專利名稱：一種具有核糖核酸酶活性的蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有核糖核酸酶活性的蛋白及其制備方法。
背景技術(shù)：
中草藥主要根據(jù)所含有的活性成分入藥，為了充分利用資源和探索新的活性成分，其中蛋白質(zhì)成分逐漸受到關(guān)注。近年來，已有許多具有生物活性的蛋白質(zhì)相繼在多種中草藥中被發(fā)現(xiàn)。分離純化中草藥中的活性蛋白質(zhì)成分，以期找到一些新的具有生物活性的蛋白質(zhì)源，已經(jīng)成為國內(nèi)外眾多研究工作者的一個重要方向。
病程相關(guān)蛋白是植物在病原體侵染下或是外界環(huán)境的壓力、化學(xué)物質(zhì)和植物自身激素因素促使下由自身編碼的具有抵抗作用的蛋白。自煙草中的四個病程相關(guān)蛋白于二十世紀七十年代被首次發(fā)現(xiàn)之后，越來越多的此類蛋白在單子葉植物和雙子葉植物的廣大種屬中被發(fā)現(xiàn)。目前，根據(jù)蛋白的分子量、等電點、氨基酸序列、血清學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)功能等方面性質(zhì)，病程相關(guān)蛋白被劃分為14個家族，即PR-1至PR-14。
PR-10蛋白是一類分子量在16-19kDa之間，等電點偏酸性并具有抗蛋白酶活性的蛋白，根據(jù)它們沒有信號肽和結(jié)構(gòu)上的特性判斷它們存在于胞液內(nèi)。已經(jīng)在很多植物中都發(fā)現(xiàn)有PR-10蛋白的存在，包括雙子葉植物，如西芹、豌豆、大豆和馬鈴薯；單子葉植物，如蘆筍、百合和水稻。許多研究表明PR-10蛋白不僅參與了植物的抗病機制反應(yīng)，同時在植物的自身發(fā)育中也起著重要作用。PR-10蛋白在結(jié)構(gòu)上類似核糖核酸酶，在目前已報道的PR-10家族蛋白中，發(fā)現(xiàn)有體外的RNase活性的有樺樹花粉過敏原Bet v1，棉花GaPR-10，黃羽扇豆L1PR-10.1C，辣椒CaPR-10和丁茄SsPR10等，但是大多PR-10蛋白如土豆、西芹和苜蓿中的PR-10蛋白沒有RNase活性。
黃芪，系豆科(Leguminasae)蝶形花亞科(Papilionoideae)黃芪屬(AstragalusLinn)膜莢黃芪(Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.)及蒙古黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch)Bge.var.mongholicus(Fisch)Hsiao)的干燥根。關(guān)于黃芪中有效成分的研究主要集中在多糖、皂甙和黃酮等，對于黃芪中含量很大的蛋白質(zhì)組分(15％以上)研究報道很少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有核糖核酸酶活性的蛋白及其制備方法。
本發(fā)明所提供的具有核糖核酸酶活性的蛋白，名稱為AmPR-10，其凝膠過濾層析測得的分子量為32.6kDa，SDS-PAGE測得的亞基分子量17.2kDa，總糖的質(zhì)量百分含量為13.7％，其N末端15個氨基酸的序列為序列表中序列1；所述總糖中含有質(zhì)量百分含量為73％的阿拉伯糖和質(zhì)量百分含量為15％的葡萄糖。
所述具有核糖核酸酶活性的蛋白，是按照包括下述步驟的方法制備1)制備pH為5.2-8.2黃芪植株的總蛋白提取液；2)將步驟1)得到的總蛋白提取液進行金屬離子螯合層析，用pH為6.0-8.0磷酸緩沖液洗脫，收集洗脫液，得到未結(jié)合蛋白峰洗脫液；3)將步驟2)得到的未結(jié)合蛋白峰洗脫液過陰離子交換層析柱，先用pH為5.4-7.4磷酸緩沖液洗去未結(jié)合蛋白，用含30～60mmol/L NaCl的磷酸緩沖液洗滌雜蛋白，再用含300～500mmol/L NaCl磷酸緩沖液洗脫結(jié)合蛋白，收集洗脫峰；4)步驟3)得到的洗脫液用濕球粒度范圍101-303μm，分子量分離范圍為1.5kDa-30kDa的凝膠層析柱分離，用pH為5.2-8.2檸檬酸—磷酸緩沖液洗脫，收集核糖核酸酶比活為74.11U/mg的洗脫峰，得到具有核糖核酸酶活性的蛋白。
所述步驟1)中總蛋白提取液是將黃芪粉碎成黃芪粗粉，加入pH為5.2-8.2磷酸緩沖液，在4-20℃下攪拌提取8-12小時，過濾提取液，將濾液離心收集上清液得到的。
所述步驟1)中黃芪粗粉與磷酸緩沖液的重量比為1∶4～10，所述磷酸緩沖液的濃度為20mmol/L，pH值為7.2。
所述步驟2)中的磷酸緩沖液的濃度為20mmol/L，pH值為7.0；所述磷酸緩沖液的流速為8～14mL/小時。
所述步驟3)中的磷酸緩沖液的濃度為20mmol/L，pH值為6.4；所述洗滌雜蛋白的緩沖液的NaCl濃度優(yōu)選為50mmol/L；所述洗脫結(jié)合蛋白的緩沖液的NaCl濃度優(yōu)選為400mmol/L。
所述步驟4)中所用凝膠層析柱為Sephadex G50凝膠層析柱；所述檸檬酸—磷酸緩沖液為含10mmol/L檸檬酸、20mmol/L Na2HPO4·12H2O，pH為6.2的溶液；所述檸檬酸—磷酸緩沖液洗脫的流速為4～6mL/小時。
所述制備具有核糖核酸酶活性的蛋白的步驟中還包括將步驟1)和2)中得到的樣品進行透析，將步驟2)和3)收集的洗脫液樣品進行超濾，所述超濾的截留分子量為10kDa。
所述黃芪可為蒙古黃芪、膜莢黃芪或多序巖黃芪。
本發(fā)明提供的上述具有核糖核酸酶活性的蛋白的制備方法，包括下述步驟1)制備pH為5.2-8.2黃芪植株的總蛋白提取液；2)將步驟1)得到的總蛋白提取液進行金屬離子螯合層析，用pH為6.0-8.0磷酸緩沖液洗脫，收集洗脫液，得到未結(jié)合蛋白峰洗脫液；3)將步驟2)得到的未結(jié)合蛋白峰洗脫液過陰離子交換層析柱，先用pH為5.4-7.4磷酸緩沖液洗去未結(jié)合蛋白，用含30～60mmol/L NaCl的磷酸緩沖液洗滌雜蛋白，再用含300～500mmol/L NaCl的磷酸緩沖液洗脫結(jié)合蛋白，收集洗脫峰；4)步驟3)得到的洗脫液用濕球粒度范圍101-303μm，分子量分離范圍為1.5kDa-30kDa的凝膠層析柱分離，用pH為5.2-8.2檸檬酸—磷酸緩沖液洗脫，收集核糖核酸酶比活為74.11U/mg的洗脫峰，得到具有核糖核酸酶活性的蛋白。
所述方法中，所述步驟1)中總蛋白提取液是將黃芪粉碎成黃芪粗粉，加入pH為5.2-8.2磷酸緩沖液，在4-20℃下攪拌提取8-12小時，過濾提取液，將濾液離心收集上清液得到的。
所述方法中，所述步驟1)中黃芪粗粉與磷酸緩沖液的重量比為1∶4～10，所述磷酸緩沖液的濃度為20mmol/L，pH值為7.2。
所述方法中，所述步驟2)中的磷酸緩沖液的濃度為20mmol/L，pH值為7.0；所述磷酸緩沖液的流速為8～14mL/小時。
所述方法中，所述步驟3)中的磷酸緩沖液的濃度為20mmol/L，pH值為6.4；所述洗滌雜蛋白的緩沖液的NaCl濃度優(yōu)選為50mmol/L；所述洗脫結(jié)合蛋白的緩沖液的NaCl濃度優(yōu)選為400mmol/L。
所述方法中，所述步驟4)中所用凝膠層析柱為Sephadex G50凝膠層析柱；所述檸檬酸—磷酸緩沖液為含10mmol/L檸檬酸、20mmol/L Na2HPO4·12H2O，pH為6.2的溶液；所述檸檬酸—磷酸緩沖液洗脫的流速為4～6mL/小時。
所述方法中，所述制備具有核糖核酸酶活性的蛋白的步驟中還包括將步驟1)和2)中得到的樣品進行透析，將步驟2)和3)收集的洗脫液樣品進行超濾，所述超濾的截留分子量為10kDa。
所述方法中，所述黃芪可為蒙古黃芪、膜莢黃芪或多序巖黃芪。
本發(fā)明的具有核糖核酸酶活性蛋白，其核糖核酸酶的比活達74.11U/mg。本發(fā)明的制備具有核糖核酸酶活性蛋白的方法是一種高效的提取純化方法，通過將提取的粗提液進行金屬離子螯合層析、離子交換層析和凝膠過濾層析三步分離純化得到電泳純蛋白，從10g黃芪中可以得到4.19mg純蛋白(表1)。本發(fā)明的具有核糖核酸酶活性蛋白，可作為核糖核酸酶，用于降解RNA；也可以本發(fā)明的具有核糖核酸酶活性蛋白為抗原制備單克隆和多克隆抗體，檢測目的植物中是否含有具有核糖核酸酶活性蛋白；將本發(fā)明的具有核糖核酸酶活性蛋白的編碼基因與TA29等啟動子結(jié)合后構(gòu)成嵌合基因可作為不育基因，導(dǎo)入到植株中為植物基因育種提供新途徑。


圖1為Zn-Agarose-4B層析圖譜圖2為離子交換柱QAE Sephadex A-25層析圖譜圖3為凝膠柱Sephadex G50層析圖譜圖4為各步純化后SDS-PAGE圖譜圖5為凝膠過濾層析Superdex 75測具有核糖核酸酶活性蛋白分子量具體實施方式
下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中所述的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
實施例1、具有核糖核酸酶活性的蛋白的獲得1、黃芪粗提液的提取將蒙古黃芪(Astragalus mongholicus Bunge)粉碎后，加入磷酸緩沖液(20mmol/L，pH 7.2)，使黃芪粉末與磷酸緩沖液的重量比為1∶6，在4℃攪拌提取10小時。將提取液用4層紗布過濾，濾液在10000rpm(3000g)，4℃條件下離心10分鐘，取上清液，即為含目標蛋白的黃芪粗提液。
核糖核酸酶活性的測定核糖核酸酶活性的測定以酵母tRNA(Sigma公司，美國)為底物參照周向軍等人的方法(Zhou et al.，2002，Plant Sci.162，629-636)。即將200μg酵母tRNA溶于400μL MES緩沖液(100mmol/L，pH 6.0)，加入100μL樣品在56℃保溫30分鐘后加入預(yù)冷的4mol/L LiCl 1mL，在冰水浴放置3小時后10000rpm冷凍離心20分鐘，取上清液1mL加入二蒸水2mL測定A260。酶活定義為在上述反應(yīng)條件下30分鐘后使A260(光徑1cm)增加1個單位所需要的酶量。蛋白的精確定量采用Lowry方法(Lowry et al.，1951，J.Biol.Chem.193，265-275)以牛血清蛋白為標準，蛋白量檢測及酶活檢測結(jié)果如表1所示。
將上述黃芪粗提液進行SDS-PAGE，SDS-PAGE采用12.5％(g/ml)分離膠，考馬斯亮藍R250染色，結(jié)果如圖4中泳道1所示。
2、Zn-Agarose-4B金屬離子螯合層析Zn-Agarose-4B金屬離子螯合層析柱料的制備方法金屬離子螯合層析柱料為按照Jerker和Birgit的方法(Jerker et al.，1983，Biochem 22(7)，1621-1630)制備。具體步驟為將20g凝膠Agarose-4B(濕重)加入25mL 2mol/L氫氧化鈉、12.5mL環(huán)氧氯丙烷和12.5mL乙腈混合液中，30℃ 150rpm震蕩混勻24小時，然后用去離子水充分洗滌凝膠，再用2mol/L碳酸鈉平衡。平衡好的柱料濾干加入溶有4g亞氨基二乙酸的40mL 2mol/L碳酸鈉溶液中，60℃ 150rpm震蕩混勻24小時，用去離子水充分洗滌?；罨玫闹涎b柱，將1mg/mL氯化鋅溶液通過層析柱使層析柱飽和，用去離子水充分洗滌，制得金屬離子螯合層析柱Zn-Agarose-4B。
預(yù)先用磷酸緩沖液(20mmol/L，pH 7.0)平衡好層析柱Zn-Agarose-4B，將步驟1得到的黃芪粗提液20mL，在磷酸緩沖液(20mmol/L，pH 7.0)中透析過夜。透析后的粗體液樣品離心后，上樣，先用磷酸緩沖液(20mmol/L，pH 7.0)洗脫未結(jié)合蛋白，流速為12mL/小時，待A280≤0.08后，再用120mmol/L咪唑洗脫結(jié)合蛋白，洗脫時流速為1mL/min，洗至A280≤0.25。Zn-Agarose-4B層析圖譜如圖1所示，圖1中A1為未螯合蛋白峰；A2為120mmol/L咪唑洗脫蛋白峰。以牛血清蛋白為標準，采用Lowry方法(Lowry et al.，1951，J.Biol.Chem.193，265-275)對收集的各峰洗脫液蛋白精確定量，用步驟1所述方法測定核糖核酸酶的比活，蛋白量檢測及酶活檢測結(jié)果如表1所示，結(jié)果表明未結(jié)合蛋白峰A1和120mmol/L咪唑洗脫峰A2的核糖核酸酶的比活分別為12.57U/mg和1.88U/mg。收集未螯合蛋白峰A1，對收集液進行超濾(截留分子量為10kDa，Stirred Cell Model 8050，Millipore)后用磷酸緩沖液(20mmol/L，pH 6.4)透析過夜，得到的樣品進行SDS-PAGE，SDS-PAGE采用12.5％(g/ml)分離膠，考馬斯亮藍R250染色，結(jié)果如圖4中泳道2所示。
3、QAE Sephadex A-25離子交換層析用磷酸緩沖液(20mmol/L，pH 6.4)平衡QAE Sephadex A-25陰離子柱(離子交換基團為-CH2CH2N+(CH2COHCH3)(CH2CH3)2，購于Pharmacia公司)，將步驟2透析后的峰A1樣品過平衡后QAE Sephadex A-25離子柱，用磷酸緩沖液(20mmol/L，pH 6.4)洗去未結(jié)合蛋白，然后用含50mmol/L NaCl的磷酸緩沖液(20mmol/L，pH 6.4)過柱洗滌雜蛋白，再用含400mmol/L NaCl的磷酸緩沖液(20mmol/L，pH 6.4)洗脫結(jié)合蛋白，自上樣出峰(圖2中Q3和Q4峰)開始收集至A280≤0.04。QAE Sephadex A-25檢測A280繪出層析曲線如圖2所示，圖2中Q1為未吸附蛋白峰；Q2為含50mmol/L NaCl的磷酸緩沖液洗脫峰；Q3和Q4為含400mmol/L NaCl的磷酸緩沖液洗脫峰，蛋白的精確定量采用Lowry方法(同步驟1)以牛血清蛋白為標準，用步驟1所述方法測定核糖核酸酶的比活，蛋白量檢測及酶活檢測結(jié)果如表1所示，表明Q4峰值處有最高酶活為41.18U/mg。收集Q3和Q4處樣品，進行SDS-PAGE，SDS-PAGE采用12.5％(g/ml)分離膠，考馬斯亮藍R250染色，結(jié)果如圖4中泳道3所示，將Q3和Q4洗脫峰進行超濾(截留分子量為10kDa，Stirred Cell Model 8050，Millipore)至1ml。
4、Sephadex G50凝膠層析用檸檬酸—磷酸緩沖液(10mmol/L檸檬酸、20mmol/L Na2HPO4·12H2O，pH 6.2)平衡的Sephadex G50凝膠柱(購于Pharmacia公司)，然后將步驟3經(jīng)超濾后的收集的Q3和Q4樣品(1mL)上柱Sephadex G50，用檸檬酸—磷酸緩沖液(10mmol/L檸檬酸、20mmol/L Na2HPO4·12H2O，pH 6.2)洗脫，控制流速為5mL/h，自出峰后收集至A280≤0.02，檢測A280繪出層析曲線如圖3所示。收集各峰洗脫液，采用Lowry方法(同步驟1)對蛋白的精確定量，以牛血清蛋白為標準，用步驟1所述方法測定核糖核酸酶的比活，蛋白量檢測及酶活檢測結(jié)果如表1所示，表明圖3所示的G1峰值處核糖核酸酶比活為7.78U/mg，圖3所示的G2峰值處為74.11U/mg，收集G2峰洗脫液，進行SDS-PAGE電泳，SDS-PAGE采用12.5％(g/ml)分離膠，考馬斯亮藍R250染色，結(jié)果表明G2處AmPR-10達到電泳純，純化電泳如圖4中泳道4所示，將該純化的蛋白，命名為AmPR-10。糖蛋白染色采用高碘酸-西佛氏(PAS)方法，結(jié)果如圖4中泳道5所示，表明AmPR-10為糖蛋白。
經(jīng)過上述步驟2、3、4三步分離純化得到電泳純AmPR-10，從10g黃芪中可以得到4.19mg純蛋白(表1)。圖4為各步純化后SDS-PAGE；其中，泳道M標準蛋白分子量標準；泳道1粗提液；泳道2步驟2中Zn-Agarose-4B層析收集樣品；泳道3步驟3中QAE Sephadex A-25離子層析收集樣品；泳道4步驟4中Sephadex G50凝膠過濾層析收集樣品；泳道5步驟4中純化的AmPR-10糖蛋白染色。
表1.AmPR-10純化過程中蛋白活力

5、AmPR-10理化性質(zhì)的測定1)分子量的測定采用12.5％(g/ml)的分離膠進行SDS-PAGE，測得AmPR-10亞基的分子量為17.2kDa。采用凝膠過濾Superdex 75層析法測定AmPR-10蛋白的分子量，層析柱預(yù)先用檸檬酸-磷酸緩沖液(10mmol/L檸檬酸、20mmol/L Na2HPO4·12H2O，pH 6.2)平衡，分別將2g/L的藍色葡聚糖2000、牛血清蛋白(68.0kDa)、卵清蛋白(45.0kDa)、胰凝乳蛋白酶原A(25.7kDa)、細胞色素C(12.3kDa)和AmPR-10過Superdex 75層析柱(購于Pharmacia公司)，均用檸檬酸-磷酸緩沖液(10mmol/L檸檬酸、20mmol/LNa2HPO4·12H2O，pH 6.2)洗脫，流速為0.25mL/min，分別自各標準蛋白和樣品上樣開始收收集Superdex 75層析柱洗脫液，直至洗脫峰A280最高值處，測量出各標準蛋白和樣品洗脫液的體積，計算Ve/V0值(Ve，蛋白洗脫體積；V0，藍色葡聚糖2000洗脫體積)。用AmPR-10蛋白過Superdex 75凝膠層析柱上顯示單一峰，其Ve/V0＝1.39(Ve，蛋白洗脫體積；V0，藍色葡聚糖2000洗脫體積)。以Ve/V0為橫坐標，以分子量的對數(shù)值(Log值)為縱坐標做標準曲線(圖5)，根據(jù)曲線公式y(tǒng)＝-1.6053x+3.6548，已知AmPR-10 Ve/V0＝1.39，求出AmPR-10分子量的對數(shù)值，再利用函數(shù)關(guān)系計算求出其分子量為32.6kDa(圖5)，由于電泳純AmPR-10在SDS-PAGE上顯示其為分子量為17.2kDa的單一蛋白帶，表明AmPR-10是由17.2kDa的亞基組成的同源二聚體。
圖5中，Ve為標準蛋白洗脫體積；V0為藍色葡聚糖2000洗脫體積；圖5中標準蛋白牛血清蛋白(68.0kDa)；卵清蛋白(45.0kDa)；胰凝乳蛋白酶原A(25.7kDa)；細胞色素C(12.3kDa)均用△表示；AmPR-10用■表示，縱坐標中MW表示物質(zhì)的分子量。
2)AmPR-10糖蛋白中糖含量和組成的測定將AmPR-10糖蛋白水解，水解條件為0.4mL AmPR-10水溶液(蛋白濃度為3.6mg/mL)中加入0.1mL三氟乙酸，置于沸水浴煮沸2小時，取出水解樣品在真空干燥器中將三氟乙酸完全揮發(fā)掉后將樣品溶解在0.2mL二蒸水中。
AmPR-10總糖含量測定采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標準。具體步驟如下所述在試管中加入0.1mL 5％苯酚溶液、0.1mL樣品和0.5mL濃硫酸，立即混勻，置于沸水浴中煮15min，冷卻至室溫后在490nm處測定吸光值。檢測結(jié)果表明每1mgAmPR-10蛋白中含糖量為0.137mg，即13.7％。
AmPR-10糖組分分析采用離子交換色譜法(HPAEC)，將水解樣品10μL上樣于色譜儀(Dionex BioLC system Model 2500，USA)，固定相為PA10色譜柱(DionexCorp.)，流動相為0.05mmol/L NaOH，流速為1.0mL/min。色譜分析結(jié)果表明，其中阿拉伯糖73.0％，葡萄糖15.0％，其余為微量的果糖和一種未知糖。
3)一些金屬離子和試劑對AmPR-10核糖核酸酶活力的影響的測定在100μL AmPR-10中加入不同的金屬離子和試劑，使其終濃度為1mmol/L，40℃保溫30min后加入含200μg酵母tRNA 400μL MES緩沖液(100mmol/L，pH 6.0)，在56℃保溫30分鐘后加入預(yù)冷的4mol/L LiCl 1mL，在冰水浴放置3小時后10000rpm冷凍離心20分鐘，取上清液1mL加入二蒸水2mL測定A260。酶活定義同步驟1所述。以不加入任何金屬離子的酶活為100％。結(jié)果如表2所示，表明AmPR-10對小分子有機物SDS和金屬離子Cu2+，Ag+敏感。
表2一些金屬離子和試劑對AmPR-10核糖核酸酶活力的影響

4)N末端序列分析蛋白經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移到醋酸纖維膜上，采用Edman降解法，PROCISE氨基酸測序儀(Applied Biosystem，USA)分析其N-末端氨基酸序列。
Edman降解法測出純蛋白的N末端15個氨基酸序列為GVISFNEETISTVAP，將其與數(shù)據(jù)庫中其它PR-10蛋白的N末端15個氨基酸序列對比表明AmPR-10為一種新的PR-10蛋白，與黃羽扇豆L1PR-10.1C同源性最高為80％(表3)。
表3AmPR-10與其它蛋白的N-末端15個氨基酸殘基同源性比較

注下劃線表明氨基酸相同。
序列表<160>1<210>1<211>15<212>PRT<213>蒙古黃芪(Astragalus mongholicus Bunge)<400>1Gly Val Ile Ser Phe Asn Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Ala Pro1 5 10 1權(quán)利要求
1.一種具有核糖核酸酶活性的蛋白，其凝膠過濾層析測得的分子量為32.6kDa，SDS-PAGE測得的亞基分子量為17.2kDa，總糖的質(zhì)量百分含量為13.7％，其N末端15個氨基酸的序列為序列表中序列1；所述總糖中含有質(zhì)量百分含量為73％的阿拉伯糖和質(zhì)量百分含量為15％的葡萄糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，其特征在于所述具有核糖核酸酶活性的蛋白，是按照包括下述步驟的方法制備1)制備pH為5.2-8.2黃芪植株的總蛋白提取液；2)將步驟1)得到的總蛋白提取液進行金屬離子螯合層析，用pH為6.0-8.0磷酸緩沖液洗脫，收集洗脫液，得到未結(jié)合蛋白峰洗脫液；3)將步驟2)得到的未結(jié)合蛋白峰洗脫液過陰離子交換層析柱，先用pH為5.4-7.4磷酸緩沖液洗去未結(jié)合蛋白，用含30～60mmol/L NaCl的磷酸緩沖液洗滌雜蛋白，再用含300～500mmol/L NaCl的磷酸緩沖液洗脫結(jié)合蛋白，收集洗脫峰；4)步驟3)得到的洗脫液用濕球粒度范圍101-303μm，分子量分離范圍為1.5kDa-30kDa的凝膠層析柱分離，用pH為5.2-8.2檸檬酸-磷酸緩沖液洗脫，收集核糖核酸酶比活為74.11U/mg的洗脫峰，得到具有核糖核酸酶活性的蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋白，其特征在于所述步驟1)中總蛋白提取液是將黃芪粉碎，加入pH為5.2-8.2磷酸緩沖液，在4-20℃下攪拌提取8-12小時，過濾提取液，將濾液離心收集上清液得到的；所述步驟1)中黃芪與磷酸緩沖液的重量比為1∶4～10，所述磷酸緩沖液的濃度為20mmol/L，pH值為7.2；所述步驟2)中的磷酸緩沖液的濃度為20mmol/L，pH值為7.0；所述步驟3)中的磷酸緩沖液的濃度為20mmol/L，pH值為6.4；所述洗滌雜蛋白的緩沖液的NaCl濃度為50mmol/L；所述洗脫結(jié)合蛋白緩沖液的NaCl濃度為400mmol/L；所述步驟4)中所用凝膠層析柱為Sephadex G50凝膠層析柱；所述檸檬酸-磷酸緩沖液為含10mmol/L檸檬酸、20mmol/LNa2HPO4·12H2O，pH為6.2的溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白，其特征在于所述具有核糖核酸酶活性的蛋白的制備步驟中還包括將步驟1)和2)中得到的樣品進行透析，將步驟2)和3)收集的洗脫液樣品進行超濾，所述超濾的截留分子量為10kDa。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一所述的蛋白，其特征在于所述黃芪為蒙古黃芪、膜莢黃芪或多序巖黃芪。
6.一種制備具有核糖核酸酶活性的蛋白的方法，包括下述步驟1)制備pH為5.2-8.2黃芪植株的總蛋白提取液；2)將步驟1)得到的總蛋白提取液進行金屬離子螯合層析，用pH為6.0-8.0磷酸緩沖液洗脫，收集洗脫液，得到未結(jié)合蛋白峰洗脫液；3)將步驟2)得到的未結(jié)合蛋白峰洗脫液過陰離子交換層析柱，先用pH為5.4-7.4磷酸緩沖液洗去未結(jié)合蛋白，用含30～60mmol/L NaCl的磷酸緩沖液洗滌雜蛋白，再用含300～500mmol/L NaCl的磷酸緩沖液洗脫結(jié)合蛋白，收集洗脫峰；4)步驟3)得到的洗脫液用濕球粒度范圍101-303μm，分離范圍為1.5kDa-30kDa的凝膠層析柱分離，用pH為5.2-8.2檸檬酸-磷酸緩沖液洗脫，收集核糖核酸酶比活為74.11U/mg的洗脫峰，得到具有核糖核酸酶活性的蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述步驟1)中總蛋白提取液是將黃芪粉碎成黃芪粗粉，加入pH為5.2-8.2磷酸緩沖液，在4-20℃下攪拌提取8-12小時，過濾提取液，將濾液離心收集上清液得到的。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述步驟1)中總蛋白提取液是將黃芪粉碎，加入pH為5.2-8.2磷酸緩沖液，在4-20℃下攪拌提取8-12小時，過濾提取液，將濾液離心收集上清液得到的；所述步驟1)中黃芪與磷酸緩沖液的重量比為1∶4～10，所述磷酸緩沖液的濃度為20mmol/L，pH值為7.2；所述步驟2)中的磷酸緩沖液的濃度為20mmol/L，pH值為7.0；所述步驟3)中的磷酸緩沖液的濃度為20mmol/L，pH值為6.4；所述洗滌雜蛋白的緩沖液的NaCl濃度為50mmol/L；所述洗脫結(jié)合蛋白緩沖液的NaCl濃度為400mmol/L；所述步驟4)中所用凝膠層析柱為Sephadex G50凝膠層析柱；所述檸檬酸-磷酸緩沖液為含10mmol/L檸檬酸、20mmol/LNa2HPO4·12H2O，pH為6.2的溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述具有核糖核酸酶活性的蛋白的制備步驟中還包括將步驟1)和2)中得到的樣品進行透析，將步驟2)和3)收集的洗脫液樣品進行超濾，所述超濾的截留分子量為10kDa。
10.根據(jù)權(quán)利要求6-9中任一所述的方法，其特征在于所述黃芪為蒙古黃芪、膜莢黃芪或多序巖黃芪。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有核糖核酸酶活性的蛋白及其制備方法。該蛋白，其凝膠過濾層析測得的分子量為32.6kDa，SDS－PAGE測得的亞基分子量17.2kDa，總糖的質(zhì)量百分含量為13.7％，其N末端15個氨基酸的序列為序列表中序列1；所述總糖中含有質(zhì)量百分含量為73％的阿拉伯糖和質(zhì)量百分含量為15％的葡萄糖。本發(fā)明的具有核糖核酸酶活性蛋白，其核糖核酸酶的比活達74.11U/mg。
文檔編號C12N9/22GK1928079SQ200610113358
公開日2007年3月14日 申請日期2006年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月25日
發(fā)明者閆巧娟, 江正強, 齊笑瑋, 韓魯佳 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)