，植物產(chǎn)生的抗病機(jī)制可分為3種形成障礙物以阻止病原菌的侵染和擴(kuò)散；產(chǎn)生具有抑菌活性的物質(zhì)以殺死病原體；產(chǎn)生一些酶或化學(xué)物質(zhì)以解除致病因子。 病程相關(guān)蛋白(pathogenesis related proteins,PRP / PRs)就是植物在病理或病理相關(guān)的條件下產(chǎn)生的一類(lèi)蛋白，具有廣譜抗性。它最初是由Van Loon和Van Ka_en等人應(yīng)用多聚腺苷酸誘導(dǎo)煙草抗病研究時(shí)發(fā)現(xiàn)的，稱(chēng)為b蛋白。隨著研究的不斷深入，在許多植物中都發(fā)現(xiàn)了該類(lèi)蛋白，并將其命名為病程相關(guān)蛋白。植物在外界因素(如病原因素、化學(xué)和物理因素等)以及自身生理因素(如開(kāi)花、落葉、衰老等)影響下常會(huì)產(chǎn)生或積累PRP，其主要分布于植物的細(xì)胞間隙和液泡內(nèi)，相對(duì)分子量較小，一般為10-40kD。PRP的穩(wěn)定性較好，能抵抗蛋白酶、糖苷酶、重金屬、尿素、低pH值和高溫(60°C )等。已報(bào)道的PRP大部分是植物抗病原微生物時(shí)產(chǎn)生的，但也有些是由化學(xué)或物理?xiàng)l件誘導(dǎo)產(chǎn)生的，其主要功能包括攻擊病原物、分解毒素、結(jié)合或抑制病毒外殼蛋白。按氨基酸序列的相似度可將PRP分為以下5類(lèi)(1)PR-1類(lèi)，富含甘氨酸，該類(lèi)蛋白在TMV侵染煙草過(guò)敏反應(yīng)中產(chǎn)生的。(2)PR-2和PR-3類(lèi)，分別具有P _1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性。(3)PR-4類(lèi)，有保守的Barwin domain，N端有信號(hào)肽。(4)PR_5類(lèi)，被稱(chēng)為類(lèi)甜蛋白(Thaumatin-Iike proteins),是一類(lèi)具有多種生物學(xué)活性及重要功能的植物防御蛋白。通常該類(lèi)蛋白具有葡聚糖酶活性，能結(jié)合并降解真菌細(xì)胞壁，該功能與其表面的酸性“V”字形裂縫有關(guān)。(5) PR-IO類(lèi)，有核酸酶相似結(jié)構(gòu)，部分顯示體外核酸酶活性和抗菌活性。莜麥(又稱(chēng)裸燕麥)是晉西北地區(qū)主要的糧食作物之一，在禾谷類(lèi)作物中蛋白質(zhì)含量最高，含有人體必需的8種氨基酸，且組成也較平衡。長(zhǎng)期食用莜麥不僅能預(yù)防高血壓、高血脂等心腦血管疾病，而且對(duì)糖尿病的預(yù)防及治療也有一定的作用。本發(fā)明從莜麥幼苗中分離到一種病程相關(guān)蛋白基因，該基因編碼的蛋白屬于PR-5類(lèi)病程相關(guān)蛋白，已有報(bào)道在玉米、高梁、小麥等種子中發(fā)現(xiàn)了該類(lèi)蛋白，分子量約為23KD。該類(lèi)蛋白常具有抗真菌、￠-1,3-葡聚糖酶、抗凍、抗?jié)B透壓力等多種生物學(xué)活性，參與植物系統(tǒng)獲得性反應(yīng)(SAR)和超敏反應(yīng)(HR)，在植物抵御生物和非生物脅迫中具有重要作用。PR-5蛋白能導(dǎo)致真菌孢子裂解，抑制孢子萌發(fā)，降低萌芽的生存能力，消耗細(xì)胞膜的勢(shì)能，抵抗不同的致病和非致病真菌。研究發(fā)現(xiàn)，酵母細(xì)胞膜表面存在一種PR-5蛋白的受體(Izh2p),從而導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡，該P(yáng)R-5蛋白受體在真菌是保守存在的，這使的PR-5蛋白被認(rèn)為是一種新穎的、廣譜的、具有潛力的抑菌藥物。此外，對(duì)轉(zhuǎn)PR-5基因作物的研究發(fā)現(xiàn)，與野生作物相比，轉(zhuǎn)基因作物對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)能力，尤其是抗鹽潰、干旱和病菌侵害的能力都有顯著的提高，這也進(jìn)一步證實(shí)了 PR-5蛋白的應(yīng)用價(jià)值。另外PR-5蛋白還與毫無(wú)氨基酸序列同源性的動(dòng)物脂聯(lián)素(adiponectin)具有相似的功能——能通過(guò)哺乳類(lèi)C2C12肌細(xì)胞的脂聯(lián)素受體誘導(dǎo)AMP激酶的磷酸化作用，這一研究發(fā)現(xiàn)使得PR-5蛋白的應(yīng)用前景更為廣闊。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供莜麥中的一種PR-5類(lèi)病程相關(guān)蛋白基因及其編碼的蛋白，本發(fā)明的另一目的在于將莜麥病程相關(guān)蛋白的基因在培育抗病作物中應(yīng)用，將莜麥病程相關(guān)蛋白在制備抑囷劑中應(yīng)用。本發(fā)明提供的一種莜麥病程相關(guān)蛋白(permatin)的基因,其核苷酸序列為SEQID No :1，來(lái)源于莜麥(A. nuda)，由678個(gè)堿基組成。莜麥病程相關(guān)蛋白(permatin)的基因編碼的蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID No 2，由225個(gè)氨基酸組成。蔽麥病程相關(guān)蛋白基因的獲得I)根據(jù) NCBI 中 permatin precursor [Avena sativa](登錄號(hào)為 ASU57787) DNA序列設(shè)計(jì)引物正向引物IaaUp5’ -CTGGATCCATGGCGTCCTCCAGTGTC-3’反向引物184aaDn5’ -GTCGGTGAACTGGCCCCGGCA-3’以莜麥(A. nuda)幼苗葉片總RNA為模板，在laaUp/184aaDn引物引導(dǎo)下進(jìn)行RT-PCR ；2)根據(jù)已獲取的permatin基因5’端cDNA序列設(shè)計(jì)特異性引物124aaUp,利用3’ RACE技術(shù)擴(kuò)增permatin基因cDNA 3’末端；3)利用重疊PCR獲得permatin基因的全長(zhǎng)核苷酸序列。將該基因全長(zhǎng)經(jīng)Blast比對(duì)，結(jié)果表明其與禾本科植物類(lèi)甜蛋白(Thaumatin-like proteins, TLP)有較高的同源性,具有PR-5類(lèi)蛋白的共同特征,歸屬于PR-5類(lèi)病程相關(guān)蛋白，在培育抗病作物中潛在的應(yīng)用價(jià)值。莜麥重組病程相關(guān)蛋白的獲得將5’和3’端分別含有EcoR I和BamH I酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物克隆至含相應(yīng)酶切位點(diǎn)的原核表達(dá)載體pMAL-2c中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pMAL-2c-permat in,轉(zhuǎn)E. Coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，并進(jìn)行純化。蔽麥重組病程相關(guān)蛋白抑菌實(shí)驗(yàn)用牛津杯法鑒定permatin蛋白對(duì)白腐菌、毛殼菌、紅曲霉三種真菌的抑制作用，表明該蛋白具有很好的抗菌效果，在開(kāi)發(fā)綠色抑菌劑方面有潛在的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明的莜麥病程相關(guān)蛋白的基因，可用于培育抗病作物；該基因編碼的蛋白，可用于開(kāi)發(fā)綠色抑菌劑等。



圖I為莜麥幼苗葉片總RNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖2為RT-PCR及3’ RACE實(shí)驗(yàn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果泳道I :DNAMarker ;泳道2 :laaUp/184aaDn 引物擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道3 124aaUp/InnerPrimer引物擴(kuò)增產(chǎn)物。
圖3為搭橋PCR擴(kuò)增permatin全長(zhǎng)cDNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果泳道I :DNA Marker ;泳道 2-3 laaUp/228aaDn 引物擴(kuò)增產(chǎn)物。圖4為不同來(lái)源的PRP氨基酸序列比對(duì)結(jié)果Triticum aestivum TLP (GenBank 登錄號(hào)為 AAM15877. I) ；0ats permatinprecursor (GenBank 登錄號(hào)為 AAB02259. I) ;Barley TLP7 (GenBank 登錄號(hào)為 548125);Zeamatin precursor (RefSeq 登錄號(hào)為 NP 001105356. I) ；Barperml (GenBank 登錄號(hào)為AAB71680. I)。圖5為重組融合蛋白純化過(guò)程12%SDS_PAGE
泳道I :Pix)tein Marker ;泳道2 :誘導(dǎo)全菌樣；泳道3 :誘導(dǎo)上清樣；泳道4 :誘導(dǎo)沉淀樣；泳道5 Amylose柱穿透樣；泳道6 :麥芽糖洗脫樣；泳道7 Sephacryl-200凝膠層析柱純化樣。圖6為permatin蛋白體外抑菌實(shí)驗(yàn)A.對(duì)白腐菌菌絲生長(zhǎng)的抑制；B.對(duì)毛殼菌菌絲生長(zhǎng)的抑制；C.對(duì)紅曲霉菌絲生長(zhǎng)的抑制；(0 :control I 30 u g/ml 2 50 u g/ml 3 80 u g/ml)
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例I莜麥permatin基因的克隆根據(jù)NCBI已經(jīng)報(bào)道的 permatin precursor [Avena sativa](登錄號(hào)為ASU57787)DNA序列設(shè)計(jì)引物正向引物IaaUp5’ -CTGGATCCATGGCGTCCTCCAGTGTC-3’反向引物184aaDn5’ -GTCGGTGAACTGGCCCCGGCA-3'以莜麥(A. nuda)幼苗葉片總RNA為模板，在laaUp/184aaDn引物引導(dǎo)下進(jìn)行RT-PCR，然后根據(jù)已知的permatin基因5’端cDNA序列設(shè)計(jì)特異性引物124aaUp，利用3’RACE技術(shù)擴(kuò)增permatin基因cDNA 3’末端,進(jìn)而得到permatin基因的全長(zhǎng)核苷酸序列。具體方法包括以下步驟I. Total RNA的提取取生長(zhǎng)5_7天的莜麥幼苗葉片，用TRNzol法(所用試劑購(gòu)自TIANGEN公司)提取幼苗Total RNA。具體方法為稱(chēng)取生長(zhǎng)良好的莜麥幼苗葉片0. 2g，立即在液氮中充分研磨，加入3ml TRNzol試劑，將勻漿樣品吸入無(wú)RNase的I. 5ml離心管中，室溫放置15分鐘；每毫升勻漿樣中加入0. Iml氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3分鐘；4°C下，12000rpm離心15分鐘，此時(shí)樣品會(huì)分成三層黃色有機(jī)相、中間層和上層無(wú)色的水相。RNA主要分在水相，用Iml的移液器將水相轉(zhuǎn)移到無(wú)RNase的I. 5ml離心管中；加入等體積的異丙醇，混勻，室溫放置30分鐘；4°C下，12000rpm離心10分鐘，倒掉上清，此時(shí)可以在管側(cè)和管底看到膠狀沉淀；加入Iml 75%乙醇(DEPC處理過(guò)的水配制)洗滌沉淀，4°C下，12000rpm離心10分鐘，倒掉上清后室溫下放置2-3分鐘，加入50 U I RNase-free ddH20,反復(fù)吹打溶解RNA取5 ii ITotal RNA于無(wú)RNase的電泳槽中進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)Total RNA質(zhì)量(見(jiàn)圖I)。2.第一鏈cDNA合成用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自TIANGEN公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。具體方法為取1-5 V- g Total RNA,向冰浴的無(wú)RNase的I. 5ml離心管中加入2 y Ioligo(dT)和 2ii IdNTP (2. 5mM each)，用 RNase-free ddH20 補(bǔ)足體系至 14. 5 u I ;70°C加熱5分鐘后迅速在冰上冷卻2分鐘,離心收集反應(yīng)液,加入4 u I 5 X First-Strand Buffer(含 DTT)和 0. I RNasin ;加入 I ii I TIANScript M-MLV (200U/y 1)，輕輕混勻；25°C溫浴10分鐘，42°C溫浴50分鐘；95°C加熱5分鐘終止反應(yīng)，_20°C保存。3. RT-PCR :在無(wú)菌的離心管中依次加入 5 y 110 X PCR Buffer, I. 5u I 50mMMgCl2,1 u I IOmMdNTP mix,2u I IaaUp 引物(10 y M)，2 y I 184aaDn 引物(10 y M)，0. 4 y ITaq DNApolymerase (5U/ ii I)和 I cDNA (第一鏈反應(yīng)液)，ddH20 補(bǔ)足體系至 50 ii I ;混勻后，95°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性30秒，53°C退火30秒，72°C延伸45秒，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸10分鐘；1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶特異性(見(jiàn)圖2);回收目的DNA片段，連接PEasy Tl載體(購(gòu)自TransGen公司)，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取陽(yáng)性克隆子(白斑)測(cè)序。4.利用3’ RACE技術(shù)擴(kuò)增permatin基因3’末端序列根據(jù)獲得部分permatin 基因5’端cDNA序列設(shè)計(jì)特異性正向引物124aaUp 5’ -CAACACGCCAATAAGCTTCCAG-3’與3’RACE Outer Primer和Inner Primer進(jìn)行巢式PCR。具體方法如下4. I用3’ RACE試劑盒(購(gòu)自TAKARA公司)自帶試劑合成cDNA第一鏈在無(wú)RNase的離心管中依次加入 I U I Total RNA (I U g/u I), I U I 3’ RACE Adapor, 2 u I 2 X M-MLVBuffer,Iu IdNTP Mixture(IOmM each),0. 25 u I RNase Inhibitor (40U/u I),0.25 u IReverse Transcriptase M-MLV (2000U/ U 1),4. 5 U I RNase-free ddH20,輕輕混勻；42°C 溫浴60分鐘，70°C加熱15分鐘終止反應(yīng)，-20°C保存。4.2 Outer PCR反應(yīng)在無(wú)菌的微離心管中依次加入2 ii I上述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，8 ill IXcDNADilution Buffer II，2 y I 特異性上游引物 124aaUp (10uM),2u I 3’RACEOuter Primer, IOu 15 X TransStart FastPfu Buffer, Iul TransStart FastPfu DNAPolymerase高保真酶(購(gòu)自TransGen公司)，25 u I ddH20,輕輕混勻;94°C預(yù)變性3分鐘， 94°C變性30秒，53°C退火30秒，72°C延伸60秒，20個(gè)循環(huán)，72°C延伸10分鐘；_20°C保存。4. 3Inner PCR反應(yīng)在無(wú)菌的微離心管中依次加入I iU 1st PCR產(chǎn)物，
5u IlOXTransTaq HiFi Buffer II，2 y I 特異性上游引物 124aaUp (10 y M)，2 y I 3’RACEInner Primer, 4 u I dNTP (2. 5mMeach), Iul TransTaq HiFi DNA Polymerase (購(gòu)自TransGen公司)，補(bǔ)ddH20至50 yl，輕輕混勻；94°C預(yù)變性3分鐘，94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸45秒，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸10分鐘；1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶特異性(見(jiàn)圖3);回收目的DNA片段，連接pEasy Tl載體，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取陽(yáng)性克隆子(白斑)，測(cè)序。5.重疊PCR技術(shù)(S0E PCR)擴(kuò)增permatin基因全長(zhǎng)測(cè)序分析后，根據(jù)獲得的cDNA 3’末端序列設(shè)計(jì)帶EcoR I限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)的permatin基因反向引物225aaDn 5’ -TGAATTCCAATTAAGGGCAGAGCACG-3，(劃線部分為限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn))，用SOEPCR技術(shù)擴(kuò)增permatin全長(zhǎng)，具體方法為分別以pEASY-Tl-Permatin (laa_184aa)，pEASY-Tl-Permatin (124aa_C 末端)為模板，laaUp/184aaDn和124aaUp/225aaDn為引物，用高保真酶進(jìn)行PCR ;分別回收Permatin l_184aa, Permatin 124_225aa 基因片段各 30 U I 作為 SOE PCR 的模板；在無(wú)菌的微離心管中依次加入 30. 5 ii I ddH20, 5 u I IOXTransTaq HiFi BufferII,4u I 2. 5mMdNTP, 3 u I Permatin l_184aa 基因片段，3 y I Permatin 124_225aa 基因片段，輕輕混勻;94°C預(yù)變性3分鐘，94°C變性30秒，53°C退火30秒，72°C延伸30秒，5個(gè)循環(huán)；再依次加入2 U I 上游引物 Iaa Up, 2 U I 下游引物 225aa Dn, 0. 5 U I TransTaq DNA Polymerase HighFidelity，輕輕混勻;94°C預(yù)變性3分鐘，94變性30秒，53 °C退火30秒，72 °C延伸60秒，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸10分鐘；1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶特異性(見(jiàn)圖3)。將permatin基因全長(zhǎng)的PCR產(chǎn)物回收后測(cè)序分析，經(jīng)序列測(cè)定表明擴(kuò)增產(chǎn)物從ATG到TAA的讀框?yàn)?78bp核苷酸片段，Blast比對(duì)結(jié)果表明該基因編碼的氨基酸序列與禾本科植物TLP有較高的同源性。其中與設(shè)計(jì)引物時(shí)所參考的permatin precursor [Avenasativa](登錄號(hào)為AAB02259. I)ORIGIN序列同源性為82. 7%，與其他來(lái)源的PRP同源性如下Triticum aestivum TLP (AAM15877. 1)81. 8% ；Barley TLP7 (548125)84. 4% ；Zeamatinprecursor (NP_001105356. I) 55. 6% ；Barperml (AAB71680. I) 86. 2% (見(jiàn)圖 4)。實(shí)施例2 Permatin基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建取15 ill permatin基因PCR產(chǎn)物回收產(chǎn)物與I ii I pMAL_2c原核表達(dá)載體質(zhì)粒分 別用EcoRI和BamHI (均購(gòu)自TaKaRa公司)限制性?xún)?nèi)切酶37°C酶切2小時(shí)，反應(yīng)體系分別為60 Ul和20 Ul ;然后將兩個(gè)酶切反應(yīng)體系混合后，加入等體積的80 Ul酚/氯仿(I : I )，震蕩混勻，13000rpm離心10分鐘；小心吸取上層清液，加入1/10體積的3M NaAc (pH5. 2)，混勻后再加入2倍體積的無(wú)水乙醇(_20°C預(yù)冷)，-20°C下靜置30分鐘；13000rpm離心10分鐘，棄去液體；加入100 u I 75%乙醇洗滌一次；室溫下干燥至管底無(wú)液體殘留；依次加入7. I 的 ddH20, 2 u I 5XT4DNA Ligase Buffer 和 0. 5 y I T4DNA Ligase (200U/u I)(購(gòu)自TransGen公司);25°C水浴40分鐘；將連接產(chǎn)物加入100 用氯化鈣制備的E. Coli XlO感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30分鐘，42°C熱休克90秒，冰浴2分鐘；加入200 u I 37°C預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)I小時(shí)；4000rpm離心2分鐘后棄去200 U I上清液，將剩于清液與沉淀輕輕混勻；將懸液涂布在含IOOii g/ml的氨芐青霉素平板上；37°C倒置培養(yǎng)12小時(shí)；用自身引物篩選陽(yáng)性重組子，并測(cè)序分析。實(shí)施例3 Permatin基因的重組表達(dá)及純化將插入Permatin基因的重組子進(jìn)行質(zhì)粒抽提，取I ill轉(zhuǎn)化E. Coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30分鐘，42°C熱休克90秒，冰浴2分鐘后將懸液涂布在含100 u g/ml的氨芐青霉素平板上；37°C倒置培養(yǎng)12小時(shí)；從平板上挑取單菌落于5ml LB(含100 u g/ml的Amp)液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)12小時(shí)；取上述預(yù)培養(yǎng)菌按1%的接種量轉(zhuǎn)接于500ml LB(含100 y g/ml的Amp)液體培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)2_3小時(shí)至0D_在0. 6-0. 8時(shí)加入IPTG使其終濃度達(dá)到0. 3mM，37°C震蕩培養(yǎng)4小時(shí)，8000rpm離心10分鐘收集菌體；用適量的pH8. 020mMTris-HCl (含500mM NaCl)緩沖液將菌體懸起，超聲破碎細(xì)胞；11000rmp離心30分鐘，收集上清；上清經(jīng)0. 22 ii m的微孔濾膜過(guò)濾后，上樣至已用20mM Tris-HCl pH8. 0 (含500mMNaCI)緩沖液平衡好的Amylose親和柱，結(jié)合30分鐘；用20mM Tris-HCl pH8. 0 (含500mMNaCl)緩沖液洗脫至無(wú)蛋白穿出；用20mM Tris-HCl pH8. 0 (含500mM NaCl，IOmM麥芽糖)洗脫液洗脫目的蛋白；目的蛋白洗脫液經(jīng)濃縮后，上樣至已用20mM Tris-HCl pH8. 0 (含50mM NaCl)緩沖液平衡好的S印hacryl-200凝膠層析柱進(jìn)行純化，收集目的蛋白洗脫樣；12% SDS-PAGE (見(jiàn)圖 5)。實(shí)施例4 Permatin蛋白體外抑菌實(shí)驗(yàn)抗真菌實(shí)驗(yàn)采用牛津杯法。具體方法為首先配制PDA培養(yǎng)基(主要成分為200g土豆，20g葡萄糖，2g磷酸二氫鉀，Ig結(jié)晶硫酸鎂，IOmg VB1),將菌株(白腐菌、毛殼菌、紅曲霉)點(diǎn)種于培養(yǎng)基的中心，于30°C條件下培養(yǎng)，當(dāng)其菌落直徑長(zhǎng)至l_2cm時(shí)在菌落的外圍加入滅菌的牛津杯，將該樣品和不含該樣品的其他條件完全相同的含50mmol/L NaCl的20mmol/LTris-HCl, pH8. 0緩沖液通過(guò)濾膜除菌加入牛津杯內(nèi)，于4°C放置24h使其充分?jǐn)U 散，然后將平板放入30°C培養(yǎng)箱中進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，并進(jìn)行菌絲生長(zhǎng)狀況的觀察(見(jiàn)圖6)。結(jié)果表明，permatin對(duì)白腐菌的抑菌效果最明顯(圖6A),毛殼菌次之(圖6B),對(duì)紅曲霉的抑制效果最不明顯(圖6C)，且存在劑量依賴(lài)性，其最小抑菌濃度為30ii g/mL。
權(quán)利要求
1.一種莜麥病程相關(guān)蛋白的基因，其核苷酸序列為SEQ ID N2 :1。
2.權(quán)利要求I所述的基因編碼的蛋白，其氨基酸序列為SEQID No :2。
3.權(quán)利要求I所述的莜麥病程相關(guān)蛋白的基因在培育抗病作物中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述的莜麥病程相關(guān)蛋白在制備抑菌劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種莜麥病程相關(guān)蛋白的基因及其編碼的蛋白。是應(yīng)用RT-PCR及3'RACE技術(shù)從莜麥幼苗中分離出了一個(gè)678bp的病程相關(guān)蛋白基因，該基因的核苷酸序列為SEQID No1。該基因編碼的蛋白的氨基酸序列為SEQ ID No2。本發(fā)明的莜麥病程相關(guān)蛋白的基因，可用于培育抗病作物；該基因編碼的蛋白，可用于開(kāi)發(fā)綠色抑菌劑等。
文檔編號(hào)C12N15/29GK102703472SQ201210175029
公開(kāi)日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月29日
發(fā)明者石亞偉, 韓德平 申請(qǐng)人:山西大學(xué)